Fenotipo. Genotipo. CITOMETRIA DE FLUJO: Generalidades. Microbiología. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Caracterización fenotípica.

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Ana Belén Botella Rivas
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1 CITOMETRIA DE FLUJO: Generalidades. Microbiología. Fenotipo T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Genotipo Caracterización fenotípica Microscopio óptico Microscopio electrónico Microscopio epifluorescencia Anticuerpos ELISA Citometría de Flujo Southern blot Northen blot Western blot PCR Utilidad clínica Caracterización genotípica

Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. www.oncoi

2 Qué es la Citometría de Flujo? QUE ES LA CITO / METRIA DE FLUJO? La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de células en suspensión Gucker Desarrolló un citómetro de flujo para la detección de bacterias en aerosoles. Trabajo hecho duante la Segunda Guerra Mundial: MATERIAL CLASIFICADO. Objetivo: Identificación rápida de bacterias y esporas aerotransportadas, usadas en guerra biológica QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA CELULA? 1.- Su tamaño. 2.- Su granularidad o complejidad interna. 3.- Evaluación de características químicas: Fluorocromos Anticuerpos conjugados con fluorocromos FACS: Fluorescence activated cell sorter

citómetro de flujo para la detección de bacterias en aerosoles. Trabajo hecho duante la Segunda Guerra Mundial: MATERIAL CLASIFICADO.

3 Relative Intensity 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Relative Sizes of Biologicals Flow Cell 1 µm Sheath fluid Injector Tip µm Amoeba 5-8 µm Lymphocyte S.aureus Fluorescence signals Focused laser beam FLUOROCROMOS Propidium Iodide Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm DNA

4 Relative Intensity Wavelength 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm Fluorescein (FITC) Hybridoma Excitation Emisson 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm 1975 Kohler and Milstein Fusions generated by Sendai virus or PEG Multiple myeloma (human disease) Protein Bence Jones proteins in urine ANTICUERPOS MONOCLONALES Gran disponibilidad comercial Gran variedad de fluorocromos Precios accesibles Pedidos vía Internet Gran Calidad Flow cell Flow Cytometry Optics Dichroic Filters PMT 1 PMT 2 Bandpass Filters Laser PMT 4 PMT 3

http://www.immunecentral.com/images/immune_series/immune29.

8 BD VantageSE DiVa option Beckman Coulter Epics Altra Hypersort DakoCytomation MoFlo BD FACSAria Partec PPCS Union Biometrica COPAS BD FACSCalibur

9 FORMA DE PRESENTACION DE DATOS Histograma Gráfico de Puntos (Dot Plot) Gráfico de Contorno (Countour Plot) Gráfico Isométrico (3D) Gráfico de Densidad (Density Plot) Citometría de flujo: mediciones SCATTER FLUORESCENCIA IMAGEN G M L GATE CITOMETRIA DE FLUJO: APLICACIONES CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Cuantificación de moléculas Estudio de HLA-B27 Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Función Neutrofílica Estudio de Citokinas Intracelulares

Biología Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología.

10 Aplicaciones en Microbiología? Aplicaciones en Microbiología clínica Detección directa: Bacterias Hongos Parásitos Virus Light Scatter of Bacterial Spores SS B.subtilis B.anthracis irradiated B.anthracis FS Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores. Detección Directa de Bacterias Uso de anticuerpos: Identificación de patógenos No es necesario el cultivo Método rápido Usado en: Haemophilus sp. Salmonella sp Mycobacterium sp. Brucella sp. Branhamella catarrhalis J. Bacteriol 1996;178: Infect. Immun. 1995;63: Infect. Immun. 1997;65: Cytometry 1997;28:90-95 Mycoplasma pneumoniae Pseudomona sp. Bacteroides fragilis Legionella pneumophila Bacillus sp.

Detección Directa de Bacterias Uso de anticuerpos: Identificación de patógenos No es necesario el cultivo Método rápido Usado en: Haemophilus sp. Salmonella sp Mycobacterium sp. Brucella sp.

11 Detección Directa de Hongos A B Candida albicans Acs. Conjugados Uso de anticuerpos Onicomicosis: Pierard et al., 1996: Demostraron infecciones mixtas. C D A-B: Control (-) C-D: Con Acs. Serotipificación de Candida sp. J. Clin. Microbiol. 1995;34: Infect. Immun. 1997;65: Intensidad de fluorescencia verde (Log) J. Clin. Microbiol. 1995;34: Detección Directa de Parásitos Plasmodium: Marcar ADN del Parásito Ag del parásito expresados en eritrocitos. Viabilidad del parásito fagocitado. Detección Directa de Virus Detección de Ag. virales. Cuantificación de Ag. Virales. Detección de ácidos nucleicos virales. Cuantificación de ácidos nucleicos virales Giardiasis: Análisis rápido Alta sensibilidad Gran Número de muestras J. Immunol. Methods. 1995;179:1-12 J. Immunol. Methods. 1997;202:27-33 Cytometry 1997;27:84-91 En células eucariontes infectadas

Viabilidad del parásito fagocitado. Detección Directa de Virus Detección de Ag. virales. Cuantificación de Ag. Virales. Detección de ácidos nucleicos virales.

12 Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Bacterias: bead Ag + Uso de Microesferas (beads) Suero paciente J. Clin. Microbiol ;36: Cytometry 1994;18: * Anti Ig humana conjugada * * Bacterias: J. Clin. Microbiol ;36: Cytometry 1994;18: Uso de Microesferas (beads) Ensayo en corto tiempo Escelente sensibilidad Detección de múltiples Ac: Microesfereas de diferente tamaño Aplicado: Brucella abortus Staphylococcus aureus Helicobacter pylori Clostridium sp. Bacillus sp. Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Hongos: Intentos desde 1984, pero no plenamente validados Parásitos: Trypanosoma cruzi Toxoplasma gondii Virus: CMV HSV-1, HSV-2 HCV HIV-1, HIV-2 Antimicrobianos, Pruebas de Susceptibilidad y Citometría de Flujo Primeras pruebas datan de 1980 En los 90 aumenta significativamente los reportes internacionales sobre respuesta microbiana frente a antimicrobianos. Se pueden estudiar POBLACIONES microbianas: Viabilidad individual y poblacional Capacidad funcional: Vias metabólicas Potencial de membrana Resultado en pocas horas Cytometry 1982;2:

. 1998;36:802-806 Cytometry 1994;18:103-108 Uso de Microesferas (beads) Ensayo en corto tiempo Escelente sensibilidad Detección de múltiples Ac: Microesfereas de diferente tamaño Aplicado: Brucella

13 Agentes antibacterianos: Microbiología tadicional (18-24 horas) Citometría de flujo (pocas horas) Evaluación de parámetros metábolicos: Potencial de membrana Tamaño celular Cantidad de ADN Pruebas de suceptibilidad: Efecto bacteriostático Efecto bactericida

14 Susceptibilidad bacteriana Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC Combinación de: Tamaño (FSC) Granularidad (SSC) Fluorescencia: Fluorocromos para ADN y ARN Fluorocromos para ensayos metabólicos: Unión a proteínas Potencial de membrana Cytometry 1997;27: Universidad de Concepción, Chile Hospital del Trabajador Concepción, Chile Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC + proteínas (FITC) In vitro STUDIES OF ph EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES. ph 3 ph 3 ph 7 ph 7 ph 10 ph 10 Strain ATCC43504 Strain 747 LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002

Trabajador Concepción, Chile Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC + proteínas (FITC) In vitro STUDIES OF ph EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF

15 Susceptibilidad bacteriana Combinación de: Tamaño (FSC) Granularidad (SSC) Fluorescencia: Fluorocromos para ADN y ARN Fluorocromos para ensayos metabólicos: Unión a proteínas Potencial de membrana Bacterias aeróbicas Egreso de protones Ingreso de electrones Ingreso / Egreso de solutos Interior negativo Gradiente electroquímico de protones (membrana interna) Fuerza protón motriz Gradiente eléctrico Potencial de membrana Cytometry 1997;27: a -200 mv J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Potencial de membrana Involucrado Autolisis bacteriana Transporte de glucosa Quimiotaxis Bacterias Agentes antibacterianos Hiperpolarización Depolarización Disminución Depolarización Aumento Hiperpolarización Se reduce a cero Colapso de potencial de membrana Daño membrana Muerte celular Ionóforos J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Potencial de Membrana Puede ser medido efectivamente por citometría de flujo

eléctrico Potencial de membrana Cytometry 1997;27:169-178 -100 a -200 mv J Exp Biol 2000:203;51-59 Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834 Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43;223-226 Potencial de

16 Potencial de membrana Citometría de Flujo Compuestos para ensayos Potenciométricos Compuestos para ensayos Potenciométricos Carbocianinas (slow response probes) Eucariontes Procariontes DiOC 2 (3) (488 nm) Fluorescencia verde: Se altera con el tamaño celular y presencia de agregados. Es independiente del PM Fluorescencia roja: Dependiente del tamaño y del PM Célula Organelos (mitocondria) Razón F. roja / F. verde: Medida de PM Independiente del tamaño DiOC 2 (3): (3,3 -dietiloxacarbocianina iodada Handbook of fluorescent probes, ( Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Handbook of fluorescent probes, ( Mycobacterias: Susceptibilidad por citometría de flujo S. aureus Uso de diacetato de fluoresceina (DAF) Depolarización en 1 hora. Potencial demembrana permanece disminuido. Molécula no fluorescente Esterasas citoplasmáticas Molécula fluorescente Antimicrob Agents Chemother 2000:44; J. Clin. Microbiol. 1996;34:

Es independiente del PM Fluorescencia roja: Dependiente del tamaño y del PM Célula Organelos (mitocondria) Razón F. roja / F.

17 CITOMETRIA DE FLUJO: Generalidades. Microbiología. T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile.

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