LABORATORIO DE QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

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1 1 UNIVERSIDAD MAYOR FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE KINESIOLOGÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA LABORATORIO DE QUÍMICA Y BIOQUÍMICA 2011 Profesores de Laboratorio: Gabriela Cornejo B. Mayama Francia A.

2 2 LABORATORIO N 1 MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO I.- INTRODUCCIÓN A) Instrucciones Generales Cada alumno debe presentarse puntualmente al laboratorio llevando: Delantal blanco Guía de laboratorio Pantalón largo Zapatos cerrados Es obligatorio, que cada alumno: Trabajar sólo en presencia de profesores. Realizar un estudio previo de las materias teóricas de la sesión a realizar, según calendario de actividades. Conocer y aplicar las normas mínimas de seguridad. Mantener los frascos de reactivos tapados y en lugares asignados por el profesor. B) Normas Generales de Seguridad 1. Conozca y practique las normas mínimas de seguridad. 2. Informe de inmediato al profesor en caso de lesión, por leve que ésta sea. 3. Lea con calma las instrucciones para el desarrollo del trabajo práctico y no se distraiga durante el desarrollo de éste. 4. Use el delantal siempre abotonado. 5. Mantenga limpio su lugar de trabajo. 6. Tenga cuidado con la barba, pelo largo suelto, ya que puedes enredarte fácilmente, inflamarte o absorber sustancias químicas peligrosas. 7. Se prohibe beber, comer y fumar durante el desarrollo del práctico. 8. No lleve sus manos a la boca durante el desarrollo de un práctico. 9. Jamás caliente material de vidrio graduado directamente a la llama del mechero, utilice la estufa para secar. 10. Oriente la boca del tubo de ensayo lejos de Ud. y de otras personas cuando esté calentando. 11. Etiquete siempre los reactivos y el material que este utilizando en el práctico. 12. No succione un reactivo con la boca usando la pipeta, siempre utilice una propipeta. 13. Lea siempre la etiqueta del reactivo. 14. No huela los reactivos directamente. 15. Mantenga siempre las sustancias químicas tapadas. 16. Los líquidos inflamables y tóxicos deben ser utilizados siempre bajo campana. 17. Diluya o neutralice las sustancias antes de botarlas al resumidero. 18. No bote reactivos sólidos al resumidero. 19. Si se derrama algún reactivo sobre la piel, lave inmediatamente con abundante agua e informe a su profesor lo ocurrido.

3 3 C) Materiales de Laboratorio de uso más frecuente Pinza para bureta Bureta Bagueta Pipeta aforada o volumétrica Pipeta graduada Tubos de ensayo Vaso de precipitado Vidrio de reloj Embudo simple Embudo Büchner Matraz Aforado Probeta Matraz Erlenmeyer Matraz Kitazato

4 4 Frasco Gotario Embudo de separación Mortero con pistilo Pizeta Propipeta Crisol con tapa Pinza para crisol Rejilla con Centro de asbesto Trípode Gradilla Pinza con nuez

5 5 D) Materiales Volumétricos Clasificación: 1. No clasificado: No se conoce su precisión, la medición con él implica errores de medida. 2. Clasificados: Material calibrado individualmente, de alta precisión y exactitud. Instrucciones generales para el uso del material volumétrico Cuando un líquido está contenido en algún material volumétrico, la superficie exhibe una curvatura denominada menisco. En la lectura del material volumétrico, el ojo del observador debe estar a nivel del líquido (Figura 1). Los matraces aforados se utilizan solamente para preparar soluciones y deben permanecer tapados, ya que la evaporación del líquido que contienen se traduce posteriormente en una alteración de la concentración. Figura 1 E) Material volumétrico Probetas: Son recipientes cilíndricos transparentes, graduados, provistos de una base. Las hay de diferentes capacidades. Las probetas no son muy precisas, sólo se emplean en mediciones aproximadas. Matraces Aforados: Son recipientes de fondo plano y cuello estrecho, en los cuales pequeñas variaciones de volumen del líquido se traducen en cambios visibles en la marca en el cuello o menisco. Pipetas: Son instrumentos diseñados para entregar un volumen conocido de líquido, transfiriéndolo de un recipiente a otro. Existen dos tipos: las que entregan un volumen fijo, o volumétricas, y las que están calibradas en unidades para que puedan dejar salir diferentes volúmenes conocidas como graduadas.

6 6 Buretas: Consiste en un tubo calibrado provisto de una válvula o llave por la cual se controla el flujo del líquido. Poseen una precisión y exactitud superior a las pipetas y siempre se utiliza en forma vertical, sostenida por un soporte universal (Figura 2). Figura 2 F) Material de Calentamiento Mecheros: Existe gran variedad de mecheros, siendo el de uso común el Bunsen. Éstos aprovechan el poder calorífico del gas para combustionarse con el aire (Figura 6). Figura 6 Mechero Bunsen: Posee una base metálica en el cual se encuentra el inyector de gas y una salida lateral para la conexión del gas. Atornillada a su base tiene una chimenea con orificios regulares para la entrada del aire (figura 7). Figura 7

7 7 Si la entrada de aire se encuentra tapada, se produce una llama amarilla de bajo poder calorífico; debido a la presencia de gases reductores, tales como hidrógeno y monóxido de carbono esta se conoce como llama Reductora. Al colocar un objeto frío en contacto con esta llama, se deposita una capa de hollín debido a la combustión incompleta. Si la entrada de aire se encuentra abierta, se produce una llama de color azul de alto poder calorífico, ésta es la llama Oxidante. En la base de la llama se produce un cono interno de color calipso atribuido a la combustión del monóxido de carbono su temperatura es baja por la presencia de gas y oxígeno sin combustionar. Al colocar un objeto frío en contacto con esta llama, no se deposita una capa de hollín debido a que la combustión es completa. De aquí que la llama presenta diferentes zonas de temperatura (figura 8). Figura 8 Si el paso de gas es insuficiente o bien hay exceso de aire, puede ocurrir que la llama descienda por el interior de la chimenea y se pose finalmente en el inyector de gas, provocando calentamiento excesivo del tubo. Cuando ocurre esto, se dice que el mechero está calado y se debe cortar inmediatamente el paso de gas, cerrar el paso del aire a la mitad y luego volver a encender. Siempre debe encenderse el mechero teniendo la chimenea con la entrada de aire cerrada y luego abrirla lentamente. H) Material de medición de temperatura Existen dos conceptos que se confunden con frecuencia: Cantidad de calor y temperatura. Cantidad de calor Se mide en calorías (cal), kilocalorías (Kcal) y British Thermal Unity (BTU). Una caloría es la cantidad de calor que es capaz de incrementar en un grado Celsius la temperatura de un gramo de agua pura, desde 14,5 a 15,5 C. Temperatura Es el resultado del aporte o sustracción de calor a un cuerpo dado; se puede expresar en grados celsius o centígrados, grados kelvin o absoluto y grados Fahrenheit. La escala Centígrado: Toma como 0 C la temperatura del hielo fúndente y como 100 C la temperatura de ebullición del agua pura, cuando la presión es de 1 atm. Las temperaturas expresadas en esta escala se designan con la letra C.

8 8 La escala Kelvin: Se diferencia de la centígrado en que el cero grado Kelvin corresponde a -273,15 grados de la Celsius (el signo negativo indica grados bajo cero). Las temperaturas expresadas en esta escala se designan con la letra T. La relación existente entre ambas escalas es: K = º C + 273,15 La escala Fahrenheit: La temperatura del hielo fúndente corresponde a 32 F y la de ebullición del agua a 212 F. Por lo tanto, la relación existente entre la escala centígrado y Fahrenheit es: F = ( 1,8 x C ) + 32 Termómetro de mercurio Sirven para medir temperaturas entre -30 C y +300 C, límites impuestos por la temperatura de solidificación del mercurio (-38,8 C) y la temperatura de ebullición de éste (+357 C). Este termómetro es un cilindro que posee un depósito o bulbo de mercurio, unido a un capilar, para poder advertir claramente las pequeñas variaciones de volumen generadas por la dilatación o concentración del líquido. Los termómetros de mercurio de uso de laboratorio NO deben ser agitados para bajar la temperatura ya que vuelven a marcar constantemente la temperatura ambiente. Las causas de error en la medición de temperatura con termómetros de contenido líquido son: Falta de tiempo para que la columna llegue a adquirir la temperatura del ambiente en que se hace la determinación Error de paralaje del observador. Debido a que el vidrio se contrae por envejecimiento y puede provocar la variación del cero hasta un par de grados, los termómetros deben calibrarse periódicamente. I) Material de medición de masa Balanza analítica: Es un instrumento de alta exactitud y precisión, utilizada para medir cantidades pequeñas de masa con exactitud de 0,1 miligramo (mg). Presenta un sistema oscilante, que a través de un mecanismo interno determina el peso (Figura 11). Una balanza analítica debe cumplir los siguientes requisitos: ser exacta, estable, sensible y tener un período de oscilación corto. Figura 11 Se detallará el procedimiento de pesada de la balanza Mettler AC100, aunque los pasos son muy similares con cualquier otra balanza. Para ejecutar una pesada sin error, es necesario seguir secuencialmente el procedimiento que se describe a continuación: a) Nivelar la balanza y conectar a la corriente eléctrica. b) Encender y presionar la tecla de lectura (TARE) para llevar la cifra a 0,0000 gramos.

9 9 c) Si desea pesar un objeto, abra la puerta lateral, coloque el objeto a pesar, cierre la puerta y registre la medida. d) Si desea pesar una cantidad determinada de sustancia, primero hay que tarar el recipiente en el que se depositará la sustancia a pesar. Coloque el recipiente en el interior de la balanza cierre la puerta lateral y presione la tecla de lectura (TARE) de manera de tarar el recipiente. Agregue la cantidad sustancia deseada cierre las puertas y lea la medida. e) Retirar el recipiente con la sustancia pesada y vuelva a tarar. f) Limpie la balanza una vez que haya terminado de usarla. J) Material de medición de densidad La densidad es una propiedad física que depende de la temperatura debido a la dilatación que sufren los cuerpos; su valor numérico es característico de la sustancia y ayuda a identificarla. La densidad de líquidos y sólidos se expresa normalmente en gramos por mililitro (g/ml), mientras que la densidad de gases se expresa en gramos por litro (g/l) Su valor corresponde a la razón entre su masa y el volumen que ocupa dicha masa: masa de la sustancia densidad = Volumen de la sustancia m (g) d = V (ml) d = densidad m = masa V = volumen Como la densidad del agua no varía apreciablemente con la temperatura entre 0 C y 30 C, se puede utilizar el valor aproximado de 1,00 g/ml. Densímetro: Sirve para determinar la densidad de líquidos. Es un cilindro de vidrio hueco, herméticamente cerrado que presenta, en su parte superior, una escala graduada en su interior y en su parte inferior contiene municiones que sirven de lastre, de modo que, al sumergirlo en el líquido, cuya densidad se desea determinar, se hunde hasta cierto nivel (Figura 12). Figura 12 La sensibilidad de un densímetro depende del diámetro de su vástago; como éste no puede ser muy largo, estos instrumentos se fabrican para medir intervalos de densidad. Existen juegos de densímetros, los cuales poseen graduación creciente. En la posición de equilibrio la densidad se lee directamente en la escala graduada que se encuentra en la parte superior de éste. Para medir la densidad de un líquido, se debe seguir el siguiente procedimiento:

10 10 a) Tome una probeta y llene las ¾ partes con el líquido cuya densidad se desea conocer. b) Seleccione el densímetro que corresponda al rango de densidad que espera medir. Siempre se debe partir con el densímetro de menor escala. c) Introduzca el densímetro en el líquido de modo que flote sin tocar las paredes del recipiente donde se realiza la determinación. En caso de que persista el contacto con las paredes gire el densímetro muy suavemente, repita la operación hasta lograr el efecto deseado (Figura 13). d) La escala graduada da directamente la densidad del líquido en g/ml. e) Registre la temperatura a la cual se realizo la medida. Figura 13 II.- OBJETIVOS Manejar las normas de seguridad correctamente en el laboratorio. Conocer y manipular adecuadamente el material de laboratorio de uso más frecuente. III.- PARTE EXPERIMENTAL 1) Material de medición de masa a) Proceda a pasar en Balanza analítica distintos materiales en las porciones indicadas en la siguiente tabla. Registre los valores y repita el procedimiento para obtener una segunda medida. Porción masa (g) 2 medidas de leche 1/4 fruta b) Con el promedio en gramos de cada medida realizada, transforme los valores a: microgramos (μg), miligramos (mg) y kilogramos (kg). Porción microgramos (μg) miligramos (mg) kilogramos (kg) 2 medidas de leche 1/4 fruta

11 11 2) Material volumétrico a) Enumere y pese en balanza analítica tres vasos precipitados de 100 ml. Agregue luego a cada uno de los vasos 10 ml de agua destilada, utilice para agregar el agua en el primer vaso una pipeta graduada, en el segundo vaso una probeta y en el tercer vaso una jeringa. Pese enseguida los vasos con el agua y registre todos los valores obtenidos en la siguiente tabla Vaso Masa vaso seco (g) Masa vaso con los 10 ml de agua vertida (g) Masa de agua destilada vertida (g) Volumen de agua destilada vertida (ml) b) Asumiendo que el volumen vertido es exacto, determine el error asociado a cada material volumétrico, restando al valor requerido (10 ml) el valor realmente vertido por cada material utilizado. Material volumétrico Volumen vertido (ml) Error (10 ml - volumen vertido) Pipeta graduada Probeta Jeringa c) Ordene el material volumétrico de mayor a menor exactitud (de menor a mayor error) d) Transforme los valores de masa de agua agregada a: microlitros (μl) y litros (L) de agua, recuerde que la densidad del agua es 1g/mL. Pipeta graduada Microlitros (μl) Litros (L) Probeta Jeringa

12 12 3) Material de medición de temperatura a) Mediante un termómetro de mercurio mida la temperatura del agua destilada, del agua en ebullición, del agua-hielo y del agua a temperatura ambiente. Para este experimento necesitará un mechero, siga los siguientes pasos para su correcto encendido: Cierre la entrada de aire en el mechero, encienda un fósforo y en seguida abra la llave de gas. De vuelta lentamente el anillo que regula el suministro de aire para regular la llama que va a usar. b) En un vaso precipitado pequeño agregue aproximadamente 50 ml de agua destilada, con un termómetro mida la temperatura ambiente del agua; luego caliéntelo a ebullición con ayuda de un mechero y mida nuevamente la temperatura del agua. c) En otro vaso precipitado pequeño agregue aproximadamente la mitad del volumen del vaso en hielo molido o un cubo de hielo y un poco de agua destilada, agite y mida la temperatura del agua-hielo. Agua hielo Temperatura en Celsius (ºC) Agua a temperatura ambiente Agua a ebullición d) Para cada medida realizada transforme los valores de grados Celsius (ºC) a: grados Kelvin (K) y grados Fahrenheit (ºF). Agua hielo Grados Kelvin (K) Grados Fahrenheit (ºF) Agua a temperatura ambiente Agua a ebullición 4) Material de medición de densidad (Experimento demostrativo, realizado por el profesor) a) En una probeta grande con 300 ml de agua destilada, introduzca cuidadosamente el densímetro más liviano, si no se sumerge cámbielo por uno de mayor peso y así sucesivamente hasta encontrar el densímetro correcto. Gire cuidadosamente el densímetro y procure que no toque las paredes de la probeta, espere que se estabilice y registre la medida. b) Repita la operación utilizando una solución de cloruro de sodio saturada. Agua destilada Densidad (g/ml) Solución de Cloruro de sodio

13 13 b) Con cada medida obtenida transforme los valores a: microgramos por litro (μg/l), miligramos por litro (mg/l) y kilogramos por mililitros (k/ml). Solución de Cloruro de sodio (μg/l) (mg/l) (k/ml) TRANSFORMACIÓN DE UNIDADES: A) MASA: 1Kg = 1000 g = mg = μg o bien, 1Kg = 1*10 3 g = 1*10 6 mg = 1*10 9 μg B) VOLUMEN: 1L = 1000 ml = μl o bien, 1 L = 1*10 3 ml = 1*10 6 μl IV.- CUESTIONARIO 1. Mencione paso a paso la forma en que se utiliza una balanza analítica. 2. Mencione las precauciones en el manejo de un termómetro. 3. Describa un densímetro y su utilización. 4. Ejemplo de aplicación: Sabiendo que 128 g de etanol ocupan un volumen de 160 ml, Cuál es la densidad del etanol?

14 14 LABORATORIO N 2 SOLUCIONES Y PRESIÓN OSMÓTICA I.- INTRODUCCIÓN A) Soluciones La materia puede presentarse en forma de mezclas o sustancias puras. Cuando una mezcla tiene una composición uniforme, en cualquier punto del volumen que ella ocupa, decimos que ésta es una mezcla homogénea. En el lenguaje químico una mezcla homogénea es una solución. Las soluciones pueden ser sólidas, líquidas o gaseosas. Tipos de solución Ejemplos Componentes Sólida Bronce cobre y estaño oro de 18 quilates oro y cobre o plata Líquida Gaseosa Infusión de té Gasolina aire gas licuado cafeína, taninos, pigmentos y agua (entre otros) mezcla de más de 200 hidrocarburos nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, argón, agua, etc. propano y butano principalmente En una solución se denomina solvente al componente que está presente en mayor proporción. El resto de los componentes son los solutos. Para caracterizar una solución debe expresarse la cantidad de cada componente en relación al total de la solución. Esta noción de cantidad de un componente dado relativa al total es lo que se denomina concentración. La concentración de una solución hipotética, constituida por un soluto A y un solvente B, se expresa de diversas formas según se describe a continuación: Unidades de Concentración 1) Porcentaje en Peso (% p/p) También se le conoce como porcentaje peso-peso y determina la masa de soluto, en gramos, contenida en 100 gramos de masa de solución. Se trata de una unidad de amplio uso en la venta de reactivos químicos. masa de soluto (g) %p/p = x 100 masa de solución (g) Ejemplo: Si se disuelven 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 90 g de agua. La solución es al 10% en peso 2) Porcentaje Peso-Volumen (% p/v) Se refiere a la masa de soluto, en gramos, disuelta por cada 100 ml de solución. Es la unidad preferida en la información de análisis de laboratorios clínicos.

15 15 masa de soluto (g) %p/v = x 100 Volumen de solución (ml) Ejemplo: Si se disuelven 10 g de cloruro de sodio (NaCl) en 100 ml de solución. La solución es al 10% p/v 3) Molaridad (M): Indica el número de moles de soluto contenido en cada litro (L) de solución, y se calcula por medio de la expresión: Molaridad = moles de soluto Volumen de solución (L) o bien, moles de soluto Molaridad = x 1000 Volumen de solución (ml) Ejemplos: a) Una solución que contiene 34 g de amoniaco (2,0 moles de NH 3 ) en 1,0 L de solución, es una solución 2,0 M (se lee 2,0 molar) de amoniaco. b) Otra solución de amoniaco que contenga 17 g de este soluto en 500 ml de solución, también es una solución 2,0 M de amoniaco. 4) Partes por Millón (ppm): Para soluciones muy diluidas, es decir aquellas que presentan una muy pequeña cantidad de soluto disuelto, se utiliza esta unidad de concentración que se expresa como: ppm = masa de soluto (mg) Volumen de solución (L) o bien, masa de soluto (g) ppm = x 10 6 Volumen de solución (ml) Ejemplos: a) Una solución que contiene 6,0 x10-5 g de óxido de calcio en 1,0 L de solución, es una solución 0,06 ppm (se lee 0,06 partes por millón) de óxido de calcio. b) Otra solución de óxido de calcio que contenga 3,0 x10-5 g de este soluto en 500 ml de solución, también es una solución 0,06 ppm de óxido de calcio.

16 16 Preparación de soluciones Las soluciones se pueden preparar por pesada o por dilución. Cuando se dispone de un soluto sólido, la solución se prepara pesando una masa dada de soluto, para luego añadir suficiente solvente para enrasar hasta el aforo del matraz volumétrico. Sin embargo, también es posible preparar soluciones por dilución cuando se dispone de una solución concentrada, a partir de la cual se han de preparar soluciones de menor concentración. Ejemplo 1: Preparación de solución por pesada Se desea preparar 250 ml de una solución de carbonato de sodio 0,1 M. Indique como hacerlo, si dispone de carbonato de sodio sólido como materia prima. (Masa molar del carbonato de sodio es 106 g/mol). Solución: Paso 1: Determinar la masa necesaria 0,1 molar significa que tengo 0,1 mol de carbonato de sodio en 1,0 L (1000 ml) de solución. 0,1 mol 1000 ml x 250 ml x = 0,025 mol. Por lo tanto, para preparar 250 ml se requieren 0,025 moles de carbonato de sodio. Si la masa molar es 106 g/mol. Entonces, 106 g 1 mol x 0,025 mol x = 2,65 g. Por lo tanto, se requiere 2,65 g de carbonato de sodio. Paso 2: Preparación Pesar 2,65 g de carbonato de sodio en un vaso precipitado. Disolver en un poco de agua destilada y vaciar a un matraz aforado de 250 ml. Enjuagar el vaso precipitado con dos porciones de agua destilada y vaciar al matraz aforado. Enrasar hasta el aforo, agitar para homogeneizar y trasvasijar a una botella de almacenamiento. Etiquetar señalando el nombre de la solución, la concentración, la fecha de preparación y el nombre de la persona responsable de la preparación. Ejemplo 2: Preparación de solución por dilución Se desea preparar 250 ml de una solución de ácido nítrico 0,5 M. Indique como hacerlo, si dispone de una solución de ácido nítrico al 43% en peso y densidad 1,27 g/ml como materia prima. (Masa molar del ácido nítrico es 63 g/mol). Solución: Paso 1: Determinar el volumen necesario 0,5 molar significa que tengo 0,5 mol de ácido nítrico en 1,0 L (1000 ml) de solución. 0,5 mol 1000 ml x 250 ml x = 0,125 mol. Por lo tanto, para preparar 250 ml se requieren 0,125 moles de ácido nítrico. Si la masa molar es 106 g/mol, entonces 63 g 1 mol x 0,125 mol x = 7,88 g. Por lo tanto, se requiere 7,88 g de ácido nítrico

17 17 Como la solución de la cual se dispone (solución madre) es al 43% en peso, entonces 43 g 100 g de solución 7,88 x x = 18,3 g de solución. Por lo tanto, se requiere 18,3 g de la solución madre Como se dispone de la densidad (1,27 g/ml), se calcula el volumen correspondiente a ésta masa 1,27 g 1 ml de solución 18,3 g x x = 14,4 ml de solución. Por lo tanto, se requiere 14,4 ml de la solución madre Dilución de soluciones (utilización del factor de dilución) Una forma de trabajar la preparación de soluciones diluidas a partir de soluciones concentradas es a través del factor de dilución. Este se define de la siguiente manera: Factor de dilución (fd) = Concentración de la solución madre Concentración de la solución diluida Primero se debe determinar la Molaridad de la solución madre, para lo cual se utiliza la siguiente ecuación Molaridad de la = Solución madre %p/p x densidad de la solución x 10 Masa molar del soluto M madre = 43 x 1,27 x = 8,67 molar Ahora se puede aplicar el factor de dilución, como M madre = 8,67 y M diluida = 0,5 entonces: 8,67 Factor de dilución = = 17,3 0,5 Luego, si V diluida = 250 ml V madre = V madre = V diluida Factor de dilución 250 ml 17,3 = 14,4 ml Por lo tanto, se requiere 14,4 ml de la solución madre.

18 18 B) Propiedades Coligativas Si analizamos distintos líquidos, en las mismas condiciones de temperatura y presión atmosférica, se puede apreciar que sus propiedades físicas varían de unos a otros. Algunas de estas propiedades son densidad, punto de ebullición, punto de congelación, presión de vapor, etc. Así por ejemplo Líquido Presión de vapor a 25 C Punto de ebullición a 1 atm Agua 23,8 mmhg 100,0 C Benceno 94,4 mmhg 80,1 C Por lo tanto, los líquidos puros tienen propiedades físicas características. Cuando un soluto y un solvente dan origen a una solución, ésta presenta propiedades físicas que difieren de las correspondientes a los componentes puros. Así por ejemplo, a una presión de una atmósfera el agua hierve a 100 C, si al agua le agregamos un soluto podemos observar que el punto de ebullición se eleva. Muchas propiedades importantes de las soluciones dependen del número de partículas de soluto en la solución y no de la naturaleza de las partículas del soluto. Estas propiedades se denominan propiedades coligativas, porque tienen un mismo origen; esto es, todas ellas dependen del número de partículas de soluto presentes, independiente de que las partículas sean átomos, iones o moléculas. Las propiedades coligativas son: el aumento del punto de ebullición (ascenso ebulloscópico), el descenso del punto de congelación (descenso crioscópico), disminución de la presión de vapor y la presión osmótica.en este trabajo se verificará la presión osmótica Presión Osmótica Si dos soluciones líquidas de un soluto cualquiera, no volátil, de diferente concentración, se ponen en contacto a través de una membrana semipermeable, estas soluciones tienden a igualar sus concentraciones mediante el paso de solvente a través de la membrana; este proceso se denomina Osmosis. En consecuencia, la osmosis es el proceso por el cual una membrana semipermeable permite el paso de solvente a través de ella con el objetivo de igualar la concentración a ambos lados de la membrana. La presión que se debe ejercer sobre la solución para evitar la osmosis, corresponde a la presión osmótica. La presión osmótica (π), se puede determinar por medio de la siguiente relación: π = M x R x T En esta ecuación, M es la concentración molar de un soluto, R es la constante universal de los gases (0,082 atm*l/k*mol) y T la temperatura absoluta (K). La presión osmótica es directamente proporcional a la concentración de la disolución. Si se tienen dos soluciones de igual concentración y, por ende, con la misma presión osmótica, se dice que son isotónicas o isoosmóticas. Si dos soluciones tienen presiones osmóticas diferentes, se dice que la más concentrada es hipertónica o hiperosmótica y la más diluida se describe como hipotónica o hipoosmótica.

19 19 II.- OBJETIVOS Preparar una solución acuosa de concentración dada, si dispone de un soluto sólido o de una solución más concentrada del mismo u otro soluto. Verificar y predecir la dirección en fluye un solvente a través de una membrana semipermeable. III.- PARTE EXPERIMENTAL Preparación de soluciones 1) Preparación de una solución por pesada: Prepare 250 ml de solución acuosa 0,1 M de hidróxido de sodio (NaOH) (masa molar 40 g/mol) a) Calcule la masa requerida de NaOH. b) Mase en un vaso precipitado pequeño la cantidad determinada. Masa requerida de NaOH (g) Masa pesada de NaOH (g) c) Disuelva el sólido añadiendo agua destilada (aproximadamente la mitad del volumen del vaso) en forma cuidadosa (evite salpicaduras) y con agitación manual con ayuda de una bagueta. d) Una vez disuelto todo el sólido transfiera la solución a un matraz aforado de 250 ml. e) Enjuague el vaso 2-3 veces con pequeñas porciones de agua añadiendo cada enjuague al matraz. f) Agregue, con una pizeta, agua destilada hasta una altura 0,5-1 cm, aproximadamente, por debajo del aforo. g) Complete, con agua destilada, el volumen restante con un gotario o pipeta Pasteur hasta la línea de aforo. h) Agite el matraz para homogeneizar la solución. i) Guarde y etiquete correctamente esta solución en un envase de plástico para su posterior uso. 2) Preparación de una solución por dilución: Prepare 250 ml de una solución acuosa 0,1 M de ácido acético (CH 3 COOH) (masa molar 60 g/mol) a) Determine el volumen de solución de CH 3 COOH 3,0 M que necesita para preparar dicha solución. Para realizar este cálculo utilice factor de dilución. b) Mida el volumen con una pipeta provista de una propipeta. Por ningún motivo succione el líquido con la boca, recuerde qué existe la propipeta!!!. Volumen requerido de CH 3 COOH (ml) Volumen sacado de CH 3 COOH (ml) c) Vacíe el líquido a un matraz aforado de 250 ml. d) Agregue, con una pizeta, agua destilada hasta una altura 0,5-1 cm por debajo del aforo. e) Complete, con agua destilada, el volumen restante con un gotario o pipeta Pasteur hasta la línea de aforo. f) Agite el matraz para homogeneizar la solución. g) Guarde y etiquete correctamente esta solución en un envase de vidrio para su posterior uso.

20 20 3) Propiedades coligativas (Presión Osmótica) a) Saque cuidadosamente 2 huevos de un recipiente con vinagre, en forma suave para no romperlos. Siga las instrucciones de su profesor de cómo debe limpiarlos, luego de esto séquelos tocándolos suavemente con una toalla de papel. b) Rotule 2 vidrios de reloj con papel engomado. c) En cada uno de ellos coloque un huevo (secado previamente con toalla de papel) y péselos en la balanza de precisión (recuerde tarar previamente el vidrio de reloj). Registre sus valores en la tabla correspondiente. d) Tome 2 vasos de precipitado de 600 ml y márquelos A y B. En el vaso A agregue 400 ml de una solución de azul de metileno. En el vaso B agregue 350 ml de agua destilada y adicione 85 de azúcar de mesa (agite hasta obtener una solución homogénea). e) Deposite un huevo en cada vaso, siguiendo la pista de cada huevo con su correspondiente masa inicial. Anote la hora de inicio de su experimento. Hora de inicio: f) Después de 1 hora y en forma programada por el profesor, saque los huevos (de uno a la vez), séquelos suavemente con una toalla de papel y péselos nuevamente. Anote la masa de los 2 huevos en la tabla que tiene a continuación. Vaso Huevo Descripción Masa inicial del huevo A ml de solución de azul de metileno B 2 85 g de azúcar en 350 ml de agua Masa final del huevo Después de 1 hora IV.- CUESTIONARIO Cálculos de unidades de concentración 1. Qué masa, en gramos, de NaOH (masa molar 40 g/mol), se necesita para preparar 100 ml de NaOH 0,6 M? 2. Que volumen, en mililitros, de HCl 0,7 M son necesarios para preparar 500 ml una solución de HCl 0,25 M?

21 21 3. Realice todos los cálculos necesarios para preparar 100 ml de una solución de ácido acético 0,1 M a partir de una solución de ácido acético 99,8 % p/p y densidad 1,05 g/ml (masa molar CH 3 COOH = 60 g/mol). 4. Si dispone de acetato de sodio (masa molar 82 g/mol), indique a través de cálculos matemáticos, cómo prepararía 250 ml de una solución 0,1 M a partir de este sólido. 5. Determine la molaridad de las siguientes soluciones: a) NH 3 (Masa Molar = 17 g/mol) al 18,5 % p/v b) Ca (Masa Molar = 40 g/mol) a 300 ppm 6. Explique porqué es necesario tratar el huevo por cinco días con vinagre (ácido acético) 7. Esquematice, a través de flechas, la dirección del traspaso de solvente en de cada uno de los experimentos de Osmosis que se llevaron a cabo durante el laboratorio. Vaso Huevo Descripción Después de 1 hora A 1 Huevo sumergido en 400 ml de azul de metileno B 2 Huevo sumergido en una solución de 85 g de azúcar en 350 ml de agua destilada

22 22 LABORATORIO N 3 SOLUCIONES ACIDO-BASE Y BUFFER 1.- INTRODUCCIÓN Soluciones Ácido-Base Los solutos disueltos en agua pueden clasificarse como electrolitos y no electrolitos en función de su capacidad de conducir la corriente eléctrica. En relación a esta propiedad, se denomina electrolito a una sustancia que disuelta en agua conduce la corriente eléctrica, mientras que un no electrolito es una sustancia que disuelta en agua no conduce la corriente eléctrica. Los electrolitos pueden disociarse total o parcialmente en iones, según lo cual se clasifican a su vez en electrolitos fuertes a aquellos que se disocian completamente en iones (100 %) en solución acuosa y electrolitos débiles a los que se disocian parcialmente en iones en estas condiciones. Un tipo especial de electrolitos son los ácidos y las bases. Según la Teoría de Arrhenius un ácido es una sustancia que libera uno o más iones hidrógeno (H + ) por cada molécula, y una base es una sustancia que libera uno o más iones hidroxilos (OH - ) por cada molécula, como uno de los productos de disociación iónica, en contacto con el agua. Estos conceptos se limitaron solamente a soluciones acuosas, porque están basadas en la liberación de iones H + y OH -. La Teoría de Brönsted-Lowry define un ácido como cualquier especie que tiene tendencia a ceder un ion hidrógeno a otra especie, y una base como una sustancia que tiende a aceptar un ion hidrógeno de otra sustancia. Estos conceptos no sólo se pueden aplicar a los ácidos y bases de Arrhenius, sino que a otras especies, como por ejemplo agua (H 2 O) y amoniaco (NH 3 ). Finalmente, la Teoría de Lewis define un ácido como una sustancia que puede aceptar un par de electrones para formar un nuevo enlace y una base como una sustancia capaz de entregar un par de electrones para formar un enlace nuevo. Fuerza relativa de los ácidos y bases En solución acuosa, algunos ácidos entregan protones más fácilmente y algunas bases los reciben con mayor facilidad que otras, esto es lo que llamamos fuerza relativa de ácidos y bases. Un ácido fuerte es aquel que en solución acuosa se disocia totalmente liberando iones hidrógeno (por tanto es un electrolito fuerte). Ejemplo: HCl, HBr, HI, HNO 3, HClO 4, H 2 SO 4, entre otros. Un ácido débil es aquel que en solución acuosa se disocia parcialmente liberando iones hidrógeno (por lo tanto, es un electrolito débil). Ejemplo: CH 3 COOH, H 3 PO 4, HCN, H 2 S, etc. El grado en el que un ácido se ioniza en un medio acuoso se puede expresar por la constante de equilibrio para la reacción de ionización. En general, podemos representar cualquier ácido por el símbolo HX, donde el equilibrio de ionización está dado por: HX (ac) H + (ac) + X - (ac) La expresión de la constante de equilibrio correspondiente es: [H + ] [X - ] K a =, [ ] = Concentración [HX] Molar

23 23 La constante de equilibrio se indica con el símbolo K a, y se llama constante de disociación ácida. Cuanto más pequeño sea su valor más débil es el ácido, menos disociado se encuentra. Una base fuerte es aquella que en solución acuosa disocia totalmente liberando iones hidroxilos (por lo tanto, es un electrolito fuerte). Ejemplo: NaOH, KOH. Una base débil es aquella que en solución acuosa disocia parcialmente liberando iones hidroxilos (por lo tanto, es un electrolito débil). La constante de equilibrio, K b, se llama constante de disociación básica. Cuanto más pequeño sea el valor de K b más débil es la base, situación similar para el ácido. Ionización del agua y escala de ph El agua puede aceptar o donar un protón, dependiendo de las circunstancias. La transferencia de un protón entre dos moléculas de agua es llamada Autoionización. 2H 2 O (l) H 3 O + (ac) + OH - (ac) o bien H 2 O (l) H + (ac) + OH - (ac) La constante correspondiente al equilibrio de Autoionización, K w, constante de autoionización del agua, tiene la forma: K w = [H + ] [OH - ] = 1, (a 25 C) Este valor es importante ya que establece que en agua pura, la concentración de ion H + y ion OH - son muy pequeñas (1, molar) y no varía en forma independiente, sino que están reguladas por la constante K w. Si una de estas concentraciones aumenta, la otra necesariamente deberá disminuir para que el producto de las concentraciones de estos iones mantenga el valor de dicha constante. Por cuanto la concentración de H + en una solución acuosa suele ser muy pequeña y varía en varios órdenes de magnitud, se expresa en términos de un parámetro denominado ph. El ph se define como el logaritmo negativo en base diez de la concentración molar de iones hidrógeno, es decir: ph = - log [H + ] Debido al signo negativo, el ph disminuye a medida que aumenta la concentración de iones hidrógeno de modo tal que: Soluciones ácidas ph < 7,0 [H + ] > [OH - ] Soluciones neutras ph = 7,0 [H + ] = [OH - ] Soluciones básicas ph > 7,0 [H + ] < [OH - ] El logaritmo negativo también es una forma de expresar las magnitudes de otras cantidades pequeñas. Por ejemplo, se puede expresar la concentración de ion hidroxilo como poh y definirlo según: poh = - log [OH - ] Usando esta notación pude demostrarse que en una solución acuosa, a 25 C, siempre debe cumplirse que: ph + poh = 14

24 24 Volumetría Acido-Base No existe otra forma de una reacción tan importante como las reacciones de Neutralización. Las reacciones de neutralización corresponden a la reacción química entre un ácido y una base, dando como únicos productos sal y agua. Una de sus aplicaciones es realizar análisis volumétrico ácido-base que constituye uno de los numerosos tipos de análisis químicos realizados en laboratorios e industrias químicas. La forma experimental de realizar este tipo de análisis se conoce como valoración o titulación ácido-base y corresponde al proceso en el cual se determina la concentración o masa de una base en una solución, por medición del volumen gastado de una solución de ácido de concentración conocida (también puede usarse una solución de concentración conocida de base para determinar la concentración o masa de un ácido). Este análisis da origen a cuatro situaciones posibles: a) Combinación de un ácido fuerte con una base fuerte. b) Combinación de un ácido fuerte con una base débil. c) Combinación de ácido débil con una base fuerte. d) Combinación de un ácido débil con una base débil. Si la titulación se realiza de modo que la solución de concentración conocida es la base, la cual se agrega en forma controlada desde una bureta sobre un matraz erlenmeyer que contiene la solución ácida cuya concentración se va a determinar, a medida que se agrega la base, la concentración de ion H + (ac) en el matraz comienza a disminuir (y el ph a aumentar), hasta que se alcanza el punto final de una titulación o punto de equivalencia, el cual se define como el volumen al cual el número de moles de OH - (ac) agregado neutralizan a todos los moles de ácido presentes, es decir, son iguales. Para apreciar la variación del ph y el punto de equivalencia se usan indicadores, que son sustancias químicas que cambian de color dependiendo del ph en el que se encuentran. Los indicadores utilizados en titulaciones ácido-base, son ácidos orgánicos débiles (indicadores ácidos) y bases orgánicas débiles (indicadores básicos), cuya forma ácida tiene un color diferente de la forma básica. El cambio de color que experimenta el indicador por causa de un cambio en la acidez de una solución se llama viraje del indicador y ocurre en un rango de ph que es propio de cada indicador. La siguiente tabla muestra algunos ejemplos de indicadores: Indicador Zona de viraje ph Cambio de color Azul de timol 1,2-2,8 rojo - amarillo Azul de Bromofenol 3,0-4,6 amarillo - azul Rojo de metilo 4,2-6,3 rojo - amarillo Azul de Bromotimol 6,0-7,6 amarillo - azul Fenolftaleína 8,3-10,0 incoloro - rosado Amarillo de alizarina 10,1-12,1 amarillo - rojo Otra forma de observar la variación del ph es utilizar un medidor de ph (comúnmente llamado peachímetro ) que es un instrumento provisto de un electrodo de vidrio, con una membrana sensible a la concentración de ion hidrógeno, y, un electrodo de referencia que provee un voltaje constante contra el cual se compara el voltaje producido en el electrodo de vidrio.

25 25 Titulaciones de soluciones a partir de un patrón La técnica de la titulación consiste en determinar la composición o concentración exacta de una solución, con ayuda de otra solución de concentración conocida, llamada solución patrón. Para preparar soluciones de concentración exacta se utilizan patrones primarios,. Para que una sustancia sea un patrón primario esta debe cumplir los siguientes requisitos: a) ser de elevada pureza b) ser estable frente a los agentes atmosféricos c) no ser higroscópico, es decir, que no absorba agua del ambiente d) poseer una masa molar grande para disminuir los errores asociados a la operación de pesada e) ser de fácil adquisición y bajo precio El NaOH por ser una base fuerte, reacciona con el dióxido de carbono de la atmósfera, por lo que la superficie de éste se encuentra cubierta de una cantidad variable de carbonato de sodio y además es una sustancia higroscópica. Por estas razones, no es posible preparar una solución de NaOH de concentración exacta sólo por pesada. La concentración de tal solución es aproximada y debe controlarse por titulación con una sustancia que sea un patrón primario. El ftalato ácido de potasio es un patrón primario y puede ser utilizada para titular cualquier solución básica. En el punto final de una Titulación, el número de moles del ácido es igual al número de moles de la base. Como la Molaridad corresponde al número de moles por litro de solución, tenemos que: número de moles = Volumen (L) x Molaridad (mol/l) Por lo tanto, en el punto final de la titulación tendremos: M ácido x V ácido = M base x V base Soluciones Buffer Las soluciones tampón tienen una importancia fundamental en los organismos vivos, ya que ellas mantienen el ph constante en las células y fluidos corporales para que las reacciones bioquímicas procedan exitosamente. Una solución tampón se define como una solución que es capaz de mantener el ph constante por adición de protones (H + ) o iones hidroxilos (OH - ). Un buffer está constituido por un ácido débil y su sal derivada (base conjugada del ácido débil), buffer ácido o por una base débil y su sal derivada (ácido conjugado de la base débil), buffer básico. Una solución amortiguadora debe contener un ácido que reaccione con los iones hidroxilos (OH - ) que puedan agregarse; y también debe contener una base que reaccione con los iones de hidrógeno (H + ) que puedan añadirse. Además, los componentes ácidos y básicos del amortiguador no deben consumirse el uno al otro en una reacción de neutralización. Estos requerimientos se satisfacen por un par ácido-base conjugado (un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado). Si consideramos la siguiente solución buffer constituida por un ácido débil (HA) y una sal derivada del ácido (MA), donde M es el metal. En solución tendremos: HA H + + A - (disociación del ácido débil) MA M + + A - (sal soluble)

26 26 A - + H 2 O HA + OH - (hidrólisis) Lo que hace que estas soluciones actúen como reguladoras del ph es la presencia de estos dos equilibrios simultáneos, en uno de los cuales se producen protones (reacción de disociación del ácido débil) y en el otro iones hidroxilos (reacción de hidrólisis). Por lo tanto, siguiendo el principio de Le Chatelier, si se agrega soluciones ácidas, el primer equilibrio se desplaza hacia la izquierda y el segundo hacia la derecha con el objeto de compensar la alteración producida, y por consiguiente, la variación de ph es mínima. Como debe cumplirse la condición de equilibrio [H + ] [A - ] [H + ] [Sal] K a = = [HA] [Ácido] Si despreciamos la pequeña cantidad del ion A - que hidroliza y la pequeña cantidad del ácido débil que disocia, la [A - ] será igual a la concentración inicial de sal y [HA] será igual a la concentración inicial del ácido. Ordenando tenemos que [H + ] = K a x [Ácido] [Sal] Aplicando el operador p = - log, tenemos ph = pk a + log [Sal] [Ácido] Ecuación que recibe el nombre de Ecuación de Henderson-Hasselbalch, donde (constante de acidez) pk a = - log K a Ejemplo: Calcular el ph de una solución que es 0,1 M en ácido acético y 0,1 M en acetato de sodio (K a = 1, ) [Sal] ph = pk a + log [Ácido] 0,1 ph = 4,75 + log 0,1 ph = 4,75 Así cuando la concentración del ácido es igual al de la sal, el ph es igual al pk a. Estas soluciones presentan dos propiedades interesantes, que las distinguen de otras: Primera Propiedad: La dilución moderada de estas soluciones no afecta al ph. La expresión de ph así lo indica, si se diluye la solución de tal forma que las concentraciones bajan a la mitad de su valor original, la relación entre las concentraciones permanece constante, y por lo tanto, el ph permanece invariable. Segunda Propiedad: La adición moderada de ácidos y bases a estas soluciones, no afectan el ph de las mismas en forma significativa.

27 27 Para situaciones de un buffer constituido por una base débil y su sal derivada de la base, haciendo el mismo análisis anterior se llega a la siguiente relación: poh = pk b + log [Sal] [Base] donde pk b = - log K b (constante de basicidad) Obsérvese que el poh de este tipo de combinaciones es función de las concentraciones de la base y de la sal correspondiente y de la constante de basicidad. Ejemplo: Calcular el ph de una solución que es 0,1 M en amoniaco y 0,1 M en cloruro de amonio (K b = 1, ) poh = pk b + log poh = 4,75 + log [Sal] [Base] 0,1 0,1 poh = 4,75 ph = 14 - poh ph = 14-4,75 ph = 9,25 El rango amortiguador de un buffer corresponde a un rango de ph que va desde (pk a - 1) y (pk a + 1). Por consiguiente, el rango amortiguador de un buffer dependerá de la constante de acidez (tampón ácido) o constante de basicidad (tampón básico). Así, por ejemplo para el buffer acetato (ácido acético - acetato de sodio, K a = 1, ; pk a = 4,74) el rango amortiguador corresponde a 3,74 a 5,74. La capacidad de un tampón para resistir un cambio de ph por adición de protones o iones hidroxilos se conoce como capacidad de amortiguación. Para un buffer ácido, la capacidad amortiguadora depende de la concentración del ácido débil y su sal derivada, a mayor concentración del ácido débil y su base conjugada (sal derivada) mayor será la capacidad amortiguadora. Lo mismo se observa para un buffer básico. La dilución de un buffer no afecta al ph, pero si disminuye la capacidad de amortiguación. La concentración de un buffer corresponde a la suma de la concentración del ácido débil más la concentración de la base conjugada (sal derivada), en un tampón ácido, o la suma de la concentración de la base débil más la concentración del ácido conjugada (sal derivada), en un tampón básico. [Buffer Ácido] = [Ácido] + [Sal] [Buffer Básico] = [Base] + [Sal]

28 28 II.- OBJETIVOS Medir el ph de distintas soluciones y determinar si estas son ácidas ó básicas. Utilizar la técnica de titulación volumétrica. Determinar la concentración de ácido de una muestra problema en solución. Conocer las propiedades de una solución tampón. III.- PARTE EXPERIMENTAL 1) Clasificación de soluciones y medición de ph a) Disponga cada una de estas soluciones en 4 vasos precipitados diferentes y determine el ph a través de dos procedimientos, papel ph y peachímetro. b) De acuerdo al ph encontrado, clasifíquelas como ácida, básica o neutra Vaso Nº Solución 1 Hidróxido de sodio (NaOH) 0,1 M ph papel ph ph peachímetro Clasificación según: ácida, básica o neutra 2 Acido clorhídrico (HCl) 0,1 M 3 Acetato de sodio (CH 3 COONa) 0,1 M 4 Acido acético (CH 3 COOH) 0,1 M 2) Valoración Acido-Base Valoración de una solución de hidróxido de sodio (NaOH) con el patrón primario (ftalato ácido de potasio): a) Para ello arme el sistema de la figura. b) Llene una bureta con la solución de hidróxido de sodio que preparó en el laboratorio Nº2, asegurándose que no quede ninguna burbuja en la bureta. c) Con una pipeta volumétrica agregue exactamente 10 ml de solución de ftalato ácido de potasio 0,1 N (patrón primario) en un matraz erlenmeyer de 250 ml y adicione 2 gotas del indicador (fenolftaleina). Agite suavemente. d) Comience a agregar gota a gota la solución de hidróxido de sodio desde la bureta al matraz erlenmeyer con agitación constante (ver figura) hasta que el indicador muestre un ambiente básico (la solución deberá tener un leve color rosado permanente).

29 29 e) Lea en la bureta el volumen gastado, evitando cometer errores de paralaje. f) Repita el procedimiento desde el punto c y compare los valores obtenidos en ambas valoraciones. g) Registre sus resultados y determine la molaridad de la solución en la siguiente tabla Volumen gastado de NaOH (ml) Molaridad (mol/l) calculada Valoración (1) Valoración (2) 3) Soluciones Buffer Capacidad de amortiguación: efecto de la concentración del ácido y la sal en el buffer a) Prepare 3 tubos de ensayo según lo indicado en la siguiente tabla Tubos de ensayo Acido acético 1M 9 ml 5 ml 1 ml Acetato de sodio 1M 1 ml 5 ml 9 ml b) Agite los tubos y determine el ph de cada tubo usando papel ph. Tubos de ensayo ph c) A los mismos tubos de ensayo agrégueles 20 gotas de Acido Clorhídrico 2 M a cada uno, agitelos y midales el ph a cada tubo usando papel ph y anótelo en la siguiente tabla: Tubos de ensayo ph d) Qué observa al comparar los valores de ph?

30 30 e) Qué tubo mostró mejor capacidad de amortiguación para ácidos? Justifique brevemente. IV.- CUESTIONARIO 1. Se titulan 25 ml de solución de solución de ácido clorhídrico, gastándose 15,35 ml de solución 0,3 M de hidróxido de potasio. Cuál es la concentración molar del ácido? 2. Qué volumen, en mililitros, de una solución de HCl 0,020 M, debe agregarse a 100 ml de una solución de KOH 0,035 M para tener una neutralización completa. 3. Si tiene un buffer formado por acetato de sodio 0,3 M y ácido acético 0,1 M (Ka = 1,78 x 10-5 ). Calcule el ph de esta solución. 4. Cómo afecta la concentración del buffer la capacidad amortiguadora? 5. Si usted varía la concentración del buffer el rango de amortiguación se verá afectado? Explique brevemente.

31 LABORATORIO Nº 4 ENZIMOLOGÍA 31 I. - INTRODUCCIÓN La mayoría de las reacciones químicas que ocurren en los sistemas vivos, si siguieran sus propios mecanismos, ocurrirían demasiado lentas. Se requiere de catalizadores para que estas reacciones transcurran a velocidades que realmente sean útiles para la célula. En los sistemas biológicos, los catalizadores de dichas reacciones químicas son las enzimas. Qué es catálisis? Qué es lo que hace la catálisis? Para entenderlo, consideremos una reacción química simple: A + B C + D Si la reacción ocurre sin interferencia, eventualmente, parecerá como si se detuviera. Lo que sucede realmente es que tanto la reacción directa como la inversa están ocurriendo en el mismo grado. Esto es lo que conocemos como equilibrio químico y podemos expresar su constante de equilibrio: Keq = [ C] [ D] [ A] [ B] Esta constante es característica de la reacción. Un catalizador aumenta la velocidad a la que la reacción se acerca al equilibrio, pero no altera la naturaleza del estado de equilibrio. Otra propiedad importante de los catalizadores es que son muy efectivos en cantidades muy pequeñas, con respecto a las cantidades a catalizar. La Cinética Enzimática, es una rama especializada de la cinética química, que está basada en la teoría cinética de la materia. En esta teoría, se ve que una solución está hecha de un grupo de moléculas y que cada una de ellas se mueve a una velocidad particular. En este movimiento, ellas chocan entre sí, cada colisión involucra una cierta cantidad de energía. Si la colisión no involucra suficiente energía, la reacción no ocurre. Si la energía es suficiente, las moléculas se combinan para formar un intermediario activado, estableciendo un estado de transición. La energía mínima que se requiere para la formación de este intermediario es la Energía de Activación. Esto lo podemos representar mediante: A B* C Esta reacción la podemos graficar de la siguiente manera: Energía de Activación... B* Energía libre Donde B* es el estado de transición Sustrato A Producto C Progreso de la Reacción

32 32 En una reacción catalizada por una enzima, esta actúa agregando pasos a la reacción, de manera que la energía de activación requerida sea menor: Energía de activación..... B* Energía libre Sustrato A ES Producto Donde ES es la unión de la enzima con el sustrato C Progreso de la Reacción Note que en las reacciones catalizadas por enzimas, al reaccionante se le llama sustrato. El cambio de Energía libre ó ΔG, es la diferencia de energía libre que se produce entre el estado inicial (sustrato) y el producto final. Si se observa en los gráficos anteriores, el cambio de energía libre es la distancia entre el estado energético del sustrato y la del producto. Note que, con o sin enzima, los niveles de energía libre inicial y final son los mismos y el ΔG es el mismo, por lo que la termodinámica de la reacción no ha cambiado. La Actividad enzimática de una enzima se determina midiendo la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. La Comisión de Enzimas de la Unión internacional de Bioquímíca ha definido la unidad de enzima como: la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 μmol (micro mol) de sustrato por minuto bajo condiciones definidas En la figura anterior se puede observar la típica evolución de una curva obtenida en un ensayo enzimático. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reacción, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la

33 33 cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reacción), lo que se manifiesta en forma de curva asintótica. Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el período inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. La mayoría de los estudios de cinética enzimática se centran en el período inicial, es decir, en la zona lineal de la reacción enzimática. Sin embargo, también es posible medir toda la curva de la reacción y ajustar estos datos a una ecuación no lineal. Esta forma de medir las reacciones enzimáticas es denominada análisis de la curva de progreso. Existen distintos factores que pueden modificar la actividad enzimática, entre otros: a) Concentración de enzima b) Concentración sustrato c) Temperatura d) ph e) Inhibidores a) Efecto de la Concentración de enzima: Cuando se determina la velocidad inicial de una reacción catalizada por una enzima a distinta concentraciones de ésta, en presencia de concentraciones saturantes de sustrato y manteniendo los otros factores ambientales constantes (temperatura y ph), se establece que la actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la enzima. b) Efecto de la Concentración de Sustrato y velocidad de la reacción: La cinética enzimática comienza a inicios del 1900 con la derivación de la Ecuación de Michaelis-Menten, la que describe la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración de sustrato: k 1 k 3 E + S ES E + P k 2 Se asume que la constante de velocidad de la reacción inversa para k 3 es insignificante y que lo importante son los valores de velocidad inicial. Cuando estamos en velocidad inicial, la cantidad de P es despreciable y, por lo tanto, la reacción inversa, E + P ES, es también despreciable. Las constantes de velocidad se combinan dando la siguiente constante: k2 + k3 Km = k 1 Donde k 1, k 2 y k 3 son constantes de velocidad La velocidad de la reacción queda definida por la siguiente ecuación: V = [ S] V max [ S] + Km Donde V = velocidad de la reacción Vmax = velocidad máxima [S] = concentración de sustrato Km= constante de Michaelis-Menten

34 34 Km es un parámetro cinético muy importante al momento de determinar la actividad de una enzima, ya que indica el grado de afinidad de la enzima por un sustrato. El valor de Km es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato. Un valor alto de Km, indica baja afinidad de la enzima por el sustrato y un valor bajo, una alta afinidad. Gráfico de Velocidad de Reacción versus Concentración de sustrato (V / [S]) La magnitud de Km es un valor característico para la combinación de cada enzima con su sustrato. Al graficar V / [S] se tendrá: V V max V max Km [S] De este gráfico se desprende que la Km corresponde a la concentración de sustrato a la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima. Se pueden distinguir dos fases en la reacción. Una primera fase, en que la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de sustrato, es decir, es de orden uno. Esto ocurre a bajas concentraciones de sustrato, por lo que la enzima no está saturada de sustrato, de manera que si aumentamos la concentración de sustrato, la velocidad aumenta. En la segunda fase, la velocidad de la reacción se vuelve independiente de la concentración de sustrato, es decir, es de orden cero. Esto ocurre cuando la enzima es saturada por el sustrato, de manera que aunque aumentemos la concentración de sustrato, la velocidad se mantiene constante. c) Efecto de la temperatura en la Actividad Enzimática En la mayoría de las reacciones químicas, un aumento de temperatura causa aumento en la velocidad de la reacción, y por ende el número de colisiones efectivas entre las moléculas dado que aumenta la energía cinética de las moléculas participantes de la reacción. Sin embargo, en el caso de las enzimas, hay que considerar su naturaleza proteica, ya que se sabe que un aumento de temperatura produce desnaturalización de las proteínas, lo que se ve traducido en un brusco descenso de la actividad enzimática.

35 35 V Tº Temperatura óptima Para cada enzima hay una temperatura óptima. Para la mayoría de las enzimas de los mamíferos, es de 37 ºC. Para algunas enzimas microbianas, en particular para las bacterias termófilas, la temperatura óptima puede ser superior a los 65ºC. d) Efecto del ph en la Actividad Enzimática Al igual que en el caso de la temperatura, las enzimas poseen un ph o un rango de ph óptimo, en el que su actividad es máxima. Valores mayores o menores a este rango de ph provocan disminución de la actividad. Esto se explica por el hecho de que algunos radicales de los aminoácidos cambian su polaridad a distinto ph, cambiando la conformación de la proteína y de esta manera podemos afectar sitios que son críticos para la actividad enzimática. El ph óptimo de la actividad de una enzima, refleja, generalmente, el ambiente celular en el cuál se encuentra la enzima. Por ejemplo, la Pepsina que hidroliza algunos enlaces peptídicos de proteínas durante la digestión estomacal, tiene un ph óptimo cercano a 1,6 (el rango de ph estomacal fluctúa entre 1 y 2). Por otra parte, la Glucosa fosfatasa del hepatocito, tiene un ph óptimo cercano a 7,8 (el ph intracelular del hepatocito es cercano a 7,2). V 1,6 7,8 ph Método de análisis Como ya se ha visto, las enzimas son proteínas que en los sistemas vivos se encuentran mezcladas entre sí y con muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con exactitud por las reacciones que catalizan, para lo cual es necesario conocer el o los sustratos que utilizan y el o los productos de sus reacciones, además de poseer los métodos analíticos para medirlos.

36 36 También se deben considerar todos los controles experimentales, de manera de descartar cualquier otro artefacto experimental de la reacción que pueda hacer aparecer producto o desaparecer sustrato de forma inespecífica. Los controles más importantes son: a. Blanco Sustrato: Es una mezcla de reacción semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene al sustrato por un volumen equivalente de su solvente. Este volumen puede ser reemplazado por agua o el buffer de la reacción. b. Blanco Enzima: También corresponde a una mezcla semejante a la mezcla en la que se detecta la actividad enzimática, pero en ella se reemplaza la solución que contiene a la enzima por un volumen equivalente de su solvente. Este blanco es importante cuando el sustrato es inestable y se puede obtener producto en ausencia de la enzima. c. Tiempo Cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección de la actividad enzimática. Consiste en que la reacción es detenida en el momento mismo en que se inicia (tiempo cero). Por lo general una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o bien con la de su sustrato. El método analítico para determinar la cantidad de producto formado será a través de un espectrofotómetro. El espectrofotómetro permite determinar la absorción de la luz a determinadazas longitudes de onda, la cual está directamente relacionada con la concentración de los productos. II.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Material de estudio Entre las enzimas que se han conocido desde muy antiguo, se encuentran aquellas que hidrolizan la sacarosa. En 1860, Berthelot purificó una enzima procedente de la levadura y que hidrolizaba la sacarosa, La llamó Ferment inversif. Más recientemente se le ha llamado: invertasa, sucrasa, sacarasa y O-fructofuranosidasa. El sustrato de esta enzima es la sacarosa y se obtiene como productos, glucosa y fructosa. En esta sesión experimental, se usará el procedimiento de análisis a tiempo fijo, que consiste en detener la reacción usando el reactivo 3,5-DNS (ácido 3,5-dínitrosalicílíco) y medir el poder reductor de los productos.

37 37 Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Objetivo: Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de producto obtenido con la Absorbancia. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Reactivos Glucosa y Fructosa 0,005 M Sacarosa 0,6 M TUBOS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5-0,2 ml 0,4 ml 0,8 ml 1,2 ml 1,5 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml 1,0 ml H 2 O destilada 2,0 ml 1,8 ml 1,6 ml 1,2 ml 0,8 ml 0,5 ml 3,5-DNS 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2) Agite levemente los tubos para homogenizar las mezclas. 3) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño a ebullición. 4) Enfríe los tubos en el lavadero con agua fría. 5) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda siguiendo cuidadosamente las instrucciones del profesor. 6) Anote las lecturas en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 [Producto] μmol de Glucosa y Fructosa Absorbancia 0,0 1,0 2,0 4,0 6,0 7,5 0,000 0,006 0,013 0,024 0,038 0,047 7) Realice un gráfico (curva de calibración), Absorbancia versus concentración de producto

38

39 39 Curva de Calibración Absorbancia 0,05 0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0, Concentración Producto (umol)

40 Escuela de Obstetricia y Puericultura 41 Curva de Progreso Objetivo: Determinar el progreso de la reacción en el tiempo. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo RECUERDE: desde que agrega la enzima debe controlar el tiempo. Luego de cumplido, para detener la reacción agregue 2 ml de 3,5 DNS Reactivos Buffer Acetato 0,1M ph: 4,7 Sacarosa 0,6 M Invertasa (Blanco) 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml - Controlar Tiempo 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min - 3,5-DNS 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2 ml 2) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño a ebullición. 3) Enfríe los tubos en el lavadero con agua fría. 4) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo 8 (blanco) 5) Mida las absorbancias de los otros tubos ( del 1 al 7) y anote las lecturas en la siguiente tabla: Tiempo min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min Absorb (540 nm) 6) Con los datos anteriores interpole en la curva de calibración y complete la siguiente tabla: Tiempo 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min 12 min [Producto] 7) Realice un gráfico Tiempo versus concentración de producto. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

41 Escuela de Obstetricia y Puericultura 42 Efecto del ph sobre la Actividad Enzimática Objetivo: Determinar el efecto del ph sobre la actividad enzimática de la Invertasa. Procedimiento: 1) Desarrolle el siguiente protocolo: Buffer Acetato Reactivos 1 1B 2 2B 3 3B 4 4B ph 3,8 1 ml 2 ml ,1 M ph 4, ml 2 ml ph 5, ml 2 ml - - ph 6, ml 2 ml Sacarosa 0,6 M 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Invertasa 1 ml - 1 ml - 1 ml - 1 ml - 2) Incube por 5 minutos a temperatura ambiente. 3) Adicione 2 ml de 3,5 DNS a cada uno de los tubos. 4) Desarrolle el color calentando los tubos durante 5 minutos en baño a ebullición. 5) Enfríe los tubos en el lavadero con agua fría. 6) Seleccione en el espectrofotómetro una longitud de onda de 540 nm. Ajuste a cero el equipo utilizando el tubo blanco ( tubo 1B) 7) Mida la absorbancia del tubo 1 y anote las lecturas en la siguiente tabla. 8) Repita el procedimiento 6) y 7) para los otros ph. Absorbancia ) Con los datos anteriores, interpole los valores de Absorbancia en la curva de calibración para obtener la concentración de producto y complete la siguiente tabla: ph 3,8 4,7 5,2 6,2 [Producto] 10) Grafique ph versus [Producto]. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

42 Escuela de Obstetricia y Puericultura 43 LABORATORIO Nº 5 GLUCOGENÓLISIS I. - INTRODUCCIÓN La molécula de Hidrato de Carbono más importante desde el punto de vista fisiológico es la Glucosa, la cual se clasifica como monosacárido del tipo polihidroxialdehido de baja masa molecular, químicamente corresponde a una aldohexosa, es decir, está formada por 6 átomos de carbono y un grupo aldehído en el carbono uno. En solución acuosa, el grupo carbonilo y los grupos hidroxilo de la glucosa reaccionan intramolecularmente para formar una estructura cíclica de 5 miembros denominada piranosa. CH 2 OH O HO OH OH OH α-d-glucopiranosa Estructura Haworth CHO H OH HO H H OH H OH CH 2 OH Glucosa Estructura Fischer CH 2 OH O OH OH HO OH β-d-glucopiranosa Estructura Haworth Los monosacáridos pueden unirse para formar estructuras mayores, ya sean disacáridos (2 unidades), oligosacáridos (cadenas cortas de unidades) o polisacáridos (cadenas de más de 10 unidades); en todos ellos estas uniones corresponden a enlaces glicosídicos (químicamente enlaces éter). CH 2 OH O HOCH 2 O CH 2 OH O CH 2 OH O OH HO OH O Sacarosa OH HO CH2 OH HO OH OH OH O Maltosa OH (H,OH) Enlaces Glicosídicos La glucosa forma varios tipos de polisacáridos que se diferencian estructuralmente, lo que deriva en que cumplen diversas funciones: Forman parte de los tejidos de sostén de plantas y animales, por ejemplo: la celulosa, el almidón, el algodón, el ADN, etc. Constituyen una fuente importante de energía Con respecto a está última función encontramos el glucógeno; polisacárido formado por varias cadenas que contienen de 12 a 18 unidades de D-glucosas unidas mediante enlaces glicosídicos α (1,4); uno de los extremos de esta cadena se une a la siguiente cadena mediante un enlace α (1,6). Una sola molécula de glucógeno puede contener más de moléculas de glucosa. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

43 Escuela de Obstetricia y Puericultura 44 Los principales lugares destinados para la reserva de glucógeno en animales son el Hígado que puede almacenar aproximadamente 70 g (280 Kcal) de glucógeno y los Músculos Esqueléticos que pueden contener hasta 400 g (1600 Kcal). Sin embargo, este contenido fluctúa notablemente como consecuencia de la alimentación y de los estímulos hormonales, entre otras causas. En el hígado, el glucógeno tiene como misión mantener el nivel de glucosa en la sangre (glicemia) constante. En los músculos, el glucógeno se utiliza para abastecer de energía (ATP) al proceso de contracción muscular. Debido a la estructura tan ramificada del glucógeno, permite la obtención de moléculas de glucosa libre en el momento que se necesiten; éste proceso se denomina Catabolismo del Glucógeno o Glucogenólisis. Para llevar a cabo este proceso se requiere la acción combinada y secuencial de 3 enzimas: Glucógeno Fosforilasa Enzima Desramificante del Glucógeno Fosfoglucomutasa Glucógeno Fosforilasa: Cataliza la denominada Escisión Fosforolítica de los enlaces glicosídicos α (1,4), que consiste en la separación secuencial de restos de glucosa desde el extremo no reductor, según la reacción siguiente n (Glucosa) +Pi n-1 (Glucosa) + Glucosa-1-P Enzima Desramificante del Glucógeno: La glucógeno fosforilasa, no puede degradar los enlaces glicosídicos α(1-6) por lo tanto es la enzima desramificante la encargada de realizar dicha función. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

44 Escuela de Obstetricia y Puericultura 45 Fosfoglucomutasa: Se encarga de transformar la Glucosa-1-P en Glucosa-6-P. Esta es una reacción reversible. Glucosa-1-P Glucosa-6-P Para poder ser liberada al torrente sanguíneo y de este modo regular la glicemia, la Glucosa-6-P debe ser desfosforilada, o sea, debe perder el grupo fosfato, para obtener una glucosa libre mediante la enzima Glucosa-6-fosfatasa Glucosa-6-P + H 2 O Glucosa +Pi En resumen, la regulación del metabolismo del glucógeno en el hígado, se lleva a cabo a través de la concentración de glucosa extracelular. Para mantener la glicemia, el hígado actúa como dador o captador de glucosa, dependiendo de los niveles extracelulares de ella. Las enzimas claves para la regulación de la glicemia son la Glucógeno Fosforilasa y la Glucógeno Sintetasa, ambas enzimas se comportan de acuerdo a la acción de dos hormonas secretadas por el páncreas: el Glucagón y la Insulina que actúan dependiendo de si el organismo se encuentra en condición de hipoglicemia o hiperglicemia. Cuando el nivel de glucosa en la sangre es bajo (hipoglicemia), el glucagón producido por el páncreas activa la acción de la glucógeno fosforilasa, estimulando la degradación del glucógeno en el hígado liberando glucosa al torrente sanguíneo con lo que su concentración aumenta. Por el contrario, cuando el nivel de glucosa sanguínea es alto (hiperglicemia), la insulina producida también en el páncreas activa la acción de la glucógeno sintetasa que estimula la síntesis de glucógeno por lo que la concentración de glucosa libre en la sangre disminuye. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

45 Escuela de Obstetricia y Puericultura 46 La disponibilidad de glucosa es esencial para que la célula pueda realizar correctamente su metabolismo energético. Así, el mantenimiento de una concentración adecuada de glucosa es crucial para el organismo. Un individuo adulto requiere de unos 500 g de hidratos de carbono al día. El glucógeno ingerido en la dieta es degradado en el tubo digestivo por enzimas hidrolíticas, y contribuye de esta manera a los requerimientos energéticos celulares. Frente a una dieta rica en hidratos de carbono, se promueve la acumulación de glucógeno hepático y muscular. II.- OBJETIVOS - Reconocer el efecto de una dieta rica en hidratos de carbono sobre la acumulación de glucógeno hepático en ratas. - Comparar los niveles de glucógeno hepático en ratas sometidas a una dieta rica en hidratos de carbono y en ayuna con respecto a ratas controles. - Determinación de Glucógeno por su reacción con Yodo. III.- PARTE EXPERIMENTAL 1. Animales de experimentación Se utilizaron 3 ratas, las cuales se mantuvieron con pellet comercial y agua ad libitum (libre disposición), a 25º C. 2. Dietas Una de las ratas fue mantenida con dieta glucídica. Para ello, fue alimentada durante los últimos 6 días anteriores a la toma de muestra, con pellet comercial y el agua fue reemplazada por una solución de azúcar al 59% (p/v). La otra fue mantenida en ayuna durante 3 días y agua ad libitum. La tercera rata fue mantenida con dieta normal, es decir, alimentada con pellet comercial y agua ad libitum por un período de 6 días. 3. Obtención de muestras Cada uno de los animales fue anestesiado con éter. Extracción quirúrgica del hígado. Homogenización independientemente de cada hígado en un mortero con arena. Extracción por solvente con aproximadamente 300 ml de Ácido tricloro-acético al 5% p/v. Centrifugación a 3000 rpm por 10 min. obteniendo un sobrenadante correspondiente a cada hígado. Filtración sobre papel filtro y rotulación como filtrado 1, 2 y 3. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

46 Escuela de Obstetricia y Puericultura Curva de Calibración (ó Curva Estándar) Objetivo: - Desarrollar una curva de calibración que permita relacionar la cantidad de sustrato (glucógeno) con la Absorbancia. Procedimiento: a) Desarrolle el siguiente protocolo: - A partir de una solución stock de glucógeno de concentración 0,4 mg/ml realice las diluciones indicadas en la siguiente tabla utilizando una micropipeta: Reactivos [Glucógeno] (0,4 mg/ml) H 2 O destilada TUBOS Blanco Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón ,5 ml 1,0 ml 1,2 ml 1,5 ml 2,0 ml 2,0 ml 1,5 ml 1,0 ml 0,8 ml 0,5 ml Solución de Yodo (Lugol) 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota b) Homogenice las soluciones. c) Determine la Absorbancia de cada tubo, leyendo en espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda (utilice el tubo Nº 1 (blanco) para calibrar el equipo a cero. d) Anote las lecturas en la siguiente tabla: CURVA DE CALIBRACIÓN Patrón 1 Patrón 2 Patrón 3 Patrón 4 Patrón 5 Glucógeno (mg) 0,10 0,20 0,24 0,30 0,40 Absorbancia (540 nm) f) Realice un gráfico (curva de calibración) de Absorbancia versus concentración de Glucógeno. 5. Determinación de glucógeno por método de Yodo 1. Rotule tres tubos de ensayo y adicione a cada uno de ellos 1,0 ml de cada filtrado proveniente de cada corte de hígado que contiene glucógeno usando una micropipeta. 2. Adicione a cada tubo de ensayo 1,0 ml de agua destilada y 1 gota del reactivo de yodo, agite suavemente. 3. Lea la Absorbancia de las muestras en el espectrofotómetro a 540 nm y complete la siguiente tabla: Tubo N Absorbancia 540 (nm) AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

47 Escuela de Obstetricia y Puericultura Con los datos anteriores, interpole los valores de Absorbancia en la curva de calibración para obtener la concentración de glucógeno y complete la siguiente tabla: [Glucógeno] Deduzca, según los resultados obtenidos, el tipo de dieta a la que fue sometida cada rata y cual le corresponde a cada filtrado: Filtrado I: Filtrado II: Filtrado III: 6. Exprese el contenido de glucógeno (en mg) por cada 100 ml de filtrado de tejido hepático extraido a cada rata en estudio: Rata con dieta normal: Rata con ayuno: Rata con dieta glucocídica: AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

48 Escuela de Obstetricia y Puericultura 49 LABORATORIO Nº 6 COLESTEROL I. - INTRODUCCIÓN Las grasas (o lípidos) son los compuestos con los que el cuerpo humano almacena energía para las épocas de carencia. Evolutivamente, el cuerpo humano es almacenador de energía, es decir, está diseñado para acumular parte de la energía que absorbe por los alimentos para épocas de ayuno. La forma más eficaz de almacenar esta energía es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo que en poco peso de grasa se puede acumular mucha energía. Los lípidos se clasifican en dos grupos principales: simples y complejos. Los lípidos simples más importantes son el colesterol y los ácidos grasos; dentro de los lípidos complejos se pueden mencionar los fosfolípidos y los triglicéridos. El colesterol es una grasa presente en todas las células del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la médula espinal, páncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en el higado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50% de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hígado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal presentes en la dieta. En la molécula de colesterol se puede distinguir una cabeza polar constituida por el grupo hidroxilo y una cola o porción apolar formada por los distintos ciclos y los sustituyentes alifáticos. Así, el colesterol es una molécula hidrofóbica que al igual que otros lípidos es bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo, acetona y éter. Considerando lo anterior, cualquier método de extracción de lípidos requiere utilizar mezclas de solventes orgánicos que permitan solubilizar todos los lípidos y precipiten proteínas e hidratos de carbono para su mejor separación. Los organismos mamíferos obtienen colesterol a través de dos vías: Vía exógena o absorción de colesterol contenido en los alimentos. El colesterol se encuentra exclusivamente en alimentos de origen animal, mayoritariamente en la yema de huevo, higado, lácteos, cerebro (sesos) y músculo esquelético (carnes rojas). Vía endógena o síntesis de colesterol en las células animales a partir de su precursor, el acetato, en su forma activada acetil-coenzima A. La producción de colesterol es regulada directamente por la concentración del colesterol presente en las células, habiendo una relación inversa con los niveles plasmáticos de colesterol. Una alta ingesta de colesterol en los alimentos conduce a una disminución neta de la producción endógena y viceversa. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

49 Escuela de Obstetricia y Puericultura 50 Además del papel en la reserva energética que cumple el colesterol, es imprescindible para la vida por numerosas funciones: Estructural: es un componente muy importante de las membranas plasmáticas de los animales (en general, no existe en los vegetales). Precursor de la vitamina D: esencial en el metabolismo del calcio. Precursor de hormonas sexuales: progesterona, estrógenos y testosterona. Precursor de las sales biliares: esenciales en la absorción de algunos nutrientes lipídicos y vía principal para la excreción de colesterol corporal. El mayor inconveniente que tiene la grasa es que no se disuelve en agua, y por lo tanto, no puede transportarse como tal por el torrente sanguíneo. Para poder transportar las partículas de grasa, el cuerpo utiliza unas moléculas más complejas llamadas lipoproteínas, que están formadas por una parte proteica y una parte lipídica compuesta por distintos tipos de grasas. Existen varios tipos de lipoproteínas en función del contenido proteico y lipídico que contienen. Los dos tipos de lipoproteínas que contienen colesterol son: LDL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apob. Es la forma en que el organismo recoge el colesterol del hígado (donde lo sintetiza) y lo distribuye a los tejidos. El 70% del colesterol que circula por la sangre lo hace en forma de LDL-colesterol. Éste es el colesterol malo, responsable de la aterosclerosis, o acumulación del colesterol en la pared de las arterias. HDL: compuestas principalmente por colesterol y una proteína llamada apoa. Estas partículas contienen el denominado colesterol bueno, porque transportan el exceso de colesterol desde los tejidos hasta el hígado. Actualmente se reconoce ampliamente el papel causal del colesterol presente en las lipoproteínas de baja densidad (LDL) en la patogenia de la aterosclerosis. De esta manera, la existencia sostenida de niveles elevados de colesterol LDL (popularmente conocido como colesterol malo ) por encima de los valores recomendados, incrementa el riesgo de sufrir eventos cardiovasculares (principalmente infarto de miocardio agudo). De manera interesante, el colesterol presente en las lipoproteínas de alta densidad (HDL) ejercería un rol protector del sistema cardiovascular, que por ello se conoce como colesterol bueno. La concentración actualmente aceptada como normal de colesterol en el plasma sanguíneo llamada colesterolemia de individuos sanos es de 150 a 200 mg/100 ml. Se ha definido clínicamente que los niveles de colesterol plasmático total (suma de colesterol presente en todas las clases de lipoproteínas) recomendados por la Sociedad Norteamericana de Cardiología (AHA) son: Colesterolemia por debajo de 200 mg/dl: es la concentración deseable para la población general, pues por lo general correlaciona con un bajo riesgo de enfermedad cardiovascular. Colesterolemia entre 200 y 239 mg/dl: existe un riesgo intermedio en la población general, pero es elevado en personas con otros factores de riesgo como diabetes. Colesterolemia mayor de 240 mg/dl: puede determinar un alto riesgo cardiovascular y se recomienda iniciar un cambio en el estilo de vida, sobre todo en lo concerniente a la dieta y al ejercicio físico. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.

50 Escuela de Obstetricia y Puericultura 51 La aterosclerosis es un fenómeno muy complejo, que comienza en las primeras etapas del desarrollo y se prolonga durante años. Consiste en el depósito de células cargadas de partículas de LDLcolesterol en las paredes de las arterias. Esta pared responde a la agresión induciendo una respuesta protectora, que finalmente conduce a la formación de una placa. Con el paso del tiempo, la placa aumenta de tamaño, hasta que estrecha la arteria dificultando la circulación de la sangre. Por otra parte, la placa también se puede romper, originando un trombo que puede obstruir completamente la arteria. El final del proceso es que el corazón se ve privado de oxígeno y nutrientes por lo que se produce una angina o infarto de miocardio. La aterosclerosis está directamente relacionada con la concentración de partículas de LDLcolesterol presentes en la sangre, por lo que la prevención pasa por disminuir al máximo el nivel de LDL y aumentar el HDL-colesterol, que es el que retira el colesterol circulante y lo devuelve al hígado. La forma de conseguir estos objetivos es adoptar hábitos de alimentación adecuada, realizar ejercicio físico habitualmente y cuando esto no es suficiente, se debe recurrir a fármacos específicos. En este trabajo práctico estudiaremos el contenido de colesterol contenido en la yema de huevo de gallina. La yema representa entre el 30 40% del peso total del huevo y la cantidad de colesterol aproximada (por yema de huevo) es de 250 mg. II.- OBJETIVOS - Conocer un método efectivo de extracción de lípidos con solventes orgánicos. - Determinación de colesterol presente en la yema de huevo. AUTORES: Alejandra Moreno O.; Roberto Bravo M.