Seminario 14 MODELOS DE INFECCIONES PERSISTENTES Virus hepatitis B Virus herpes simplex

Transcripción

1 Departamento de Microbiología, Parasitología e Inmunología Microbiología I Cátedra 1. Microbiología y Parasitología Área de Virología Seminario 14 MODELOS DE INFECCIONES PERSISTENTES Virus hepatitis B Virus herpes simplex

2 OBJETIVOS 1. Conocer las relaciones entre estructura y función de algunos virus que promueven infecciones persistentes: HBV y HSV. 2. Conocer sus vías de transmisión y estrategias de replicación viral. 3. Analizar los mecanismos inmunopatogénicos de lesión. 4. Conocer los mecanismos de latencia y cronicidad de las infecciones persistentes.

3 VIRUS HEPATITIS B

4 VIRUS HEPATITIS B Horizontal Sexual Parenteral Vertical Perinatal Congénita

5 ESTRUCTURA DE LA PARTÍCULA VIRAL Nucleocápside (HBcAg) Envoltura ADN pdc ADN polimerasa X S-HBsAg (Domino S) M- HBsAg (Pre-S2+S) L- HBsAg (Pre-S1+Pre-S2+S) Partículas de Dane Partículas esféricas Pre-S1 Pre-S2 S Partículas filamentosas

6 ESTRUCTURA DEL GENOMA DE HBV Proteína L Proteína M Proteína S ADNpdc ATG ATG traducción core traducción precore clivaje

7 REPLICACIÓN DEL GENOMA DE HBV

8 REPLICACIÓN DEL HBV Taurocolato de sodio Carballal-Oubiña., Virología Médica. 2015

9 GENOTIPOS E IMPLICANCIAS MÉDICAS GENOTIPO A B C D E F G H (I-J)? IMPORTANCIA MÉDICA Frecuentemente asociado a cronicidad (mas que D y F), pero con mejor pronóstico, por remisión bioquímica sostenida Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es intermedia Remisión bioquímica sostenida más probable después de la seroconversión HBeAg-antiHBe que el genotipo C. Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy tardía Curso más agresivo. Alta tasa de CHC y cirrosis Seroconversión HBeAg/anti-HBe (a muy tardía edad) es predictiva de reactivación Frecuentemente asociada con mutante en PreCore (codón STOP) Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy tardía Niños inmunizados desarrollan infecciones con cepas mutantes y salvajes: Gambia (1999 y 2008) y Argentina (2007) Edad de seroconversión HBeAg/anti-HBe es muy temprana Mediana de edad de Dx de CHC menor que con A-D. (22,5 vs 60 años) en nativos de Alaska sin asociación con mutaciones en el BCP Incapaz de sintetizar HBeAg.

10 TIPO DE INFECCIÓN POR HBV INFECCIÓN CRÓNICA RECIÉN NACIDOS Aguda (2%) Crónica (~98%) ADULTOS Aguda (90-99%) Crónica (1-10%) Hepatitis B crónica 2-6 % HBeAg (+) 8-10 % HBeAg (-) Cirrosis compensada 3-5 % Cirrosis descompensada < 0,1 % 2-3 % 7-8 % Estado de portador inactivo / Fase de baja replicación viral < 0,2 % Hepatocarcinoma celular % % Muerte

11 INFECCIÓN AGUDA POR HBV (I) Síntomas T I T U L O Semanas post-exposición

12 Incremento en suero (% del valor máximo) INFECCIÓN AGUDA POR HBV (II) anti-hbc HBe Ag HBs Ag anti-hbe anti-bs DNA de HBV ALT Tiempo post-infección (meses) 7 8 Fase de Incubación Enfermedad aguda Recuperación De Virología Médica Carballal & Oubiña, 2015

13 TÍTULO INFECCIÓN CRÓNICA POR HBV (I) Hepatitis B que evoluciona a la cronicidad Curso serológico habitual Fase Aguda Fase Crónica Semanas post-exposición Años

14 INFECCIÓN CRÓNICA POR HBV (II) anti-hbc HBe Ag anti-hbe HBs Ag Incremento en suero (% del valor máximo) DNA de HBV Tiempo post-infección (años) 50 Inmunotolerancia Fase inmunorreactiva Fase de baja replicación ALT Fase de alta replicación De Virología Médica Carballal & Oubiña, 2015

15 Infección crónica Infección aguda MARCADORES SÉRICOS Estadío HBs Ag Anti-HBs HBe Ag Anti-HBe Anti-HBc DNA HBV Temprana IgM + Período ventana /- IgM +/- Recuperación IgG +/- Estado activo IgG-IgM 1 >10 5 copias/ml Estado inactivo IgG <10 5 copias/ml Reactivación + - +/- - IgG-IgM >10 5 copias/ml Con variante HBe Ag-minus IgG >10 5 copias/ml Oculta - +/- - +/- +/- + Vacunado Infección pasada IgG - 1 Se pueden llegar a detectar bajos niveles de IgM. 2 El HBs Ag podría llegarse a detectar en forma transitoria en suero en las primeras 24 horas de haber recibido la vacuna.

16 Infección crónica Infección aguda MARCADORES SÉRICOS Estadío HBs Ag Anti-HBs HBe Ag Anti-HBe Anti-HBc DNA HBV Temprana IgM + Período ventana /- IgM +/- Recuperación IgG +/- Estado activo IgG-IgM 1 >10 5 copias/ml Estado inactivo IgG <10 5 copias/ml Reactivación + - +/- - IgG-IgM >10 5 copias/ml Con variante HBe Ag-minus IgG >10 5 copias/ml Infección oculta: Individuos HBs Ag (-) con o sin marcadores serológicos de previa infección por HBV (anti- HBs y/o anti-hbc) con DNA HBV detectable en suero o tejido hepático. Oculta - +/- - +/- +/- + Vacunado Infección pasada IgG - 1 Se pueden llegar a detectar bajos niveles de IgM. 2 El HBs Ag podría llegarse a detectar en forma transitoria en suero en las primeras 24 horas de haber recibido la vacuna.

17 INMUNOPATOGÉNESIS De Virología Médica Carballal & Oubiña, 2015

18 RESPUESTA INMUNE ANTIVIRAL DEBIL OLIGOCLONAL VIGOROSA POLICLONAL MULTIESPECÍFICA AGUDA VIGOROSA POLICLONAL MULTIESPECÍFICA PERSISTENCIA DEBIL OLIGOCLONAL De Virología Médica Carballal & Oubiña, 2015

19 DETERMINANTES VIRALES QUE FAVORECEN LA PERSISTENCIA ALTA TASA DE MUTACIONES Mutaciones en el HBsAg que impiden la unión de anticuerpos anti-hbs previos ESCAPE A LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL Mutaciones en los epítopes para linfocitos T ESCAPE A LA RESPUESTA INMUNE CELULAR

20 DETERMINANTES VIRALES QUE FAVORECEN LA PERSISTENCIA HBV con síntesis de HBeAg ATG ATG traducción core traducción precore HBcAg en el virión clivaje HBeAg soluble Mutantes de precore sin síntesis de HBeAg ATG TAG ATG trad- traducción core HBcAg en el virión Sin producción de HBeAg

21 MUTANTES DE PRE-CORE Mutantes HBeAg (-) ATG TAG ATG traducción core Sin producción de HBeAg trad- HEPATITIS FULMINANTE Depósito de anticuerpos anti-hbc sintetizados in situ Mutantes en el promotor basal del gen del core Aumento en la replicación viral Farci et al, PNAS 2010

22 DETERMINANTES VIRALES HBV CON SINTESIS DE HBeAg ATG ATG traducción core traducción precore clivaje HBcAg y HBeAg comparten epítopes para CD4 y CD8 HBeAg induce respuesta TH2 y produce depleción de TH1 específicas contra el HBcAg HBeAg atraviesa placenta y llega al timo PERSISTENCIA TOLERANCIA Infección crónica en recién nacidos ~98 %

23 PATOGÉNESIS DEL CHC Proteína X Altera el potencial de membrana mitocondrial Liberación de especies reactivas de oxígeno Aumento del Ca++ citosólico Cascada de señales Activación de factores de transcripción -Inhibición de la muerte celular -Proliferación -Transformación celular De Virología Médica Carballal & Oubiña, 2015

24 FACTORES DE RIESGO Factores asociados a un aumento del riesgo de progresión a la cirrosis Del hospedador Virales Ambientales Edad avanzada Sexo masculino Estado inmune Alta tasa de replicación viral Genotipo (C > B; F) Variantes del HBV (mutaciones en el promotor basal del core) F progresión frecuente a fibrosis Co-infección con HDV, HIV o HCV Consumo de alcohol Diabetes mellitus Obesidad Factores asociados con riesgo aumentado de progresión al HCC Del hospedador Virales Ambientales Edad avanzada Sexo masculino Cirrosis Historia familiar de HCC Etnia (asiáticos, africanos) Alta tasa de replicación viral Genotipo (C > B; F) F progresión más rápida Variantes de HBV (mutaciones en el promotor basal del core) Efecto transactivador de X sobre genes celulares Co-infección con HDV, HIV o HCV Consumo de alcohol Diabetes mellitus Obesidad Tabaquismo

25 PATOGÉNESIS DE LAS MANIFESTACIONES EXTRA- HEPÁTICAS Inmunocomplejos Circulantes Deposición de inmunocomplejos en vasos sanguíneos, glomérulos y sinovia Reclutamiento mediado por complemento y receptor Fc; activación de células inflamatorias HBsAg Vasculitis y poliarteritis nodosa Glomerulonefritis HBsAg Gránulos neutrofílicos, enzimas, intermediarios reactivos de oxígeno Artritis

26 VIRUS HERPES SIMPLEX Sanjuan, N. et al. Arch. Virol 91:329; 1986

27 FAMILIA HERPESVIRIDAE Subfamilia Virus Células blanco de la replicación productiva Células blanco de la latencia α HSV-1 Epitelial, queratinocito Neurona HSV-2 Epitelial, queratinocito Neurona VZV Epitelial, queratinocito, linfocito T, monocito, endotelial, Langerhans β HCMV Macrófago, dendrítica, endotelial, músculo liso, epitelial, fibroblasto Neurona Célula pluripotencial hematopoyética (Stem cell) CD34+, macrófago HHV-6 Linfocito T CD4 Célula pluripotencial hematopoyética (Stem cell) CD34+, macrófago HHV-7 Linfocito T CD4 Linfocito T CD4 ɣ EBV Linfocitos B, epitelial Linfocito B HHV-8 Linfocitos Linfocitos B Penkert and Kalejta Herpesviridae 2011, 2:3

28 FAMILIA HERPESVIRIDAE SIMILITUDES Morfología: ME (cápside, tegumento, envoltura) DIFERENCIAS Enfermedades producidas Estructura: grandes, envueltos, genoma DNA de doble cadena y extenso. Propiedades biológicas: DNA polimerasa viral, Síntesis DNA y ensamblado en núcleo Latencia Alteración de la respuesta inmune Infecciones líticas, persistentes latentes y eventualmente, los γ- transformantes Infecciones productivas con expresión génica en cascada (IE, E, L) En GENERAL las primo-infecciones ocurren en edades tempranas (ej: HSV, CMV, EBV, VZV) infecciones de alta prevalencia en la población general. Células blanco de infección productiva vs las de infección latente Infección productiva lisis celular (α) vs efectos no líticos (en otros) Estado genómico en la latencia (episomal vs proviral) Estrategias para el establecimiento y mantenimiento de la latencia Disponibilidad de vacunas y tratamiento antiviral específico

29 ESTRUCTURA DE LA PARTÍCULA VIRAL 150nm Nucleocápside Tegumento Envoltura ADN Envoltura Glicoproteína de superficie (gd) Glicoproteína de superficie (gb) Glicoproteína de superficie (gc) Glicoproteína de superficie (gh, gl) Cápside Glicoproteínas Tegumento ADNdc lineal en el virión (con extremos palindrómicos) y circular en el núcleo de la célula Cápside icosaédrica Tamaño genómico: kb Virus grandes: Codifican productos génicos

30 COMPARACIÓN DE GENOMAS VIRALES TODOS LINEALES Y CON SECUENCIAS PALINDRÓMICAS QUE HACEN QUE SE CIRCULARICEN DURANTE LA LATENCIA

31 VIRUS HERPES SIMPLEX Enfermedades: Encefalitis Encefaliti Queratitis Lesiones s muco-cutáneas Enfermedad diseminada en el paciente inmunocomprometido Entrada Salida Diseminación Entrada Salida Latencia Diseminación Latencia Enfermedad con aparición de lesiones recurrentes Herpes neonatal Entrada Entrada Salida Diseminación Latencia Medical Microbiology. 4th edition. Baron S. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; 1996.

32 HSV-1 y HSV-2 HSV-1 Adquirido habitualmente antes de los 6 años de edad HSV-2 Adquirido habitualmente luego de un contacto sexual 1) ~ 50% de homología. Son similares y no presentan diferencias funcionales conocidas. 2) Usualmente causan infecciones asintomáticas 3) Se diseminan por contacto directo (NO hay diseminación epidémica) 4) Permanecen en forma latente en cuerpos neuronales. 5) La respuesta inmune humoral específica no confiere protección cruzada

33 REPLICACIÓN DEL HSV α = inmediato tempranas: Paralizan el metabolismo celular y bloquean las defensas de la célula hospedadora β = tempranas. Timidino quinasa (TK), DNA polimerasa γ = tardías. Proteínas estructurales (cápside, tegumento, envoltura)

34 PATOGENESIS DEL HSV

35 PROGRESIÓN DE LA INFECCIÓN (I) Ubicación en el núcleo neuronal, donde el DNA viral se encuentra en estado episomal LATENCIA Progresión intra-axonal retrógrada Recurrencias periódicas ante estímulos inespecíficos Entrada por una terminal de un nervio periférico Ingreso en la mucosa por microtraumas y replicación en el epitelio

36 RESUMIENDO: ESTABLECIMIENTO, MANTENIMIENTO y REACTIVACIÓN Establecimiento Mantenimiento Reactivación ICP0: Favorece la transcripción del genoma Induce la degradación deproteínas involucradas en la represión del genoma.

37 ACTIVACIÓN DE HSV-1 VP16= TIF: Recluta factores de transcripción celulares y se une a promotores de genes IE Síntesis de proteínas (ICP0, ICP4, ICP22, ICP47) HCF En células neuronales está en citoplasma (podría fallar el transporte de VP16 al núcleo) VP16 HCF ZHANGFEI Oct-1 VP16 TAATGARAT Genes IE (ICP0) Citoplasma Núcleo Promotor Oct-1: Baja expresión en neuronas, pudiéndose expresar otras proteínas de la familia Oct que compiten con ésta (pero que no pueden interactuar con VP16)

38 LATENCIA (LAT-ICP0) LATs (transcriptos asociados a la latencia): no tienen polaridad de mensajero no están asociados a neurovirulencia, aunque sí inhiben la apoptosis neuronal. ICP0: transactivador promiscuo de toda clase de genes del HSV. IR L ARNm ICP0 LATs

39 ROL DE LA RESPUESTA CELULAR EN LA LATENCIA VP16 Genes IE (ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47) LATs Schiffer et al., Nature Medicine 19, (2013)

40 Control epigenético de la latencia y la reactivación

41 REACTIVACIÓN DEL HSV-1(I) Estímulos inespecíficos para la recurrencia: radiación solar, stress, menstruación, neurectomías, etc. La inmunodepresión NO es un estímulo imprescindible para la reactivación. NO hay necrosis neuronal en la reactivación ICP0 Genes IE Genes E Replicación ADN Genes L Virus La recurrencia ocurre a veces por los nervios sensoriales y llega a los lóbulos temporales produciendo una encefalitis herpética (causa más frecuente de encefalitis esporádica en adultos inmunocompetentes)

42 TUTORÍA Problema 1 Con el objetivo de dilucidar aspectos centrales de los mecanismos de patogenia del HBV se han llevado a cabo diversos estudios empleando animales como modelo experimental. En uno de estos, se utilizaron chimpancés que fueron infectados con el HBV por vía intravenosa. Al cabo de unas semanas post-inoculación, los primates desarrollaron un típico cuadro de hepatitis. Para analizar la cinética de replicación / eliminación viral y la cinética del desarrollo de la enfermedad, se obtuvieron muestras de sangre y biopsias hepáticas semanalmente a lo largo del curso de la infección. En la figura I se documentan las determinaciones realizadas. Figura I. Curso de la infección por HBV en chimpancés inoculados experimentalmente Determinación cuantitativa (carga viral por PCR) del DNA del HBV en hígado y análisis de la actividad de la alanina aminotransferasa (ALT) en suero. Análisis cualitativo del genoma viral (DNAccc e intermediarios replicativos) en hígado (Southern blot) y determinación de los niveles de RNA mensajero de IFNγ y CD3 en hígado.

43 Pregunta 1 En base a los resultados observados en la Figura I conteste VERDADERO o FALSO a. Tras la inoculación del HBV los chimpancés desarrollaron una infección crónica persistente. b. El HBV es un virus citopático per se ya que como consecuencia de la replicación viral se produce un daño directo en el hepatocito. c. La destrucción de los hepatocitos es responsable de la reducción temprana del genoma viral en hígado. d. Existe un control temprano No citolítico de la replicación del HBV, el cual está asociado a la acción del IFNγ. e. La injuria hepática es consecuencia de la respuesta de células T.

44 Para develar el rol de la respuesta de células T en la infección aguda por HBV, subsiguientemente se efectuaron más estudios utilizando el mismo modelo y procedimiento experimental. Para ello se monitoreó semanalmente el curso de la infección por HBV en primates inoculados, a los cuales se les indujo la depleción temporal de LT CD8+ o LT CD4+ mediante la administración de Acs monoclonales específicos anti-cd8 o anti-cd4 respectivamente. En la figura II se observa una parte de los resultados obtenidos. Mab anti-cd8 Semanas post-infección Semanas post-infección Figura II. Curso de la infección por HBV en chimpancés luego de la inoculación experimental y la depleción transitoria de LT CD8+. Determinación cuantitativa (carga viral por PCR) del DNA del HBV en hígado, análisis de la actividad de ALT en suero y recuento de LT CD3+ CD8+ en sangre periférica. Determinación de los niveles de RNA mensajero de IFNγ y CD3 en hígado. Respuesta intra-hepática de LT CD8+ específicos productores de IFNγ obtenidos de biopsias hepáticas. Respuesta intrahepática de LT CD8 + específicos Mab anti-cd8 NOTA: El curso de la infección por HBV en los chimpancés con depleción transitoria de LT CD4+ fue casi idéntico al de los chimpancés del problema anterior (Figura I). Semanas post-infección

45 Pregunta 2 Según los resultados obtenidos conteste VERDADERO o FALSO a. La respuesta de LT CD8+ es imprescindible para el control de la infección y la eliminación viral. b. Los LT CD8+ contribuyen en forma importante al control no citolítico de la replicación del HBV. c. Los LT CD8+ específicos son los responsables de la injuria hepática y la completa eliminación del DNA viral del hígado. d. La completa eliminación del genoma del HBV del hígado estuvo asociada a una respuesta de LT CD8+ monoespecíficos. Pregunta 3 Por qué mecanismos cree Ud. que el IFNγ promueve la eliminación viral del hepatocito?

46 Problema 2 Una paciente de 25 años consulta en la guardia por fiebre, cefalea, mialgias y disuria. En el examen físico se observa una erupción localizada cutánea en la zona genital, formada por vesículas con contenido líquido claro. Diagnóstico clínico: posible infección por virus herpes simplex (HSV) Seleccione la o las respuestas correctas: 1- Basados en el examen físico cree Ud. que se trataría de una infección por: a) Herpesvirus humano 2 (HSV-2) por contacto sexual b) Herpesvirus humano 1 (HSV-1) por contacto sexual c) Herpesvirus humano 1 (HSV-1) por contacto oral d) Herpesvirus humano 2 (HSV-2) por contacto sexual-oral e) Herpesvirus humano 2 (HSV-2) por contacto oral f) Herpesvirus humano 1 (HSV-1) por contacto sexual-oral 2- Cuál es el blanco principal de la infección productiva por el agente causal? a) neuronas b) células epiteliales c) células dendríticas d) células musculares e) Fibroblastos f) Linfocitos B

47 Dos años después consulta por una nueva aparición de vesículas genitales, aunque esta vez afebril, sin cefalea, ni mialgias; la paciente sólo refiere una leve disuria. Manifiesta haber tenido relaciones sexuales sin protección. 3- Conociendo la patogenia de la infección Ud. deduce que se produjo: a) Una nueva infección viral por un serotipo distinto. b) Una reactivación desde la latencia c) Infección persistente latente en el epitelio Al recibir la respuesta del médico infiere que ha estado muy nerviosa debido a que ha intentado durante varios meses quedar embarazada y no lo ha podido conseguir. 4- Cuáles son los factores que puede causar este nuevo episodio? a) Nuevo ingreso del genoma viral en la neurona ganglionar b) Estímulos externos c) Expresión de LATs d) Edad 5- Qué información piensa Ud. que podría ser importante brindar a la paciente sobre el comportamiento del HSV en recién nacidos? a) La infección adquirida en el período perinatal es la menos frecuente b) La infección congénita es la menos frecuente entre las de transmisión vertical c) La infección del neonato es frecuentemente fatal aun con tratamiento.