I. INTRODUCCIÓN I.1 Acuacultura y desarrollo económico.

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1 I. INTRODUCCIÓN I.1 Acuacultura y desarrollo económico. En la actualidad la acuacultura es una actividad de suma importancia económica a nivel mundial. En el 2006, esta actividad alcanzo una producción total de 51.7 millones de toneladas, lo cual representó un aumento de 2.3 millones de toneladas en comparación al 2004, donde la producción total fue de 45.5 millones de toneladas; sin embargo, el consumo per cápita permaneció estable con un valor de 16.6 Kg. (equivalente a peso vivo) debido a que la población de consumo también se incrementó (FAO, 2008). La camaronicultura, dentro de la acuacultura, es la mayor actividad a nivel mundial, destacando el cultivo de camarones peneidos. FAO en 2006, reporta en el informe del estado mundial de pesquería y acuacultura (SOFIA), que la producción mundial de camarones fue de 2, 476, 028 toneladas, aunque la importancia de la camaronicultura reside en el valor comercial, ya que en 2004 el valor de estos organismos fue de 14, 361 millones de dólares (FAO, 2006). En México, principalmente en el estado de Sonora, la camaronicultura se ha convertido en una actividad de suma importancia, ya que en el 2003 la acuacultura tuvo una producción total de 32, 574 toneladas de las cuales, 31, 073 toneladas fueron de camarón (CONAPESCA, 2003), Mientras que en la actualidad esta producción prácticamente se ha duplicado ya que para el 2009 se obtuvo una producción total superior a las 81, 000 toneladas en una superficie de siembra de aproximadamente 22, 000 hectáreas con un rendimiento de 3, 201 Kg Ha -1 (COSAES, 2010). Diversos sistemas de producción se han desarrollado con la finalidad de aumentar la producción debido a su alta redituabilidad económica. Martínez-Córdova (1993), menciona que dichos sistemas de cultivos están caracterizados por la densidad de organismos por metro cuadrado así como el manejo antropogénico que se les da. El sistema extensivo, (primero en emplearse), se desarrolla en áreas de varias hectáreas expuestas a los cambios de marea con densidades de 20 a 30 mil individuos por hectárea, debido a que tanto los fertilizantes como el alimento se usan en pequeña o nulas cantidades, el efluente de este sistema de cultivo tiene poco impacto en el 12

2 medio ambiente. Los sistemas semi-intensivos constituyen el tipo de cultivo predominante en México, donde la densidad de siembra fluctúa entre 60 y 200 mil organismos por hectárea; la aplicación de fertilizantes y alimento suplementario, con una tasa de recambio de 3-6% son comunes en estos sistemas. Los sistemas intensivos poseen una densidad de siembra que puede ser mayor a los 400,000 individuos por hectárea, con recambios de agua del 3 al 30% del volumen total al día; además del empleo de aireadores mecánicos que aseguran que se mantengan condiciones aeróbicas (Martínez-Córdova, 1993; Páez-Osuna y Ruiz-Fernández, 2001). La sobreexplotación de la camaronicultura ha tenido repercusiones en el medio ambiente. Páez-Osuna y Ruiz-Fernández (2001), reporta que en el impacto de esta actividad se puede incluir efectos positivos y negativos que resultan de la instalación, operación y abandono de las granjas camaronícolas que pueden afectar agua, suelos y otros recursos utilizados por otros usuarios. La entrada de nutrientes a los sistemas costeros, específicamente nitrógeno y fósforo a partir de aportes antropogénicos, es una de las mayores presiones que impacta actualmente a los ecosistemas costeros de todo el mundo (Páez-Osuna y Ruiz-Fernández, 2001). En el caso del cultivo de camarón, el aporte de alimento rico en proteínas de origen animal, así como una alta fertilización trae como consecuencia un cambio drástico en la calidad del agua de los efluentes camaronícolas (Saldias-Dinamarca, 2001). Burford y Williams (2000), describen en su investigación las principales fuentes de nitrógeno soluble donde sobresalen la excreción por branquia, lixiviación de los alimentos y lixiviación de las heces. Los cambios en la composición del agua tienen como consecuencia la eutroficación del manto freático. Saldias-Dinamarca (2001), menciona que el problema de la eutroficación se incrementa debido a que la productividad de las aguas costeras es frecuentemente limitada por el nitrógeno, asimismo, observa que en general todas las variables estudiadas, a excepción de clorofila a, presentaron elevadas concentraciones en las fuentes de agua. Por lo que las normatividad de regulación ambiental debería basarse en la concentración de las variables de calidad de agua entre afluentes y efluentes. Investigaciones recientes muestran que los efectos adversos de los efluentes de granjas camaronícolas sobre la calidad del agua de los ambientes estuarinos-lagunares receptores se 13

3 deben a que son ricos en sólidos suspendidos, nutrientes y con alta demanda bioquímica de oxígeno (DBO) (Páez-Osuna y Ruiz-Fernández, 2001). I.2 Camaronicultura e impacto en el medio ambiente. Debido al gran impacto ecológico suscitado por la camaronicultura, se han tratado de realizar acciones que lo mitiguen. Boyd (1999), recomienda las buenas prácticas de manejo como una vía para mejorar la calidad del agua y reducir las concentraciones de nutrientes. Estas prácticas comprenden desde una adecuada fertilización para promover solo la cantidad necesaria de fitoplancton, hasta cosechar sin descargar el efluente, el cual debe transportarse a una fosa de sedimentación (Pardo y col., 2006). Howerton (2001), establece las buenas prácticas de manejo y reporta los niveles máximos permisibles de nutrientes en las descargas de las granjas. Otra opción es el aprovechamiento biológico a través de moluscos, algas, perifiton y humedales artificiales con plantas acuáticas emergentes (Pardo y col., 2006). Shimoda y col., (2006), reportan una disminución del 32% del presupuesto de nitrógeno en efluentes de camarones utilizando manglares, ostiones y microalgas como biofiltros. Sin embargo, algunos investigadores han preferido la utilización de moluscos bivalvos para estos métodos, ya que estos organismos son biofiltradores toda su vida y su capacidad para reducir nutrientes es considerable (Mann y Ryther, 1977; Jones, 1999; Lefebvre y col.,1999; Bernal-Jaspeado, 2006; Shimoda y col., 2006y Armenta-Ayón, 2007). Una alternativa viable para mejorar la calidad del agua de efluentes es el uso de bacterias oxidantes de compuestos nitrogenados. Estas bacterias son quimiolitotróficas y utilizan la energía liberada de la nitrificación para asimilar el CO 2 (Atlas y Bartha, 2006). No obstante, dicho proceso también puede ser efectuado por microorganismos heterotróficos como hongos y algunas bacterias, aunque estos no obtienen ninguna ganancia energética por este proceso, por lo cual no se sabe con certeza por qué estos organismos llevan acabo esta reacción (Balbás, 2002; Dollhopf y col., 2005 y Thyssen y col., 2005). Aunque la naturaleza química de esta reacción es incierta, ésto debido a que no se han aislado algunas de las enzimas que intervienen en ella ni se ha podido detectar algunos intermediarios postulados, se sabe con certeza que la ganancia energética de la conversión de 14

4 amonio a nitrito es de 65 a 66 Kcal mol -1 y la de nitrito a nitrato aproximadamente de 17 a 18 Kcal mol -1 (Campbell, 2001). En la figura 1 se muestran las reacciones llevadas a cabo acabo a través del ciclo de fijación microbiana del nitrógeno, donde la oxidación aeróbica del amonio es realizada en mayor parte por bacterias de los géneros Nitrosospira y Nitrosomonas, dicho mecanismo de oxidación es llevado en dos pasos, iniciando con la oxidación de amonio a hidroxilamina, por bacterias del género Nitrosomonas, posteriormente este compuesto es oxidado a nitrito con ayuda de intermediarios como el radical nitroxilo (Campbell, 2001). Finalmente bacterias del género Nitrobacter oxidan el nitrito a nitrato en un solo paso con ayuda del oxígeno molecular (Atlas y Bartha, 2006). Fig. 1 Ciclo de nitrógeno, 1) Fijación, 2) Oxidación aeróbica de amonio, 3) Oxidación aeróbica de nitrito, 4) Desnitrificación, 5) oxidación anaeróbica de nitrito, 6) reducción de nitrito y nitrato a amonio (tomado de Jetten 2008). La nitrificación por microorganismos quimioautótrofos se realiza en todos los medios aerobios posibles, sin embargo, la velocidad con que se lleva acabo en medio acuoso es muy 15

5 baja; en el mar dicho proceso es muy lento, confinándose solamente a aguas superficiales, aunque este se encuentra muy bien establecido en los sedimentos y estuarios (Campbell, 2001). Freitag y Prosser (2003), encontraron en sedimentos anóxicos marinos la presencia de altos picos de nitratos, lo cual se manifestó con la presencia de bacterias oxidantes de nitrógeno de la subclase -proteobacteria. En una investigación similar Cébron y col. (2003), encontraron extensas comunidades de bacterias oxidantes de nitrógeno en estuarios del río Sena, en Francia. La mineralización del nitrógeno, seguido por la formación de amonia, producto de materiales orgánicos, es de suma importancia en sistemas cercanos a la costa, donde existe un gran ingreso de nutrientes antropogénicos, sin embargo, la desnitrificación por microorganismos quimioautótrofos que generan una perdida de 50% del aporte del nitrógeno inorgánico (O`Mullan y Ward 2005). El papel de estas poblaciones bacterianas dentro de los tratamientos de biorremediación del agua se encuentra bien establecido. Daims y col. (2001), mencionan que en el tratamiento por lodos activados, la eficacia de éste se debe a la gran población de bacterias tipo Nitrospira encontradas en el biorractor. Coskuner y col. (2005), reportan que las bacterias autótrotofas capaces de oxidar el amonio son de suma importancia en el tratamiento por lodos. Bender y col. (2004), encontraron que en los efluentes provenientes de estanques de lobinas (Centropristis striata), tratados por medio de tapetes microbianos, el amonio se mantuvo en valores por abajo de 1 mg/l. La alta concentración de oxígeno favoreció la proliferación de bacterias del tipo nitrificante. De igual forma Philips y Love (2006), dan a conocer que el método mas práctico para remover amonio en sistemas cerrados de cultivo de camarón es la nitrificación por medio de bacterias, dicha remoción se alcanza si el efluente es pasado por lechos en donde se encuentran las bacterias. Sin embargo, no se sabe con certeza la proporción en la que se encuentra esta población bacteriana en procesos donde se utilizan policultivos, en especial moluscos bivalvos, debido a que éstos constituyen una parte importante de la alimentación de esos organismos, así mismo, puede existir una exclusión competitiva o de antagonismo bacteriano por parte de la microbiota nativa (Campbell, 2001, Coskuner y col., 2005, Atlas y Bartha, 2006 y Philips y Love, 2006). 16

6 I.3 Métodos de diagnostico de filogenia microbiana. En la actualidad se han empleado varios métodos de detección molecular de microorganismos en muestras ambientales basados en la filogenia bacteriana del 16S rrna. El desarrollo de dichos métodos permite detectar poblaciones microbianas específicas y sus actividades sin necesidad de cultivar microorganismos. Dentro de estas técnicas moleculares solo dos destacan debido a su precisión y especificidad: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la Hibridación in situ fluorescente (FISH). La técnica de PCR permite la replicación in vitro de una secuencia definida de ADN; dicha técnica consiste en amplificar por medio de un proceso cíclico enzimático, un secuencia específica de ADN. El uso de esta técnica permite aumentar significativamente la probabilidad de detectar la presencia de secuencias extrañas en mezclas heterólogas de ADN (Atlas y Bartha., 2006). El procedimiento de dicha técnica sucede en tres pasos, el primero consiste en la desnaturalización del ADN mediante el rompimiento de los puentes de hidrógeno que le confiere al ADN su estructura de doble hélice, posteriormente se procede a realizar una renaturalización, que implica la hibridación de pequeños fragmentos de ADN (oligonucleótidos) en sus regiones especificas y finalmente se realiza una síntesis de las cadenas de ADN a partir del extremo OH 3 de los oligonucleótidos que procede en dirección 5 a 3. La técnica de PCR es útil en el control ambiental, así como para establecer patrones filogenéticos en diversas poblaciones y comunidades bacterianas. En su investigación, Hollibaugh y col. (2002), encontraron una relación filogenética de bacterias tipo Nitrospira en muestras oceánicas del mar del sur, utilizando una secuencia del 16S RNAr, aunque en su trabajo concluyen que existe una distribución bien delimitada de dicha población, asimismo encontraron que dicha bacteria juega un papel muy importante en el proceso de nitrificación. Cébron y col., (2003), establecen las tasas de nitrificación en efluentes del río Sena y encontraron, con ayuda de un primer dirigido a la secuencia del gen Amo, que en dichos efluentes hay una relación filogenética del 81% entre Nitrosomonas oligotropha y Nitrosomona urea. Diversos autores en sus investigaciones han utilizado la técnica de PCR para encontrar una relación filogenética de diversas comunidades bacterianas en todo tipo de muestras ambientales (Nold y col., 2000; Ward y col., 2000; Freitag y Prosser, 2003). 17

7 La técnica de FISH, es una técnica de tinción selectiva que se basa en los principios de moléculas que poseen el papel de marcadores fluorescentes los cuales van adheridos a oligonucleótidos, que son secuencias relativamente cortas que pueden unirse (hibridarse) a secuencias de nucleótidos que contienen secuencias homólogas de la población bacteriana a quien va dirigida (Pernthaler y col., 2003; Atlas y Bartha, 2006). El procedimiento de esta técnica esta basado en dos principales fundamentos: la hibridación, en la cual existe una desnaturalización de la cadena del ADN y posteriormente hay una adición de la sonda específica marcada la cual se hibrida a la cadena de ADN (Fig. 2) y, finalmente, la propiedad fluorescente del marcador (Pernthaler y col., 2003). La técnica de FISH, permite una caracterización morfológica completa y selectiva de una población microbiana en particular. Aislamiento de DNA Fijación n de muestra en pozo Desnaturalización n de la cadena Adición n de sonda Hibridación n de la sonda y detección n en microscopio Fig. 2. Proceso de hibridación in situ fluorescente (tomada de Atlas y Bartha, 2006). López-Torres y Lizárraga-Partida (2007), realizaron una caracterización total de la población bacteriana en agua, organismos y alimentos vivos de un sistema de producción larvaria de camarón mediante el método anteriormente mencionado. Oliveira y col. (2003), desarrollaron un método específico para la cuantificación y detección de Listeria monocytogenes en leche, basado en la técnica de FISH, encontrando a este método como una 18

8 alternativa viable para la cuantificación de bacterias en muestras ambientales y de alimentos; dando resultados confiables en un periodo de 7 horas con un costo reducido. De igual forma, Rowan y col. (2005), establecieron un ensayo rápido para la determinación de la población bacterias oxidantes de amonio (AOB), utilizando una sonda de oligonucleótido especifica para bacterias de este tipo en muestras de lodos activados de una planta de tratamiento, en el Reino Unido. Básicamente el método de hibridación in situ fluorescente ha sido empleado con el fin de establecer una comparativa espacial y temporal, así como determinar la estructura de comunidades bacterianas en muestras ambientales de diferente naturaleza (Christensen y col., 1999; Glokner y col., 1999; Daims y col., 2001; Hoshino y col., 2005). Debido al gran aporte de compuestos nitrogenados generados por los efluentes de la camaronicultura, el objetivo de esta investigación es identificar, por medio de la técnica de hibridación in situ fluorescente, bacterias oxidantes de amonio y su correlación con compuestos nitrogenados dentro de un sistema biológico de remoción de nutrientes con fines de biorremediación. 19