BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD. ALCANCES Y LIMITACIONES

Transcripción

1 BIOMARCADORES DE GENOTOXICIDAD. ALCANCES Y LIMITACIONES Prof. Dra. Marta Ana Carballo CIGETOX- CITOGENETICA HUMANA Y GENETICA TOXICOLOGICA DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA CLINICA-INFIBIOC. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Universidad de Buenos Aires

2 ENTORNO / AMBIENTE EVENTOS BIOLÓGICOS TEMPRANOS EVENTOS BIOLÓGICOS TARDÍOS ENFERMEDAD CLÍNICA

3 La Genética Toxicológica es la unión de dos grandes áreas del conocimiento como son la Toxicología y la Genética. Identifica y analiza la acción de los agentes con toxicidad dirigida hacia los componentes hereditarios de los organismos vivos Muller - radiaciones Auerbach - agentes químicos Watson y Crick - ADN Alexander Hollaender - EMS Determina el impacto que los distintos agentes (físicos, químicos, biológicos) pueden tener sobre el material genético Trata de establecer la relación n entre mutagenesis e iniciación n del proceso neoplásico

4 Componentes celulares proclives a los procesos mutagénicos

5 Si hay una lesión en el ADN Reparación del ADN Errores en la reparación del ADN Daño severo del ADN Proliferación normal Arresto del ciclo celular Proliferación anormal Apoptosis Necrosis Micromutaciones Macromutaciones

6 Tipos y frecuencias de daño en el ADN Tipo Tipo de de daño daño en en ADN ADN (SSB) (SSB) Ruptura Ruptura de de simple simple cadena cadena Metilación Metilación de de la la Guanina Guanina N 7 7 Depurinación Depurinación Metilación Metilación de de la la Guanina Guanina O 6 6 Oxidación Oxidación del del ADN ADN Depirimidación Depirimidación Deaminación Deaminación de de la la Citosina Citosina (DSB) (DSB) Rupturas Rupturas de de doble doble cadena cadena Eventos/día/célula Eventos/día/célula % de de daño daño total total diario diario 50,9 50,9 35,6 35,6 10,2 10,2 1,3 1,3 1,2 1,2 0,5 0,5 0,2 0,2 0,01 0,01

7 AGENTE GENOTOXICO Rayos Rayos X ROS ROS Agentes Agentes alquilantes alquilantes Luz Luz UV UV Hidrocarburos Hidrocarburos policíclicos policíclicos aromáticos aromáticos RI RI Luz Luz UV UV Agentes Agentes antitumorales antitumorales Errores Errores de de replicación replicación LESIONES 8-oxidG 8-oxidG Rupturas Rupturas de de simple simple cadena cadena Fotoproductos Fotoproductos Aductos Aductos Dímeros Dímeros de de pirimídinas pirimídinas Enlaces Enlaces cruzados cruzados Rupturas Rupturas de de doble doble cadena cadena A-G A-G T-C T-C Inserciones Inserciones Deleciones Deleciones PROCESOS DE DE REPARACION Reparación Reparación por por escisión escisión de de bases bases (BER) (BER) Reparación Reparación por por escisión escisión de de nucleótidos nucleótidos (NER) (NER) Recombinación Recombinación Homóloga Homóloga (HR) (HR) Reunión Reunión de de extremos extremos no no homólogos homólogos (NHEJ) (NHEJ) Reparación Reparación de de Mal Mal apareamiento apareamiento (MMR) (MMR)

8 B I O M A R C A D O R E S DE EXPOSICIÓN: Señala presencia de sustancia exógena o metabolitos, o producto de interacción entre agente y molécula blanco. INTERNO DE DOSIS : Indica que el tóxico ha entrado al orgsnimo.. DE SUSCEPTIBILIDAD: Indicador de limitación adquirida o inherente de un organismo para responder a la exposición a un xenobiótico. DE DAÑO BIOLOGICO EFECTIVO: Indica que el tóxico ha producido algún tipo de daño en el organismo. DE EFECTO: Indicador de una alteración bioquímica, fisiológica o genética, resultado de la exposición n a un xenobiótico tico. DE RESPUESTA BIOLOGICA: representa estadíos del proceso de daño. Representan alteraciones genéticas DE ENFERMEDAD: manifestaciones preclínicas o tempranas de la enfermedad.

9 EVALUACION NIVELES DE COMPLEJIDAD CRECIENTE PRIMARIO (Bacteriano, Viral) (I) SECUNDARIO (Cultivo de células) (II) TERCIARIO (Organismo entero) (III) CUATERNARIO (Epidemiológico) (IV)

10 Niveles de Evaluación PRIMER NIVEL (I) Nivel Molecular o bacteriano Ensayos en procariotes o eucariotes inferiores Ejemplo: Test de Ames ; Bacillus subtilius TERCER NIVEL (III) Nivel In vivo Ensayos organismo entero Ejemplos: Plantas, animales (invertebrados o vertebrados) y humanos expuestos SEGUNDO NIVEL (II) Nivel In vitro Ensayos en cultivos de células c eucariotas Ejemplo: Líneas L celulares CHO, V79, Hela, Linfocitos de Sangre Periférica rica CUARTO NIVEL (IV) Nivel Epidemiológico Ensayos en poblaciones expuestas Ejemplo: exposición accidental, terapéutica o laboral de individuos expuestos

11 Principales Ensayos Utilizados en Genética Toxicológica Mutaciones Génicas Test de Ames Ensayo de reversión a triptofano en E.coli Mutaciones génicas en cultivo de células de mamífero (HPRT o TK) Mutaciones recesivas ligadas al sexo en Drosophila Evaluaciones citogenéticas en células de mamífero Ensayo de aberraciones cromosómicas Ensayo de intercambio de cromátides hermanas Ensayo del micronúcleo Evaluación de Aneuploidías Otros ensayos Daño y reparación en células de mamífero Estudios de recombinación mitótica en levaduras y/o Drosophila Ensayo del locus específico en ratón Ensayo del letal dominante Análisis citogenético y Ensayo de traslocaciones heredables Ensayo de alteraciones esqueléticas en ratón

12 ALCANCES DISEÑO O DE PROTOCOLOS PARA EVALUACION DE DROGAS, ADITIVOS, MEDICAMENTOS, Y COMPUESTOS QUIMICOS EN GENERAL METODOLOGIAS DIAGNOSTICAS PARA LA CARACTERIZACION DE DAÑO O EN SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA MONITOREO DE INDIVIDUO / S EXPUESTOS EN FORMA LABORAL, ACCIDENTAL O TERAPEUTICA

13 OECD: ORGANIZATION FOR ECONOMIC COOPERATION AND DEVELOPMENT (FDA) Las agencias internacionales de regulación han seleccionado grupos de biomarcadores de efecto con el objeto de lograr la mejor y más segura caracterización del daño, evaluando tanto in vitro como in vivo la genotoxicidad potencial. OPPTS: OFFICE OF PREVENTION, PESTICIDES AND TOXIC SUBSTANCES (EPA)

14 Guidelines S2A: Aspectos específicos de regulación de Ensayos de genotoxicidad S2B: Genotoxicidad: Una batería standard para el ensayo de genotoxicidad de productos farmacéuticos Los Comité Internacionales de Armonización (ICH) sugieren la realización de baterías de ensayos constituidas por: un ensayo de reversión en bacterias un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas) o un estudio in vitro para mutaciones génicas) un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas o test de micronúcleo en ratón)

15 Test de Salmonella o Test de Ames Desarrollo de cepas de S.typhimurium auxótrofas para histidina que permiten evaluar la retromutación de este organismo a histidina (+ ). Es decir que una especie que ha perdido una característica, vuelve a adquirirla en base a otra mutación. TA100, TA98, TA1535, TA1537, TA102, TA104 rfa, uvr B, plásmido pkm101, plásmido paq1

16 UN ESTUDIO CITOGENETICO PARA DETECTAR DAÑO O CROMOSOMICO (TEST DE ABERRACIONES CROMOSOMICAS ) O UN ENSAYO IN VITRO PARA DETECTAR MUTACIONES GENICAS (MOUSE LYMPHOMA ASSAY)

17 ABERRACIONES CROMOSÓMICAS Detecta alteraciones numérica y estructurales. Se basa en evidenciar cambios en la morfología de los cromosomas o en su número pudiendo detectar modificaciones de ploidía. Se utiliza para determinar el efecto clastogénico y/o aneunógeno de las drogas en estudio. Es el test más utilizado históricamente para evaluación de drogas.

18

19 Metafase Parcial de Linfocitos de Sangre Periférica con Aberraciones Cromosómicas

20 Metafase Parcial de línea celular CHO con Aberraciones Cromosómicas

21 IM =Nºcel= en estadíos de mitosis/nº total cel interfase

22 Técnica de coloración diferencial de cromátide o FPG- fluorescencia plus giemsa

23 IR= Nº cél. M1+2 Nº cél. M2 + 3 Nº cél. M3/100

24 Ensayo de Mutaciones Génicas en Células de Mamífero Se puede realizar en distintas líneas celulares L5178Y linfoma de ratón (TK) TK6 línea linfoblastoide humana (HGPRT) Ambos ensayos se basan en la adquisición de resistencia a un producto. Línea normal no crece en presencia del producto. Línea mutada crece en presencia del producto. Para TK se seleccionan por resistencia a Trifluorotimidina. Las células deficientes en HPRT son seleccionadas por resistencia a la 6-tioguanina u 8 azaguanina.

25 UN TEST IN VIVO PARA GENOTOXICIDAD QUE DETECTE DAÑO O CROMOSOMICO (ABERRACIONES CROMOSOMICAS O TEST DE MICRONUCLEO EN RATON)

26 Evento Genotóxico Mala segregación Defectos en: Huso mitótico Centrómero Mala condensación cromosómica Daño al ADN Roturas de ADN Errores de reparación MN MN

27

28 Guidelines S2 R1: Ensayos de genotoxicidad e Interpretación de datos para Productos farmacéuticos de uso Humano un ensayo de reversión en bacterias un estudio citogenético para detectar daño cromosómico (test de aberraciones cromosómicas o, o TEST DEL MICRONÚCLEO in vitro o ensayo de mutaciones génicas) un test in vivo para genotoxicidad que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón, TEST DEL COMETA) un ensayo de reversión en bacterias un test in vivo para genotoxicidad UTILIZANDO DOS TEJIDOS, uno que detecte daño cromosómico (aberraciones cromosómicas, test de micronúcleo en ratón) Y OTRO ENSAYO IN VIVO COMO TEST DEL COMETA, UDS, TRANSGENIC MOUSE MUTATION ASSAY)

29 AGENTES GENOTÓXICOS Ensayo de MNCB Inhibe la polimerización de actina CITOCALASINA B No se forma el anillo contráctil Célula Binucleada con MN BLOQUEO DE LA CITOCINESIS

30 MICRONÚCLEOS CARACTERÍSTICAS Redondo u oval Borde liso y uniforme Igual plano focal que núcleo No ser refringente 1/16 y 1/3 del diámetro del núcleo Igual coloración y textura que núcleo No superpuesto ni conectado Se analizan 1000 células BN Expresión de resultados: Nº MN/1000 células BN Frec. células BN con MN en 1000 BN

31

32 DETECTA Roturas de ADN simple cadena. Roturas de ADN doble cadena. Sitios Alcali lábiles. ADN-ADN y ADN-prot cross linking. Roturas simples asociadas con mecanismos de reparación incompletos

33 ANALISIS DE RESULTADOS CONTEO VISUAL Se deben contar 50 cometas/vidrio. 2 vidrios/muestra. Total: 100 células por muestra. Estableciendo Categorias de Daño: 1:< 20 micras 2: micras 3: micras 4: > 80 micras ID= n1+2 n2+ 3 n3+4 n4, siendo n la cantidad de células dañadas que se registraron para cada una de las cuatro categorías.

34 SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA

35 Inestabilidad cromosómica: mica: Rearreglos, comportamiento citogenético anormal. Causas: Mutaciones de proteínas involucradas en la replicación y reparación del ADN. Fallos en puntos de control del ciclo celular. Anomalías centrosómicas. Defectos en la segregación. Mal funcionamiento de los telómeros. Recombinación homóloga vinculada a la reparación de roturas de ADN de doble hebra.

36 Clasificación Síndromes clásicos Anemia de Fanconi Síndrome de Bloom Ataxia Telangiectasia Síndromes menos frecuentes Nijmegen breakage ICF Cockayne Xeroderma Pigmentosa Otros Riyadh Rothmund-Thompson Radial-renal Craniostenosis-Microcefalia Dubowitz

37 Carcinogénesis Ambiental factores intrínsecos hereditarios exposición a agentes carcinogénicos Defectos en la replicación o Incremento en el riesgo Reparación del ADN de cáncer Dependiendo del síndrome, el comportamiento anormal tomará la forma de: Frecuencia elevada de aberraciones espontáneas Niveles elevados de intercambio de cromátides hermanas Hipersensibilidad cromosómica a Xenobióticos Rearreglos cromosómicos estables o recurrentes Características en común Predisposición a tumores Inmunodeficiencia Retardo en el crecimiento

38 SINDROMES DE INESTABILIDAD CROMOSOMICA

39 SINDROME DE BLOOM Es autosómica recesiva. Mayor frecuencia en judíos Askenazi y japoneses. Presentación: microcefalia, alteraciones de piel y deficiencia inmunológicas. Poseen inteligencia normal. Riesgo: desarrollan distintos tipos de cáncer y leucemias agudas. Pronóstico de vida: la edad promedio de vida son los 24 años (14 a 49). Características citogenéticas:: rupturas de cormosomas dando figuras de cuadriradiales e intercambio de cromátides hermanas. El diagnóstico citogenético se hace mediante ICH espontáneo, (90 o más). El gen afectado es el BLM que se encuentra en 15q26.1

40 Autosómica recesiva. Presentación.: retardo mental, malformaciones esqueléticas, anomalías en piel, anemia severa. Riesgo: desarrollan sindromes mielodisplásicos y LMA Pronóstico de vida: La edad de sobrevida es hasta los 16 años y la causa de muerte es hemorragia y sepsis asociado a sindromes mielodisplásicos. Tipos: 7 grupos. Los genes involucrados se describen como FANC y se adicionan las letras que van desde A hasta G. Por ahora los de peor pronóstico son los del grupo G. ANEMIA DE FANCONI Características citogenéticas: alteraciones estructurales espontáneas que se ven incrementadas cuando se exponen los cultivos a agentes inductores de cross-linking. Para el diagnóstico se utiliza DEB.

41 ATAXIA TELANGIECTASIA Autosómica recesiva, Ataxia cerebelar y telangiectasia ocular, nariz y orejas No reconocen mecanismos de reparación de DSB Presentación: segundo año de vida con ataxia cerebelar progresiva, disartria y distonía. Riesgo: de leucemia y linfomas y tumores de piel, ovario, mama y estómago. Pronóstico de vida: hasta la 4ª década con medicación permanante. Características citogenéticas: Incremento de alteraciones tipo cromátide, roturas cromosómicas, triradiales y cuadriradiales Gen ATM 11q22-q23.1 Diagnóstico citogenético mediante exposición a rayos X o radiomiméticos (BLM)

42 BIOMONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS

43 MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOS Edad Tiempo de trabajo Sexo Manifestaciones clínicas A 28 2 añosa F Lagrimeo/ rinorrea y descamación n en piel B 32 3 añosa M Lagrimeo/ fotofobia C 32 9 añosa M Irritación n visual/sequedad nasal/oligoazoospermia D 33 2 añosa F Irritación n visual/sequedad en pie E 54 9 añosa F Sin síntomas s F añosa F Sequedad conjuntival G 36 2 añosa F Descamación/blefaritis/sequedad conjuntival

44 MONITOREO DE INDIVIDUOS EXPUESTOS A CITOSTATICOS IM IR ICH MN A ± B ± C ± D ± E ± F ± G ± CONTROL: IM: IR: ICH : MN: 3-233

45 ESTRATEGIAS 5 de los individuos presentan valores en el rango de los controles históricos y de la literatura En tres casos alguno o varios de los biomarcadores se encuentran modificados con respecto a los valores control Se sugiere la repetición n luego de pasado un mínimo m de 6 meses para analizar comportamiento celular con el mismo biomarcador alterado y/o la introducción n de una nueva metodología a que aporte mayor sensibilidad.

46 LIMITACIONES MOTIVO DE APLICACIÓN N DEL ESTUDIO ELECCION DEL/LOS BIOMARCADORES ANAMNESIS INTERPRETACION DEL RESULTADO FACTORES CONFUNDENTES

47 Muchas Gracias por su atención!!! CIGETOX Prof. Dra. Marta Ana Carballo Dra. Marcela López Nigro- Bioq. Victoria Arroyo Lic. y Ms. Susana Bartolotta Becarios Doctorado: Bioq. Catalina Cortada; Bioq. Fernanda Simoniello; Bioq. Natalia Casanova Becarios Iniciación: Med. Gabriel Angeleri- Lic. Erika Portmann Tesistas de Licenciatura: Estud. Silvana Curieses- Estud. Natalia Balarino