NUEVA DISTRIBUCIÓN DE DISCOGRAMAS BRITANIA

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1 NUEVA DISTRIBUCIÓN DE DISCOGRAMAS BRITANIA Sistema de multidiscos utilizados para pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos (antibiogramas). Para uso de diagnóstico in vitro. INTRODUCCIÓN La prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión con discos permite categorizar a las bacterias aisladas en un proceso infeccioso en: sensible, resistente o de sensibilidad intermedia a una gran variedad de agentes antimicrobianos. Para realizar la prueba, discos o multidiscos de papel de filtro impregnados con una cantidad específica del agente antimicrobiano, se aplican sobre la superficie de un medio con agar que ha sido inoculado con el microorganismo en ensayo. La droga en el disco, difunde a traves del agar. A medida que la concentración de agente antimicrobiano se aleja del disco disminuye en forma logarítmica, creando un gradiente del antibiótico en el medio con agar alrededor del disco. Concomitantemente con la difusión de la droga, la bacteria que fue inoculada en la superficie del medio de cultivo y no fue inhibida por la concentración del agente antimicrobiano, continúa multiplicandose y formando un crecimiento visible. En las áreas donde la concentración de la droga es inhibitoria, no hay crecimiento, formando una zona de inhibición alrededor de cada disco. El tamaño de la zona de inhibición está influenciado por la difusión del agente antimicrobiano a través del agar y varía con las diferentes drogas. El tamaño de la zona, sin embargo, es inversamente proporcional a la CIM (Concentración Inhibitoria Mínima). Los criterios recomendados para interpretar los diámetros de las zonas de inhibición, se observan en las tablas de las pruebas de sensibilidad. El método estandarizado recomendado por el Subcomité de pruebas de Sensibilidad a los Antimicrobianos de la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standars) se basa en el método originalmente descripto por Kirby Bauer y cols. Los sistemas de multidiscos utilizados para las pruebas de susceptibilidad a los agentes antimicrobianos, se encuentran ampliamente difundidos, constituyendo una herramienta útil para la elección de una quimioterapia antimicrobiana adecuada. A fin de asegurar su correcto desempeño, se ha unificado criterio con las autoridades sanitarias en cuanto al número y distribución de discos presentes en los sistemas. Por tal motivo, presentamos las nuevas series de discogramas Britania, conteniendo cada serie, seis antimicrobianos para ser usado en placas de Petri de 90 mm. La distancia, ha sido establecida en 24 mm de centro a centro respetando una distancia igual o superior a 14 mm entre disco y borde de la placa. La elección de los antimicrobianos en las distintas series de discogramas, se basa en recomendaciones nacionales e internacionales, tomando como base los estudios de resistencia bacteriana y las drogas presentes en nuestro país. Caja conteniendo 25 y 50 discogramas según el siguiente detalle, con seis antimicrobianos cada serie. SERIE IU AMBULATORIA CIP 5 µg Ciprofloxacina AMN 10 µg Ampicilina CEF 30 µg Cefalotina NIT 300 µg Nitrofurantoina AMS 10/10 µg Ampicilina Sulbactama TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima Sulfametoxazol SERIE IU HOSPITALARIA AKN 30 µg Amicacina TAZ 100/10 µg Piperacilina Tazobactama CAZ 30 µg Ceftacidima CTX 30 µg Cefotaxima GEN 10 µg Gentamicina OFX 5 µg Ofloxacina

2 SERIE IU ADULTO NOR 10 µg Norfloxacina GEN 10 µg Gentamicina CEF 30 µg Cefalotina NIT 300 µg Nitrofurantoina AMS 10/10 µg Ampicilina Sulbactama TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima Sulfametoxazol SERIE PARA ESTAFILOCOCOS GRUPO A PEN 10 U Penicilina OXA 1 µg Oxacilina ERY 15 µg Eritromicina CLI 2 µg Clindamicina TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima sulfametoxazol VAN 30 µg Vancomicina SERIE BACILOS GRAM NEGATIVOS BGN 1 IMP 10 µg Imipenem GEN 10 µg Gentamicina CAZ 30 µg Ceftacidima AMS 10/10 µg Ampicilina Sulbactama CTX 30 µg Cefotaxima TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima Sulfametoxazol SERIE BACILOS GRAM NEGATIVOS BGN 3 AZT 30 µg Aztreonam PIP 100 µg Piperacilina CMP 30 µg Cloranfenicol C/S 75/30 µg Cefoperazona sulbactama COL 10 µg Colistina CXM 30 µg Cefuroxima SERIE IU PEDIÁTRICO CEF 30 µg Cefalotina GEN 10 µg Gentamicina AMS 10/10 µg Ampicilina Sulbactama TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima Sulfametoxazol CTX 30 µg Cefotaxima NIT 300 µg Nitrofurantoina SERIE PARA ESTAFILOCOCOS GRUPO B LEV 5 µg Levofloxacina GEN 10 µg Gentamicina RFA 5 µg Rifampicina MIN 30 µg Minociclina CMP 30 µg Cloranfenicol TEI 30 µg Teicoplanina SERIE BACILOS GRAM NEGATIVOS BGN 2 MEM 10 µg Meropenem CIP 5 µg Ciprofloxacina TAZ 100/10 µg Piperacilina Tazobactama FEP 30 µg Cefepime CEF 30 µg Cefalotina AKN 30 µg Amicacina SERIE PARA COPROCULTIVO AMN 10 µg Ampicilina CIP 5 µg Ciprofloxacina TMS 1.25/23.75 µg Trimetoprima Sulfametoxazol CMP 30 µg Cloranfenicol FUR 100 µg Furazolidona CTX 30 µg Cefotaxima Todos los antimicrobianos presentes en las series de discogramas, se encuentran también disponibles en su presentación individual como monodiscos, en tubos de 50 y 200 unidades MATERIALES NECESARIOS NO PROVISTOS PARA EL USO CON EL PRODUCTO SUMINISTRADO (DISCOGRAMAS) Medios de cultivo, reactivos, microorganismos de control de calidad y equipo de laboratorio necesario, descriptos en el procedimiento para realizar la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión con discos. Además se debe preparar un testigo de turbidez 0.5 de la escala de Mc Farland añadiendo 0.5 ml de M BaCl 2 [( 1.5 % p/v BaCl 2-2H 2 O)] a 99.5 ml de 0.36 N H 2 SO 4 [ 1% Vol/Vol]. Verifique usando un espectrofotómetro con un haz de luz de 1 cm y la cubeta correspondiente a la absorción de la muestra. Esta deberá ser a 625 nm para el estándar 0.5 de Mc Farland. PRECAUCIONES Es necesario asegurarse que los monodiscos y/o multidiscos que se emplean reúnan las siguientes condiciones. a- Que tengan 6 mm de diámetro. b- Que no hayan expirado en su fecha de vencimiento. c- Que se encuentren convenientemente refrigerados y protegidos de un exceso de humedad. Los discos que contienen antibióticos de las familias de las penicilinas ( por ejemplo penicilina, ampicilina, oxacilina, piperacilina), cefalosporinas (por ejemplo cefalotina, cefotaxima, cefuroxima, ceftacidima, etc.), carbapenems y monobactamas deben conservarse

3 entre 20 ºC y 0 ºC para mantener su potencia, excepto la pequeña cantidad necesaria para el trabajo semanal o transporte al usuario que puede mantenerse refrigerada entre 2 8 ºC, por un tiempo preferentemente no mayor a siete días. PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS Técnica (adaptada de Bauer, Kirby y cols). 1. PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CON EL MEDIO DE CULTIVO: a) Medio: el medio a utilizar es el agar de Müeller-Hinton (no debe emplearse otro medio). Debe controlarse que el ph del mismo se encuentre entre 7.2 y 7.4. b) Volumen del medio por placa: debe verterse 25 a 30 ml de agar fundido y enfriado a C en placas estériles de vidrio o plástico, de modo de obtener una capa de 4 mm de alto. Es fundamental respetar esta condición, pues de lo contrario, se obtendrán halos mayores o menores según el caso. c) Secado de las placas: para eliminar la humedad sobre la superficie del medio, las placas deben secarse incubándolas a C durante minutos. d) Condiciones de los cultivos originales: es necesario que el antibiograma se realice a partir de cultivos monomicrobianos o, cuando menos, con colonias bien separadas del mismo aspecto, de la placa de aislamiento. No tiene sentido efectuar antibiogramas con materiales directos que segura o potencialmente contengan flora plurimicrobiana (exudados faríngeos, nasales, orina, heces, etc.). Debe tenerse en cuenta que el método de Bauer y Kirby, se aplica a bacilos Gram negativos de fácil desarrollo (Enterobacteriaceae, Pseudomonas, etc.), Staphylococus y Enterococcus, no pudiendo ser utilizado sin modificaciones para determinar la susceptibilidad in vitro frente a otros gérmenes. Las pruebas de difusión por el método de los discos para H. influenzae, N. gonorrhoeae y S pneumoniae, se deben realizar de acuerdo a las normas NCCLS vol. 20 N 1 (2000). Documento M2-A7. Otras bacterias "fastidiosas" pueden ser ensayadas por el método de dilución (documento M7-A5 / 2000). e) Preparación del inóculo: se toman de 3 a 5 colonias del cultivo original con un ansa de nichrome y se introducen en 5 ml de Caldo Tripteína soja. Si la suspensión obtenida tiene una turbidez superior o similar a la del testigo, no es necesaria una incubación ulterior. De lo contrario, los tubos se incuban a C hasta lograrse la turbidez requerida. En ambos casos, si es necesario, diluir para equiparar la suspensión a la del testigo; puede utilizarse para ello, caldo o solución salina. Para Staphylococcus y microorganismos fastidiosos puede usarse el método directo a partir de la colonia aislada. f) Siembra en placas: la suspensión bacteriana obtenida como se indica en el punto e), es absorbida con un hisopo de algodón (no debe usarse asa metálica ni varilla de vidrio). El exceso de líquido se descarta oprimiendo el algodón contra la pared del tubo. Para inocular las placas, se aplica el hisopo sobre la superficie de las mismas, efectuando estrías en direcciones diferentes. Se dejan secar las placas durante unos cinco minutos antes de proceder a aplicar los discos. g) Condiciones de los discos: Es necesario cumplir con los puntos escritos en PRECAUCIONES. Es de fundamental importancia tener en cuenta, que este método solamente tiene valor si se respeta una distancia que separe los discos, suficiente para limitar las probabilidades de superposición importante de zonas de inhibición. Por consiguiente, pueden aplicarse SOLAMENTE 6 DISCOS EN UNA PLACA CONVENCIONAL DE 100 mm (la usada comúnmente en nuestro medio). No es conveniente exceder el número máximo de discos por placa ya que, de lo contrario, los halos correspondientes a la inhibición provocada por antibióticos, pueden interferir con los de los discos vecinos, pudiendo ocurrir tanto sinergismos como antagonismos que no corresponden a la realidad. En consecuencia, los "discos múltiples en ruedas" que exceden el número de 6 discos para placas comunes de 100 mm resultan inadecuados. h) Aplicación de los discos: se aplican los multidiscos sobre la superficie del agar por medio de una pinza. Se debe tener el cuidado, que los discos hagan buen contacto con la superficie del agar, ejerciendo para ello, ligera presión sobre los mismos. Transcurridos 15 minutos de la colocación de los discos, las placas se incuban invertidas en la estufa a 35 ºC durante toda la noche (18 hs). i) Medidas de las zonas de inhibición: no deben efectuarse lecturas de los antibiogramas basándose en la sola consideración de la presencia o la ausencia del halo de inhibición. En todos los casos deben tomarse en cuenta, los diámetros de los halos, ya que éstos varían según la difusibilidad del antibiótico. Así, un halo pequeño (12 mm) para la colistina, antibiótico poco difusible, representa sensibilidad,

4 en tanto que ese mismo diámetro para el cloranfenicol, indica resistencia. Para medir los halos debe emplearse un calibre o una reglilla calibrada. Cuando se leen los resultados en cepas que crecen con desarrollo invasor (Proteus mirabilis o vulgaris), hay que tomar la precaución de ignorar el ligero velo de crecimiento invasor, midiendo para ello el halo a partir de donde se detiene el desarrollo confluente. Algunos antibióticos inhiben el desarrollo invasor y otros no lo hacen. Si el microorganismo en ensayo es Staphylococcus o Enterococcus, se necesitan 24h de incubación para vancomicina y oxacilina. j) Significado de las colonias que aparecen dentro de los halos: cuando aparecen colonias aisladas dentro del halo de varios antibióticos con diferente mecanismo de acción (por ej., cloranfenicol, fosfomicina y gentamicina) ello generalmente corresponde a cultivos impuros, consecuentes a fallas en el aislamiento. Si se comprueba que efectivamente se trata de una mezcla, deben efectuarse antibiogramas por separado para cada una de ellas. Si la presencia de colonias dentro de los halos ocurre alrededor de los discos de un solo antibiótico o de antibióticos muy relacionados (por ej., penicilina y ampicilina) ello suele obedecer a la existencia de bacterias previamente resistentes en la población usada como inóculo. La prudencia aconseja interpretar tales casos como resistencia y sugerir la determinación de una concentración inhibitoria o bactericida mínima, para el caso en que se desee administrar el antibiótico en cuestión. k) Interpretación de los resultados: conocidos los diámetros para cada antimicrobiano ensayado, puede concluirse que el germen es sensible, de sensibilidad intermedia o resistente, de acuerdo a la tabla publicada por N.C.C.L.S. M2-A7 Vol. 20 N 1 (2000). Para los antibióticos introducidos luego de la aparición de la publicación mencionada, deben consultarse trabajos en los que se haya respetado la metodología de los autores y en los que se efectuaron determinaciones de la concentración inhibitoria mínima y establecidas convenientemente las curvas de regresión. l) Control: es conveniente utilizar quincenalmente controles, con cepas, para las cuales los halos de inhibición son conocidos, lo que permite evaluar la calidad de los medios de cultivo, discos (incluida su conservación) y la metodología utilizada. Dichas cepas son E. coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC y Pseudomonas aeruginosa ATCC El contenido de timidina del medio de Müeller-Hinton debe controlarse con discos de TMS frente a Enterococcus faecalis ATCC Para evaluar combinaciones de beta lactámicos inhibidores de beta lactamasa se usa E. coli ATCC Importante La categoría intermedia debe ser informada. Las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) para estos casos, se aproximan a los que se obtienen en niveles sanguíneos y tisulares y las respuestas, pueden ser bajas para las cepas aisladas. La categoría intermedia, implica aplicación clínica en sitios donde los antimicrobianos se concentran (por ej.: quinolonas y betalactámicos en orina) o cuando se pueden usar altas concentraciones del antibiótico (por ej.: betalactámicos). La categoría intermedia, también indica una zona buffer o reguladora, que suele prevenir algunos factores técnicos de descontrol que causarían discrepancias en la interpretación, especialmente cuando las drogas tienen un estrecho margen de farmacotoxicidad. CRITERIOS DE INTERPRETACIÓN BASADOS EN EL MÉTODO DE KIRBY-BAUER DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD PARA MICROORGANISMOS DE FÁCIL CRECIMIENTO Agente Antimicrobiano BETALACTÁMICOS, PENICILINAS Ampicilina Enterobacteriaceae Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos Contenido del disco 10 µg 10 µg 10 µg 10 µg Diámetro de la zona de inhibición en mm Resistente Sensible Intermedio < ó = > ó = Oxacilina Estafilococos coagulasa negativo S.aureus Neumococos para evaluar sensibilidad a penicilina 1 µg 1 µg 1 µg

5 Penicilina G Estafilococos Enterococos Estreptococos β hemolíticos Piperacilina Pseudomonas aeruginosa Enterobacteriaceae 10 U 10 U 10 U 100 µg 100 µg COMBIN. CON INHIBIDORES B-LACTAMASA Amoxicilina / Acido Clavulánico Estafilococos Enterobacteriaceae 20/10 µg 20/10 µg Ampicilina / Sulbactama 10/10 µg Piperacilina / Tazobactama Enterobacterias Pseudomonas aeruginosa Esfafilococos meticilina S CEFALOSPORINAS CARBAPENEMS MONOBACTAMAS GLICOPÉPTIDOS 100/10 µg 100/10 µg 100/10 µg Cefaclor 30 µg Cefazolina 30 µg Cefepime 30 µg Cefixima 5 µg Cefoperazona 75 µg Cefotaxima 30 µg Cefoxitina 30 µg Ceftacidima 30 µg Ceftixozima 30 µg Ceftriaxona 30 µg Cefuroxima sódica parenteral 30 µg Cefalotina 30 µg Imipenem 10 µg Meropenem 10 µg Aztreonam 30 µg Teicoplanina 30 µg Vancomicina Enterococos Estafilococos 30 µg 30 µg AMINOGLUCÓSIDOS Amicacina 30 µg Gentamicina 10 µg Kanamicina 30 µg

6 Netilmicina 30 µg MACRÓLIDOS Azitromicina 15 µg Claritromicina 15 µg Eritromicina 15 µg TETRACICLINAS Minociclina 30 µg Tetraciclina 30 µg QUINOLONAS OTROS ANTIMICROBIANOS Ciprofloxacina 5 µg Levofloxacina 5 µg Nalidixico Acido 30 µg Norfloxacina 10 µg Ofloxacina 5 µg Trovafloxacina 10 µg Cloranfenicol 30 µg Clindamicina 2 µg Fosfomicina Trometamol 200 µg Nitrofurantoína 300 µg Rifampicina 5 µg Sulfonamidas 300 µg Trimetoprima Sulfametoxazol 1.25/23.75 µg PARA LOS SIGUIENTES ANTIMICROBIANOS QUE NO FIGURAN EN LAS NORMAS N.C.C.L.S. (2000) SE HAN CONSULTADO INFORMES DE OTRAS SOCIEDADES CIENTIFICAS Y PUBLICACIONES DE INVESTIGADORES ARGENTINOS Y EXTRANJEROS Cefoperazona/Sulbactama 75/30 µg Colistina 10 µg Fosfomicina 50 µg Fusídico Acido 10 µg Neomicina 30 µg Pipemídico Acido 20 µg Polimixina B 300 U Observaciones 1) Las zonas de inhibición obtenidas con aminoglucósidos, particularmente cuando se ensaya P. aeruginosa dependen del contenido de cationes divalentes del medio de cultivo. Estos estándares de interpretación sólo deben ser usados con agar de Müeller-Hinton cuya eficacia haya sido aprobada previamente con la cepa control de P. aeruginosa ATCC Los organismos que entran en la categoría de

7 sensibilidad intermedia, pueden ser sensibles o resistentes cuando se ensaya por métodos de dilución y deberán ser clasificados por lo tanto, como de sensibilidad "indeterminada". 2) El criterio de interpretación para ampicilina, también debe ser usado para interpretación de ampicilina + sulbactama y amoxicilina + ácido clavulánico, cuando se ensayan enterococos, estreptococos no enterococos y otras bacterias Gram positivas. 3) Las cepas resistentes de S. Aureus, producen beta lactamasa y el ensayo debe realizarse preferiblemente con el disco de 10 U de penicilina G. La penicilina G, debe usarse para ensayar la sensibilidad de todas las penicilinas susceptibles a la penicilinasa, tales como: ampicilina, amoxicilina, azlocilina, bacampicilina, hetacilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina. Los resultados pueden aplicarse a fenoximetilpenicilina o feniticilina. 4) El disco de ampicilina representa además a amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina y hetacilina. 5) Cuando un enterococo, entra en la categoría de sensible para penicilina o ampicilina, implica la necesidad de realizar la terapia con altas dosis para las infecciones graves por este microorganismo. La endocarditis, por ejemplo, requiere terapia combinada con altas dosis de penicilina o ampicilina o teicoplanina o vancomicina más gentamicina o estreptomicina, para tener acción bactericida. La detección de la resistencia a penicilina o ampicilina en cepas de enterococos, debida a la producción de betalactamasas, no es posible usando una concentración de inóculo similar a la recomendada para la prueba rutinaria de difusión o dilución. Se usa la técnica de nitrocefin con un inóculo cargado con la colonia directamente. La sinergia entre ampicilina y penicilina y un aminoglucósido, se realiza mejor evaluando la sensibilidad a 500 o 2000 ug de gentamicina o 2000 ug de estreptomicina por ml. Los casos aislados de infecciones urinarias, deben ser considerados sensibles a ampicilina solamente. 6) Las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en pacientes granulocitopénicos e infecciones severas en otros pacientes, deben ser tratadas con el máximo de dosis de penicilinas seleccionadas por su actividad antipseudomonas (carboxi o acilaminopenicilinas o ceftazidima) en combinación con un aminoglucósido. 7) El disco de 30 ug de cefazolina, no es adecuado para predecir la sensibilidad de otras cefalosporinas de primera generación. El disco representativo es el de cefalotina 30 ug que representa además a cefapirina, cefradina, cefalexina, cefadroxilo y cefaclor. 8) Si las cepas de S. aureus muestran resistencia a una de las penicilinas resistentes a la penicilinasa (MRSA) como meticilina u oxacilina, debe informarse resistente a cefalosporinas y a otros beta-lactámicos nuevos como imipenem, ampicilina o amoxicilina asociados a inhibidores de betalactamasa, etc., independientemente del resultado obtenido in vitro. Esto es debido a que en la mayoría de los casos documentados de infecciones causadas por S. aureus meticilina resistente, el paciente responde mal a la terapia cefalosporínica o todavía existe falta de confirmaciones de la eficacia clínica de las combinaciones con ácido clavulánico o sulbactama y con imipenem. Staphylococcus spp. coagulasa negativo, meticilina resistente, también parecen responder mal a las anteriores drogas citadas. 9) Tetraciclina es la clase de disco para todas las tetraciclinas y los resultados pueden ser aplicados a clortetraciclina, demeclociclina, metaciclina, minociclina y oxitetraciclina. Sin embargo, ciertos organismos son más sensibles a doxiciclina, y minociclina (algunos estafilococos y Acinetobacter). 10) Debe usarse oxacilina como droga clase de penicilinas antiestafilocócicas resistentes a la betalactamasa, debido a que es más resistente a la degradación durante su conservación y puede ser aplicada para evaluar la sensibilidad de neumococos y además para detectar más fácilmente las cepas heterorresistentes. Los resultados con el disco de oxacilina pueden extenderse a meticilina, cloxacilina y dicloxacilina (esta última es la única que se comercializa en Argentina). No debe usarse disco de cloxacilina pues no detecta bien las cepas de S. aureus meticilino resistentes. Cuando se obtiene un resultado de intermedio con estafilococos, las cepas deben ser investigadas para detectar si hay heterorresistencia. 11) El disco de clindamicina se usa para ensayar sensibilidad a clindamicina y lincomicina. 12) El disco de sulfisoxazol puede ser usado para cualquiera de las sulfonamidas disponibles comercialmente. Los medios que contienen sangre, excepto los que contienen sangre de caballo lisada, no son adecuados para ensayar sulfonamidas. El agar de Müeller-Hinton debe estar libre de timidina para evaluar a sulfonamidas y/o trimetoprima. La efectividad del agar de Müeller-Hinton para el ensayo de TMS, debe controlarse con la cepa de Enterococcus faecalis ATCC Una zona de inhibición de > 20 mm libre de pequeñas colonias, indica niveles bajos o nulos de timina y timidina. 13) Los datos de la prueba de sensibilidad para cinoxacina, ácido nalidíxico, nitrofurantoína, norfloxacina y sulfonamidas, se aplica sólo a

8 microorganismos aislados de infecciones urinarias. 14) Los métodos de rutina descriptos para patógenos de rápido crecimiento, no son generalmente aceptados para organismos de difícil crecimiento: Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Streptococcus pneumoniae. Para evaluar estos microorganismos, deben consultarse los métodos descriptos en el Manual del NCCLS Vol. 20 N 1 Documento M2-A7 (enero 2000). 15) La confirmación de la resistencia intrínseca a la oxacilina, puede efectuarse inoculando el microorganismo en una placa de agar Müeller-Hinton suplementada con 4% de cloruro de sodio y 6 µg/ml de oxacilina. Se inocula el agar en un cuadrante o con un toque spot test usando un hisopo que se ha sumergido en una suspensión equivalente al estándar 0.5 de Mc Farland y del cual ha sido eliminado el exceso de líquido. Se debe incubar 24 hs. a 35 C y leer para verificar la presencia de algún desarrollo; el crecimiento implica resistencia intrínseca a la oxacilina. Este método ha sido usado extensivamente con S. aureus pero la experiencia con estafilococos coagulasa negativo, ha sido similar. 16) De las ureidopenicilinas presentes en nuestro país, piperacilina es la de mayor actividad. Este tipo de antimicrobiano, sufre un considerable "efecto inóculo", o sea que si se aumenta la concentración del inóculo, aumenta en forma desproporcionada la CIM, la que se traduce en halos dentro del rango de resistencia, o ausencia de halos en cepas previamente sensibles. Este efecto se atribuye a la inestabilidad de las drogas frente a altas concentraciones de betalactamasas. ) El disco de cefotaxima, representa al grupo de antimicrobianos conocidos como aminotiazolmetoximinocefalosporinas y si bien el disco contiene la de primera aparición en el mercado, de ninguna manera debe suponerse que implica preferencia por este antimicrobiano y el informe al médico, debe indicar el mismo resultado para cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona. Estos antimicrobianos son poco efectivos frente a Pseudomonas aeruginosa y a diferencia de lo que ocurre con enterobacterias, las CBM suelen ser superiores a la CIM, por lo que se sugiere consignar como sensibles, aquellas cepas que entren de lleno en el rango de sensibilidad. La actividad in vitro de cefotaxima, ceftizoxima y ceftriaxona son análogas; las diferencias en la CIM son mínimas o inexistentes, cuando se presentan, no suelen superar el valor de una dilución y por ende, los diámetros de los halos de inhibición por el método de los discos son superponibles. Tales drogas difieren únicamente en sus propiedades farmacocinéticas. 18) Ceftacidima es una carboxipropiloximinocefalosporina y presenta frente a enterobacterias, la misma actividad que los aminotiazolmetoximinocefalosporinas; sin embargo, es considerablemente más activa frente a Pseudomonas aeruginosa. 19) Cefoperazona es menos activa que las restantes cefalosporinas de tercera generación sobre varias enterobacterias, particularmente Klebsiella debido a su mayor labilidad a las enzimas plasmídicas TEM y SHV. Tiene buena actividad sobre Pseudomonas aeruginosa. 20) Cefixima tiene una actividad semejante, pero no igual a cefotaxima y tiene la ventaja de su administración oral. 21) La sensibilidad y resistencia a azitromicina, claritromicina y diritromicina se puede predecir ensayando eritromicina. 22) La difusión en agar de la colistina y de la polimixina B es deficiente, por lo que la precisión del método de difusión es menor que en el caso de otros antibióticos. En los casos necesarios, conviene confirmar los resultados de la prueba de difusión por un método de dilución. 23) La presencia de rifampicina en la serie para evaluar la sensibilidad a estafilococos, es con la concentración indicada (disco 5 ug) en normas NCCLS. Para evaluar la sensibilidad frente a bacilos Gram negativos, se debe usar un disco de 30 ug de acuerdo a las normas de la Sociedad Francesa de Microbiología. 24) Los discos de fosfomicina y fosfomicina/trometamol llevan, incluido 50 ug de glucosa 6-fosfato. 25) La carga de los discos, se basa en las recomendaciones del informe técnico de la OMS N 673, en el informe NCCLS y en trabajos científicos de investigadores argentinos y extranjeros. 26) Los resultados de gentamicina, pueden extenderse a sisomicina; los de ácido nalidíxico a ácido oxolínico; los de colistina a polimixina B y los de ticarcilina a carbenicilina. 27) Cuando se ensaya vancomicina frente a enterococos, la lectura debe realizarse a las 24 hs. y examinada con luz transmitida; la presencia de algún desarrollo o invasión dentro de la zona de inhibición, indica resistencia. Si se considera que debe efectuarse tratamiento con vancomicina en infecciones graves por enterococo y los resultados dan en zona intermedia, debe determinarse la concentración inhibitoria mínima.

9 28) Existen cepas de Klebsiella spp. y Escherichia coli productoras de beta lactamasa de expectro extendido, que a pesar de su aparente sensibilidad in vitro, son clínicamente resistentes a cefalosporinas y aztreonam. Algunas de estas cepas pueden ser reconocidas por dar resultados "intermedio" o "resistente" en ceftacidima o aztreonam (y también a veces a cefotaxima, ceftriaxona y ceftizoxima) y a menudo son resistentes a otros agentes tales como aminoglucósidos y trimetoprima-sulfametoxazol. SADEBAC (Sociedad Argentina de Bacteriología Clínica) hace varios años ha alertado sobre la aparición de estas cepas en nuestro país. Ver tabla Pruebas de screening y confirmatorias de detección de beta lactamasa de espectro extendido (ESBLs) en Klebsiella pneumoniae, K.oxytoca y E. coli. Es frecuente, que estas cepas sean simultáneamente sensibles a cefoxitina e imipenem, excepto raras mutantes de permeabilidad. 29) La Subcomisión de Antimicrobianos de SADEBAC luego de haber realizado un trabajo prospectivo multicéntrico, sugiere, que debido a la alta resistencia de las cepas de E. coli frente a la ampicilina en nuestro país, los criterios de interpretación de la prueba de difusión en agar para ampicilina sulbactama frente a E. coli deben ser los siguientes: Sensible 18 mm, intermedio 13 mm y resistente 12 mm. 30)IMPORTANTE: Para evitar falsas interpretaciones, el informe rutinario a los médicos, solo debe incluir aquellos antimicrobianos útiles para el uso terapéutico. Independientemente de los resultados de laboratorio que pueden realizarse, para proveer datos taxonómicos o información epidemiológica, deben excluirse los datos de sensibilidad de los siguientes antimicrobianos, ya que no demuestran eficacia clínica : *Cefalosporinas de primera y segunda generación y aminoglucósidos frente a Salmonella y Shigella spp. *Todos los antibióticos beta lactámicos (excepto oxacilina y meticilina) frente a estafilococos meticilino resistentes *Cefalosporinas, aminoglucósidos (excepto el ensayo para resistencia de alto nivel ), clindamicina y trimetoprima-sulfametoxasol frente a enterococos *Cefalosporinas frente a Listeria spp. Para el caso de aislamiento de Salmonella y Shigella spp., en forma rutinaria, alcanza con el ensayo de ampicilina, una quinolona y trimetoprima-sulfametoxasol. Para casos de aislamientos extraintestinales de Salmonella spp. se aconseja, el agregado de cloranfenicol y una cefalosporina de tercera generación. 31) ESTAFILOCOCOS: De acuerdo a las normas NCCLS M2 A7 Vol 20 N 1 ( Enero 2000), la sensibilidad o resistencia de estafilococos, a la mayoría de los antibióticos betalactámicos, se puede deducir ensayando solamente oxacilina y penicilina. Los estafilococos sensibles a la penicilina, son también sensibles a otras penicilinas, a combinaciones con inhibidores de beta lactamasa, cefems y carbapenems aprobados para tratar infecciones estafilocóccicas. Los estafilococos que son resistentes a la penicilina pero que son sensibles a la oxacilina, son resistentes a las penicilinas lábiles a las beta lactamasas y sensibles a otras penicilinas estables a las beta lactamasas, a combinaciones con inhibidores de beta lactamasa, importantes cefems y carbapenems. Los estafilococos resistentes a la oxacilina, también son resistentes a todos los beta lactámicos disponibles. Por lo tanto, si la sensibilidad o resistencia a un amplio número de antibióticos beta lactámicos se deduce ensayando solamente penicilina y oxacilina, no es necesario el ensayo rutinario a otras penicilinas, combinaciones con inhibidores de beta lactamasas, cefems (cefalosporinas de 1, 2, 3 y 4 generación ) y carbapenems.

10 Pruebas de screening y confirmatorias de detección de beta lactamasas de espectro extendido (ESBLs) en Klebsiella pneumoniae, K.oxytoca y E.coli Método Prueba inicial de screening Prueba Fenotípica confirmatoria Medio de cultivo Agar Mueller Hinton Agar Mueller Hinton Concentración del antimicrobiano en el disco Ceftacidima 30 µg Ceftacidima/ácido clavulánico 30/10 µg Cefpodoxima 10 µg ó Ceftacidima 30 µg ó Aztreonam 30 µg ó Cefotaxima 30 µg ó Ceftriaxona 30 µg El uso de varios antimicrobianos favorece la detección Cefotaxima 30 µg Cefotaxima/ácido clavulánico 30/10 µg Las pruebas confirmatorias requieren el uso de ambas pruebas Inóculo incubación Seguir recomendaciones de la prueba estándar Seguir recomendaciones de la prueba estándar Resultados Control de calidad Cefpodoxima mm Ceftacidima 22 mm Aztreonam 27 mm Cefotaxima 27 mm Ceftriaxona 25 mm - Cepa sospechosa de producir ESBL E.coli ATCC Cefpodoxima mm Ceftacidima mm Aztreonam mm Cefotaxima mm Ceftriaxona mm K.pneumoniae ATCC Cefpodoxima 9-16 mm Ceftacidima mm Aztreonam 9- mm Cefotaxima -25 mm Ceftriaxona mm Un incremento 5 mm en el diámetro del antibiótico que contiene el ácido clavulánico versus el que no lo tiene confirma el ESBL ej. Ceftacidima = 16 Ceftacidima/clavulánico = 21 2 mm de incremento con Clavulánico 5 mm incremento en Ceftacidima / clavulánico 3 mm incremento en Cefotaxima / clavulánico CONTROL DE CALIDAD: TÈCNICA UTILIZADA: Según NORMAS NCCLS Doc. M2 A7 (ENERO 2000).Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. AGENTE CONTENIDO E.coli S.aureus P.aeruginosa E.coli ANTIMICROBIANO DEL DISCO ATCC25922 ATCC25923 ATCC27853 ATCC35218 mm. mm. mm. mm. - AMICACINA 30µg ******* - AMPICILINA 10µg ****** ******* - AMPICIL-SULBACT 10/10µg ****** AZITROMICINA 15µg ****** ****** ******* - AZTREONAM 30µg ****** ******* - CEFACLOR 30µg ******* ******* - CEFAZOLINA 30µg ******* ******* - CEFEPIME 30µg ******* - CEFIXIMA 5µg ****** ******* ******* - CEFOPERAZONA 75µg ******* - CEFOTAXIMA 30µg ******* - CEFOXITINA 30µg ****** ******* - CEFTACIDIMA 30µg ******* - CEFTIZOXIMA 30µg *******

11 - CEFTRIAXONA 30µg ******* - CEFUROXIMA 30µg ****** ******* - CEFALOTINA 30µg ****** ******* - CLORANFENICOL 30µg ****** ******* - CIPROFLOXACINA 5µg ******* - CLINDAMICINA 2µg ****** ****** ******* - ERITROMICINA 15µg ****** ****** ******* - FOSFOM-TROMETAMOL 200µg ****** ******* - GENTAMICINA 10µg ******* - IMIPENEM 10µg ****** ******* - LEVOFLOXACINA 5µg ******* - KANAMICINA 30µg ****** ******* - MEROPENEM 10µg ******* - MINOCICLINA 30µg ****** ******* - AC. NALIDIXICO 30µg ****** ****** ******* - NETILMICINA 30µg ******* - NITROFURANTOINA 300µg ****** ******* - NORFLOXACINA 10µg ******* - OFLOXACINA 5µg ******* - OXACILINA 1µg ****** ****** ******* - PENICILINA 10U ****** ****** ******* - PIPERACILINA 100µg ****** PIPERAC-TAZOBACTAMA 110µg RIFAMPICINA 5µg ****** ******* - SULFISOXAZOL 300µg ****** ******* - TEICOPLANINA 30µg ****** ****** ******* - TETRACICLINA 30µg ****** ******* - TOBRAMICINA 10µg ******* - TRIMET-SULFAMETOXAZ. 25µg ****** ******* - TROVAFLOXACINA 10µg ******* - VANCOMICINA 30µg ****** 21 ****** ******* NOTA 1: Para el control de calidad de monodiscos y multidiscos Britania, se utiliza Agar Mueller Hinton Britania que tiene niveles muy bajos de timina y timidina. Se utiliza como cepa control Enterococcus faecalis ATCC frente a discos de Trimetoprima Sulfametoxazol. Una zona de inhibición igual o mayor a 20mm y especialmente libre de finas colonias, indica que existe un bajo nivel de timina y timidina.

12 NOTA 2: Los límites de control de Gentamicina 120µg y Estreptomicina 300µg se verifican frente a Enterococcus faecalis ATCC (Gentamicina mm y Estreptomicina mm). BIBLIOGRAFÌA..- Normas NCCLS Vol. 20 Nº 1 (2000). Documento M2 A7.- Bauer. A. W, Kirby W.M.M, Sherris. J.C, Turk. M. Am. J. Cl. Pathol. 1966, 45: INDICACIONES AL CONSUMIDOR. Es necesario asegurarse que los multidiscogramas que usted reciba del distribuidor no hayan expirado en su fecha de vencimiento. Al recibir los discogramas, almacénelos entre 20 ºC y 0ºC para mantener su potencia, excepto las pequeñas cantidades necesarias para el trabajo semanal que puede mantenerse refrigerada entre 2 8 ºC. Permita que los recipientes alcancen la temperatura ambiente antes de abrirlos. Por cualquier duda, contactarse con nuestro departamento técnico. LABORATORIOS BRITANIA s.a. LOS PATOS 25 (C1283ABI) Bs.As. Tel: Fax: Atención al Cliente con fax gratuito deptotecnico@britanialab.com Lc: A