Tecnología ifunnel para LC/MS una sensibilidad mejorada en Tándem
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- Miguel Romero Guzmán
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1 Tecnología ifunnel para LC/MS una sensibilidad mejorada en Tándem Ahora disponible en el Nuevo sistema Agilent 649 de triple cuadrupolo LC/MS Información general técnica Autores Paul Momoh, Anabel Fandino, Ed Aisawa, Tim Schlabach, Ken Miller y George Stafford Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA EE. UU. El sistema Agilent LC 19 Infinity y el nuevo sistema LC/MS Agilent 649 de triple cuadrupolo con tecnología ifunnel Resumen Se ha comprobado que la ionización por impacto electrónico (ESI, del inglés electrospray ionization) es sólida y ampliamente aplicable para el análisis de muchos tipos de compuestos químicos. Los investigadores han documentado que normalmente menos del 1% de los iones analitos producidos por ESI entran en el espectrómetro de masas y solo uno de entre 1 3 y 1 5 desencadena una respuesta a la señal en el detector MS 1. Este hecho limita en gran medida la sensibilidad de los sistemas LC/MS. La nueva tecnología ifunnel de Agilent combina la alta generación y el enfoque de iones ESI de la tecnología Agilent Jet Stream de con un conjunto de capilares de muestreo con seis orificios, lo que permite que una mayor fracción de las columnas de gases de ESI entren en la óptica iónica del espectrómetro de masas. Un embudo único de dos fases permite un incremento de la transmisión iónica, al mismo tiempo que se evacua una mayor cantidad de gas. Este diseño innovador reduce la contaminación y la neutraliza para mejorar todo el sistema en general y reducir el ruido. Este resumen técnico pone de manifiesto la tecnología ifunnel en el nuevo sistema LC/MS 649 de triple cuadrupolo permitiendo por primera vez una sensibilidad a nivel de zeptomoles (1-1 moles) en un espectrómetro de masas en tándem basado en cuadrupolos a caudales de flujo convencionales.
2 Tecnología Agilent Jet Stream En el diseño del nuevo sistema LC/MS 649 de triple cuadrupolo, Agilent ha adoptado un enfoque dedicado íntegramente a mejorar la sensibilidad, prestando especial atención a la formación de iones en fase gaseosa y su posterior transmisión al espectrómetro de masas, mejorando así también de la eficiencia en la transferencia iónica y la reducción de ruido en el sistema. Las fotografías de la región de la columna donde se produce la ionización por impacto electrónico revelan al menos dos razones por las cuales muchos iones analitos se pierden durante el proceso de ESI a presión atmosférica: a) los analitos quedan retenidos en gotas nebulosas de espuma debido a una desolvatación insuficiente y b) muchas gotas e iones desolvatados se alejan del orificio de entrada del espectrómetro de masas, los iones están contenidos en gas atmosférico, por lo tanto no es posible capturarlos todos utilizando sólo un campo electrostático. La tecnología centrada en el gradiente termal de Agilent Jet Stream (AJS) ayuda a superar ambos problemas y a mejorar el muestreo por ESI x1 atmosférica. La tecnología AJS utiliza el calor para desolvatar de forma efectiva las gotas que se crean durante la nebulización en la fuente de iones. Un preciso pulverizador micromecanizado rodea las gotas con una cubierta de gas supercalentado originando dinámicas de flujo con iones concentrados en una zona de confinamiento termal bien determinada para un muestreo efectivo del espectrómetro de masas. Por medio de un gas de flujo rápido calentado a una temperatura superior a 4 C se confina la zona rica en iones en una región con una superficie de aproximadamente un quinto de la columna de gas producida por la fuente estándar de ESI. El proceso de confinamiento del gas se muestra en la Figura 1 que compara la columna estándar de ESI con una columna más pequeña de AJS. La alta temperatura se concentra en la cubierta gaseosa y produce gotas sustancialmente más pequeñas. Comparando las señales producidas por ESI o AJS se ponen de manifiesto que las intensidades de la señal son mucho mayores con la concentración termal, tal y como se muestra en la Figura. - MRM (31. -> 15.) Figura 1. Proceso de confinamiento del gas de Agilent Jet Stream Verde = ESI estándar Naranja = Agilent Jet Stream Con la tecnología Agilent Jet Stream Figura. Comparación de la intensidad de MRM para cloranfenicol añadido a agua potable analizada en modo iónico negativo. El volumen inyectado fue de 5 μl de una solución de 5 ppb. Cloranfenicol 1,1 1,5 Con ESI estándar Recuentos frente a tiempo de adquisición (min)
3 Capilares de muestreo con seis orificios A pesar de estas ganancias en la sensibilidad, una experimentación posterior ha revelado que el espectrómetro de masas no puede capturar muchos de los iones formados en la columna colimada. Los experimentos se llevaron a cabo variando la posición lateral de la columna de AJS delante de la entrada capilar del espectrómetro. Los datos de la Figura 3 muestran que la zona de máxima generación iónica se da en una región horizontal de unos 3-5 mm en el centro de la columna. El muestreo de los iones se realiza normalmente por una entrada capilar al sistema del espectrómetro de masas. Los capilares estándar de Agilent tienen un diámetro interno de 6 µm. Un mayor muestreo iónico sería posible aumentando el área de interfase de la entrada capilar en la zona de confinamiento termal iónico. Los sistemas anteriores de espectrómetros de masas han intentado aumentar la sensibilidad simplemente mediante el aumento del diámetro de una de las entradas. No es de extrañar que estas propuestas hayan mostrado pocos resultados positivos ya que no mejoran significativamente el muestreo de iones de forma eficiente, la mayoría de los iones no son especialmente accesibles y no se transmiten al espectrómetro. Para capilares de diámetro mayor, las dinámicas del gas cambian de un flujo aerodinámico favorable a un flujo turbulento, produciendo la pérdida de iones. (Además, el gas cargado en el espectrómetro de masas aumenta proporcionalmente al diámetro capilar hasta la 4º potencia, lo que significa que incluso los aumentos nominales de diámetro crean un aumento de la carga de gas atmosférico y una necesidad de nuevos sistemas de aspiración más amplios). Intensidad normalizada 1,5-6,5-5,5-4,5-3,5 Figura 3. Intensidades iónicas normalizadas mientras la columna de gas de AJS se aleja lateralmente del centro. La intensidad iónica de mayor grado tiene lugar en una banda de unos 3-5 mm de ancho delante del capilar de muestreo. La opción alternativa es utilizar múltiples capilares expandidos por la zona central rica en iones de la zona de confinamiento termal. Se ha comprobado que el empleo de múltiples capilares aumenta la eficiencia del muestreo iónico y mantiene un buen rendimiento del proceso de desolvatación. Para la serie 649 de triple cuadrupolo se eligió una disposición circular de seis capilares, como se muestra en la Figura 4. Los capilares abarcan una distancia horizontal de 3 mm y proporcionan una interfase de muestreo de alto rendimiento para los iones en fase gaseosa en la zona de confinamiento termal de AJS. Con el proceso ESI también se obtienen resultados positivos, pero las ganancias son mucho más significativas en la zona de concentración iónica creada por AJS. Distribución de la intensidad -,5-1,5 -,5,5 1,5,5 3,5 4,5 5,5 Distancia (mm) Además de aumentar el número de capilares, se acortó la longitud de los capilares un 5% para disminuir la resistencia de circulación del gas por el capilar, minimizar la pérdida de movilidad de los iones, y por tanto mejorar el muestreo atmosférico. El aumento del número de capilares aumenta la carga de gas en el espectrómetro de masas en una proporción lineal con respecto al número de capilares. El capilar de un único orificio de la serie Agilent 646 de triple cuadrupolo conduce unos l/min de gas atmosférico. Los capilares de muestreo con seis orificios pueden conducir unos 3 l/min. De esta forma pueden ser muestreados muchos más iones de la zona de confinamiento termal de AJS, pero ahora es necesario separarlos de un gran volumen de gas. Figura 4. Conjunto de capilares de muestreo con seis orificios y placa de orificio. Los capilares de muestreo con seis orificios abarcan la zona de confinamiento termal de AJS para permitir un muestreo de iones mucho mayor. 4 C 3 C C 1 C 33 C 3
4 Embudo doble para iones Este problema se ha solucionado añadiendo un sistema de embudo para iones un elemento de óptica iónica que puede utilizarse capa capturar de forma eficaz y confinar iones altamente dispersos así como dirigir el flujo de iones en las fases iniciales del sistema del espectrómetro de masas, que están sometidos a altas cargas de gas. Se seleccionó un embudo doble para iones. Este dispositivo extrae el gas en dos fases, como se muestra en la Figura 5. El embudo inicial funciona a alta presión y se bombea por medio de un potente sistema de aspiración al vacío, mientras que los voltajes del embudo y el RF impulsan los iones adelante, y centran sus trayectorias para alinearse con la entrada del segundo embudo de baja presión. (Téngase en cuenta que el primer embudo está desplazado con respecto al capilar y la entrada del segundo embudo para evitar que especies neutras entren en el flujo de la óptica iónica.) El proceso se repite con un segundo embudo para iones de baja presión. Una cantidad reducida de gas emerge del segundo embudo comparada con un conjunto óptico estándar de espumadera/q y reduce la carga en la bomba turbo, mejorando el rendimiento del servicio. La capacidad de concentración termal de AJS colima la columna de gas producida por ESI de forma que se puedan capturar más iones por el conjunto de capilares. El conjunto de capilares de muestreo con seis orificios captura un mayor ángulo sólido de la columna de gas y trabaja conjuntamente con el embudo doble para iones, que separa el gas y los neutrales de los iones. El resultado combinado de los tres elementos de la tecnología ifunnel supone una drástica mejora de la sensibilidad. La tecnología ifunnel combina la tecnología Jet Stream con un conjunto de capilares de muestreo con seis orificios y un embudo doble para iones aumentando el muestreo de iones y la transmisión desde la columna de gas de AJS en la óptica iónica de la serie 649. Capilares de muestreo con seis orificios Embudo de alta presión Embudo de baja presión Figura 5. El conjunto de embudo doble extrae gas atmosférico y especies neutras, y enfoca y dirige los iones en la óptica de baja presión de la serie LC/MS Agilent 649 de triple cuadrupolo. 4
5 Ganancias en la sensibilidad con la tecnología ifunnel de la serie 649 de triple cuadrupolo La nueva serie 649 de triple cuadrupolo con tecnología ifunnel muestra una ganancia diez veces mayor en señal a ruido para alprazolam relativo a la serie 646 de triple cuadrupolo con AJS y un único capilar de muestreo (Figura 6). Con la nueva serie 649 de triple cuadrupolo se han observado ganancias significativas en la sensibilidad para muchos compuestos en iones tanto positivos como negativos. Ganancias en la sensibilidad con la tecnología ifunnel a través del espectro de masas como se muestra en la Figura 7. La ganancia media es unas x A S/N Recuentos frente a tiempo de adquisición (min) seis veces superior en comparación al modo positivo de ESI. Normalmente, estas ganancias se corresponden con todo el rango de masa de la serie 649 de triple cuadrupolo. x1 3 Figura 6. Alprazolam, 1 pg en columna A. 646 estándar con Agilent Jet Stream: S/N = 1.157:1 B. Nueva serie 649 con tecnología ifunnel: S/N = 11.64:1 1 B S/N Recuentos frente a tiempo de adquisición (min) Los aumentos de la intensidad iónica son incluso más pronunciados para iones negativos como se muestra en la Figura 8. La ganancia media en la intensidad de la señal fue diez veces mayor en el rango de masas de la serie 649 de triple cuadrupolo. 3x1 6 Serie 649 con tecnología ifunnel 7x 7x 5x1 6 4x con Agilent Jet Stream 11x x1 6 7x 5x 3x1 6 14x 7x 5x x1 6 1x 1x1 6 1x1 6 1x Recuento 5x1 5 Serie 649 con tecnología ifunnel 6 Recuento 4x con Agilent Jet Stream x x1 5 3x1 5 x x x1 5 1x m/z Figura 7. Las intensidades de la señal para niveles estándar de calibración en ESI positiva para la serie 649 de triple cuadrupolo (parte superior) y la serie 646 de triple cuadrupolo (inferior) muestran aumentos a través de un amplio rango de masas m/z Figura 8. Las intensidades de la señal para niveles estándar de calibración en ESI negativa para la serie 649 de triple cuadrupolo (parte superior) y la serie 646 de triple cuadrupolo (inferior) muestran aumentos a través de un amplio rango de masas.
6 Las espectaculares ganancias en la intensidad de la señal conseguidas con la tecnología ifunnel se traducen en una mejora significativa de los límites de detección. La inyección de tan sólo 1 atogramos de verapamil en la columna produce una respuesta que se distingue claramente del ruido (Figura 9). El límite de detección en este caso es de aproximadamente 1 zeptomoles de verapamil. Las muestras en matrices complejas como plasma y orina representan un mayor desafío analítico. Una solución para aumentar la especificidad en el bioanálisis es reducir la ventana de aislamiento del ión precursor para excluir potenciales interferencias químicas. Esto se muestra en la Figura 1 para el análisis de,5 fg de propionato de fluticasona en plasma. El límite de la detección (LOD, del inglés limit of detection) con la ventana de masa estrecha (,4 m/z) es dos veces mayor que con una resolución más baja (,7 m/z) debido a una disminución considerable del ruido químico. El LOD a,4 m/z es de alrededor 1 fg. x1 1 7 Recuentos x1 1 4,5 4,4 4,3 4,,1,,3,4,5,6,7,8.9,9 Tiempo de adquisición (min) Figura 9. 1 atogramos de verapamil, en la columna, analizados con la nueva serie 649 de triple cuadrupolo. Q1 Unidad (,7 m/z) Q Unidad (,7 m/z) 6 Q1 Mejorada (,4 m/z) Q Unidad (,7 m/z) 5 4,,4,6,8 1 1, 1,4 1,6 1,8,,4 Recuentos frente a tiempo de adquisición (min) Figura 1.,5 fg de propionato de fluticasona de una muestra de plasma. Datos de MRM utilizando una resolución de aislamiento precursora de,7 m/z (rojo) y,4 m/z (azul). Un aislamiento más estrecho reduce la señal no específica y mejora los límites de detección. 6
7 Resumen Nueva serie 649 de triple cuadrupolo con tecnología ifunnel Ganancias importantes y estables en la sensibilidad en tándem LC/MS Mejoras drásticas en la sensibilidad de iones tanto positivos como negativos Diseños robustos resistentes a la contaminación Rango dinámico lineal de hasta 6 niveles de magnitud Resolución Q1 de,4 m/z para un aislamiento precursor mejorado Los límites de detección en zeptomoles para algunos compuestos Límites de detección en atogramos para compuestos en matrices Referencias 1. J. S. Page, R. T. Kelly, K. Tang, R. D. Smith, Ionization and transmission efficiency in an electrospray ionization-mass spectrometry interface, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 18: , 7. 7
8 Este artículo está indicado para el uso en investigaciones únicamente. No está indicado para su uso en procedimientos de diagnóstico. Agilent Technologies no se responsabiliza de los errores contenidos en este manual o de los daños ocasionales relativos al suministro, prestaciones o uso de este material. Agilent Technologies, Inc. 1 Impreso en los EE. UU. el 1 de mayo de ES
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