Metilación del ADN & Islas CpG

Transcripción

1 Metilación del ADN & Islas CpG

2 Base bioquímica La metilación es la adición de un grupo metilo (-CH3) a una molécula. La metilación se observa en el ADN, ARN y en proteínas. EUCARIOTAS PROCARIOTAS Metil-Citosina Metil-Adenina En eucariotas ocurre exclusivamente en las citosinas (en el carbono 5-5meC) Frecuentemente, metilación de la adenina en N6 Y de la citosina en C5

3 Metilación y desmetilación De novo metiltrasferasa (DNMT3 ) Metila citosinas previamente no-metiladas (o hemi-metiladas) Metiltransferasa de mantenimiento (DNMT1) Actúa principalmente sobre citosinas hemi-metiladas (metiladas en una hebra) para mantener el estado de metilación después de la replicación del DNA Hao Wu, Yi Zhang. Reversing DNA Methylation: Mechanisms, Genomics, and Biological Functions. Cell. Volume 156, Issue 1, Pages (January 2014).DOI: /j.cell

4 Metilación y desmetilación (B) Pasos de la ruta de modificación de 5mC C) Base excision repair of 5mC (in plants) or 5fC/5caC (in mammals) Hao Wu, Yi Zhang. Reversing DNA Methylation: Mechanisms, Genomics, and Biological Functions. Cell. Volume 156, Issue 1, Pages (January 2014).DOI: /j.cell

5 Desmetilación activa y pasiva Hao Wu, Yi Zhang. Reversing DNA Methylation: Mechanisms, Genomics, and Biological Functions. Cell. Volume 156, Issue 1, Pages (January 2014).DOI: /j.cell

6 Contexto de metilación Mamíferos: Básicamente CpG, en células no-diferenciadas también CHG y CHH Plantas: Tanto CG como CHH y CHG Arabidopsis thaliana Homo sapiens IMR90: fibroblasto H1: célula madre

7 Función de la metilación Regulación de la expresión génica: Metilación cerca del TSS: bloquear la iniciación de la transcripción Metilación del cuerpo génico: Estabilización y elongación de la transcripción Estabilidad de genoma: Metilación de los centrómeros Metilación de transposones Desarrollo Desmetilación o reprogramación global de los valores de metilación en dos fases del desarrollo Impronta génica & inactivación del cromosoma X Genes improntados y los ubicados en el cromosoma X desactivado suelen silenciarse mediante metilación del DNA

8 Expresión génica Relación entre nivel de expresión y probabilidad de de novo metilación

9 Función de la metilación NDR en el TSS (inicio de transcripción) (NDR: nucleosome depleted region) Nucleosomas flanqueantes tienen H3K4me3 y H2A.Z Metilación en el cuerpo génico: Elongación y splicing Enhancer suelen mostrar metilación parcial mecanismo dinámico (presencia de TET!) Metilación bloquea la unión de CTCF al insulator.

10 Expresión génica y metilación Que primero, el silenciamiento del gen o la metilación de la región promotora? 1) El Promotor se metila se silencia el gen 2) El gen es silenciado el promotor se puede metilar (para estabilizar el silenciamiento?) 1) En cáncer, promotores con CGI son silenciados primeros y metilados después A favor de silenciamiento primero 2) Trabajos sobre el papel de DNMT3A en la diferenciación de células hematopoyéticos sugieren un papel mas amplio de la metilación

11 Impronta génica y inactivación Probablemente el silenciamiento de (algunos) de los genes del cromosoma X precede la metilación

12 Inestabilidad del genoma: cáncer

13 Global hypomethylation in breast cancer. Hon G C et al. Genome Res. 2012;22: Copyright 2012 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

14 Metilación y desarrollo Figure 1. DNA methylation changes during developmental epigenetic reprogramming. Primordial germ cells (PGCs) emerge in embryos at E7.5 and, concomitant with their proliferation and migration towards the genital ridge, DNA methylation is globally erased (black line). Following sex-determination, new DNA-methylation landscapes are established in germ-cell precursors in an asymmetrical fashion in male and female embryos. In the male embryo (blue line), de novo methylation takes place before meiosis in mitotically arrested cells (G1-phase; prospermatogonia) and is completed before birth. In the female embryo (red line), primary oocytes enter meiosis and arrest in prophase-i (diplotene stage); DNA methylation is established after birth during the follicular/oocyte growth phase. At puberty, under specific endocrine triggers, fully-grown germinal vesicle (GV) oocytes resume the first meiotic division. After extrusion of the first polar body, oocytes arrest in metaphase of the second meiotic division (MII oocytes) and meiosis is completed only upon fertilisation. Following fertilisation, a new wave of DNA demethylation takes place that is distinct on the parental genomes. In the zygote, DNA methylation of the paternal genome is rapidly erased by an active mechanism (blue line). Demethylation of the maternal genome is slower (red line) and is dependent on DNA replication (passive demethylation). These post-fertilisation demethylation events do not include imprinted gdmrs (green dotted line), resulting in parental-allele-specific methylation of these elements in early embryos and consequent parental-allele-specific expression of associated imprinted genes. Concomitant with blastocyst implantation and cell-lineage determination, new methylation landscapes become established, associated with cellular differentiation.

15 Resumen

16 Publicaciones Deaton AM, Bird A.(2011). CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25(10): Thomson JP, Skene PJ, Selfridge J, Clouaire T, Guy J, Webb S, Kerr AR, Deaton A, Andrews R, James KD, Turner DJ, Illingworth R, Bird A. (2010).CpG islands influence chromatin structure via the CpG-binding protein Cfp1. Nature. 464(7291): Suzuki, M.M. and Bird, A. (2007). DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nat. Rev. Genet. 9(6): Jones PA: Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyond. Nature reviews Genetics 2012, 13(7): Hao Wu, Yi Zhang. Reversing DNA Methylation: Mechanisms, Genomics, and Biological Functions. Cell. Volume 156, Issue 1, Pages (January 2014).DOI: /j.cell

17 Patrón de metilación Los patrones de metilación (distribución a lo largo de la secuencia) no son iguales en distintos eucariotas La levadura (Saccharomyces cerevisiae) y C. elegans no tienen un gen homólogo al DNMT y no presentan me5c En fungi, solo el DNA repetido se metila Los mayores niveles de metilación en plantas (hasta el 50% de todas las citosinas) metilación de contextos non- CpG en elementos transponibles En general encontramos un mosáico de metilación (regiones metiladas y intercaladas regiones no-metiladas Genomas de mamífero son predominantemente metilados (CpG) con excepción de regiones cortas llamados islas CpG

18 Manifestación en el genoma: las islas CpG % de los CG están metilados (mamíferos) CG TG Frecuencia de CpG 5 veces más baja de la esperada Desaminación espontanea de metil-citosinas Las CpG permanecen solamente en los sitios en que no se metilan: Islas CpG

19 Propiedades de las islas CpG 1. Son ricas en G+C (ratio O/E alto) y tienen longitudes alrededor de 1kb 2. Entre el 50 y el 70% de los genes tienen una isla CpG asociada a sus promotores. 3. Casi todos los genes housekeeping (se expresan en todos los tejidos) tienen una isla asociada a su promotor pero solo la mitad de los genes específicos la presentan. 4. En los promotores de los genes: Cuando se metilan dan lugar a una inhibición de la transcripción. 5. En el cuerpo génico: Cuando se metilan dan lugar a estabilización de la transcripción 6. En algunas condiciones fisiológicas o patológicas se pueden ver cambios en el estado de la metilación: cáncer Existen tanto métodos experimentales como computacionales para detectar islas CpG

20 islas CpG: ventanas deslizantes

21 CpGcluster: basado en distancias Read the DNA sequence Binary sequence: CpG = 1; nocpg = Determine the distance (d) of each CpG to the next CpG downstream in the DNA sequence: 10,5,5,3,1,8,23,34,21,12,2,5,8,6,9,...N-1 Let be d m a distance threshold If d i d m Cluster seed For example, for d m = 5: 10,5,5,3,1,8,23,34,21,12,2,5,8,6,9,...N-1 List of CpG clusters with coordinates, length and number of CpGs Assign a P-value to each CpG cluster Statistically significant cluster CpG island Calculate statistical and sequence properties: G+C content, O/E ratio, CpG density, intra-clustering of CpGs, overlap with Alus, PhastCons etc.

22 Qué distancia usamos?

23 P ro b a b ility Cómo asignar la significación? Cual es la probabilidad de encontrar un cluster con N CpGs y longitud X en una distribución al azar? Binomial Negativa N = 5 R a n d o m S e q u e n c e N e g a tiv e B in o m ia l N = N = N = C lu s te r le n g th (n t)

24 Publicaciones sobre islas CpG M. Gardiner-Garden and M. Frommer, CpG islands in vertebrate genomes. J. Mol. Biol., 196 (1987), pp D. Takai and P.A. Jones, Comprehensive analysis of CpG islands in human chromosomes 21 and 22. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (2002), pp M. Hackenberg, C. Previti, P.L. Luque-Escamilla, P. Carpena, J. Martinez- Aroza and J.L. Oliver, CpGcluster: a distance-based algorithm for CpG-island detection. BMC Bioinformatics, 7 (2006), p Robert S. Illingworth, Adrian P. Bird CpG islands A rough guide. FEBS letters (2009)

25 Detectar la metilación de DNA El problema: 1) Hibridación es insensible frente a la metilación no se puede usar chips de DNA 2) La PCR elimina la información acerca del estado de metilación Pre-tratamiento del DNA & lectura del estado de metilación

26 Bisulfito sódico & Secuenciación

27 Bisulfito sódico & Secuenciación El protocolo: 1) Tratar el DNA con Bisulfito sódico una citosina no-metilada se desamina: citosina uracilo timina (PCR) una citosina metilada se mantiene 2) Secuenciar el DNA 3) Alinear las lecturas (los reads ) al genoma un desemparejamiento (entre el read ) C/T indica no-metilación un emparejamiento C/C indica metilación Ventaja: Se obtiene información de metilación para cada citosina y no solo valores medios para una región como ocurre con muchos otros métodos Se puede detectar la metilación en todos los contextos y no solo CpG Reto: Re-secuenciar un genoma entero Alinear miles de millones de secuencias cortas (reads)

28 Tratamiento con Bisulfito Genomic Fragment 5'...TCGTAAGCTGCGATGTCAGCGTAGTTCCGATG... 3' 3'...AGCATTCGACGCTACAGTCGCATCAAGGCTAC... 5' Denaturation & Bisulfite modification BSW BSC 5'...TUGTAAGCTGUGATGTCAGUGTAGTTCUGATG... 3' 3'...AGUATTCGACGUTACAGTCGUATCAAGGUTAC... 5' A MethylC-Seq PCR I 5'...TTGTAAGCTGTGATGTCAGTGTAGTTCTGATG... 3' 3'...AGTATTCGACGTTACAGTCGTATCAAGGTTAC... 5' BSW BSC

29 Secuenciación Métodos actuales Second Generation Sequencing (Secuenciación masiva) 454 Pyrosequencing (PS) Illumina Reversible Termination (RT) SOLID Sequencing by Ligation (SBL)

30 Bisulfito & Secuenciación SANGER SECUENCIACIÓN MASIVA Di-deoxy terminator Roche 454 GS FLX (PS) Illumina HiSeq 2000 (RT) SOLID V4 (SBL) Salida por proceso 1.6 Mb 600 Mb 200 GB 100 GB Tiempo/Proceso 1h 10 h 9 d 11 d Longitud media reads 800 pbs 400 pb 100 pb 75 pb Salida por día 38.4 Mb 1.44 GB 22.2 GB 9 GB Usos frecuentes - Secuenciación de novo Captura de exones Resecuenciación Captura de exones Metagenómica Resecuenciación Captura de exones Metagenómica

31 Alinear las lecturas Muestra de DNA Reads secuenciados Troceado Selección Diferencias: 1) Variación 2) Errores de secuenciación y alineamiento EXPERIMENTAL Amplificació n COMPUTACIONAL Mapead o Criterios de calidad Resecuenciación e interpretación Genoma de referencia

32 Obtener niveles de metilación

33 Obtener niveles de metilación Distinguir entre la acción del bisulfito y 1) Errores de secuenciación 2) SNV (Single Nucleotide Variation) un polimorfisomo con los alelos C/T seria detectado como una citosina no-metilado!! Context Start Watson Level Crick Merged Watson Crick level Level SNV fraction SNV fraction Result CG (+/-) rejected CTT (-) unmeth CWG (+/-) intermeth CG (+/-) unmeth CAT (-) rejected CWG (+/-) unmeth CG (+/-) meth CTA (-) unmeth CCG (+) unmeth CG (+/-) meth CAT (-) unmeth

34 NGSmethDB Propiedades de la base de datos NGSmethDB ( La base de datos NGSmethDB almacena datos de metilación a nivel de la citosina, generados por secuenciación masiva y conversión con bisulfito Actualmente contiene datos para 3 especies (humano, ratón y Arabidopsis) y un total de 22 tejidos únicos. Todos los datos se pueden bajar en formato texto. No solo tiene datos del contexto CpG sino también de CWG (CAG/CTG) El usuario puede elegir entre diferentes cuberturas (las veces que se ha secuenciado una posición) Para humano hay , para ratón y para Arabidopsis datos de metilación. La base de datos cuenta con dos modos para obtener y analizar los datos. Primero, un navegador (Genome Browser) para mostrar la metilación en el contexto de otras anotaciones como genes, islas CpG, contenido en G+C, etc. Segundo, varias pequeñas herramientas (php/java) están disponibles para 1) buscar citosinas no metiladas, 2) detectar citosinas con metilación diferencial en un conjunto de tejidos, 3) obtener los niveles de metilación en una región dada, 4) analizar los niveles de metilación en la región promotora de los genes.

35 NGSmethDB El navegador de NGSmethDB: La metilación se muestra mediante un gradiente de color: verde (no metilado) a rojo (metilado) Stefanie Geisen, Guillermo Barturen, Ángel M. Alganza, Michael Hackenberg and José L. Oliver Nucleic Acids Research, Vol. 42, Database issue D53 D59

36 NGSmethDB Interfaz a las herramientas de NGSmethDB