EXPRESIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS

Transcripción

1 Trypanosoma brucei Trypanosoma cruci Trypanosoma brucei EXPRESIÓN EN TRIPANOSOMÁTIDOS Verónica Fernández Mancebo 2015 Leishmania major Leishmania mexicana Organización del genoma nuclear L. major: 32.8Mb en 36 cr peq. ( Mb) T. brucei: 26Mb en 11cr grandes T. cruci: 60.3Mb en 41 cr peq Repetidos GGGTTA Repetidos Organizado en grandes grupos de genes policistrónicos (PGCs) (10 a cientos de genes codifican proteínas en la misma hebra) Promotor? Otras seq? Codif. para ARNt ó ARNr Organización policistrónica

2 Transcripción ARN polimerasas nucleares 3 ARN polimerasas nucleares (I, II y III) Transcripción policistrónica (genes no relacionados func.) SUBUNIDADES ARNpol II 12, ARNpol I 14, ARNpol III 17 5 subun son compartidas entre las 3 2 subun son compartidas entre I y III con homólogas en la II 5 subun homólogas entre las 3 5 subun son específicas de III 2 subun son específicas de I Diferencias con eucariotas superiores: Existen varias copias para algunas de las subunidades El CTD de la pol II no contiene los repetidos 7-pept característicos de eucariotas superiores Inicio de la transcripción Factores de transcripción Se han identificado muy pocos Algunos muestran clara identidad de seq con los ortólogos en levaduras y vertebrados Otros presentan muy baja identidad Para ARN-pol II: TRF4 (ortólogo div de TFIIB); SNAPc (SNAP50+SNAP2+SNAP3); TFIIA; TFIIH (9 sub); complejo PBP2 Para ARN-pol III: TFIIIB (2 subunidades); TRF4; SNAP50 Para ARN-pol I: CITFA (específico para tripanosomátidos); en región codif del ARNr: TRF4 y SNAP50 Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4) Copyright 2004, American Society for Microbiology Mol Cell Biol November; 24(21): doi: /MCB Functional Characterization of a Trypanosoma brucei TATA-Binding Protein- Related Factor Points to a Universal Regulator of Transcription in Trypanosomes Jia-peng Ruan,1 George K. Arhin,2 Elisabetta Ullu,2,3 and Christian Tschudi1,2* Departments of Epidemiology and Public Health1 Internal Medicine2 Cell Biology, Yale University Medical School, New Haven, Connecticut3 *Corresponding author. Mailing address: Department of Epidemiology and Public Health, Yale University Medical School, 295 Congress Ave., New Haven, CT Phone: (203) Fax: (203) christian.tschudi@yale.edu. Received 2004 May 16; Revised 2004 July 19; Accepted 2004 August 13. TRF-4 y SNAP50 Rol esencial en ARN pol I, II y III No necesariamente se unen en la región promotora, pero son importante en la transcripción de los genes: PARP, SL, U-snRNA Para ARN-pol II: Finalización de la transcripción Tract de 6 o más T en 3 del SL (similar a pol III) está involucrado en la finalización de la transcripción, pero no en la transcripción de genes de proteínas ( diferencia en los complejos que transcriben?) En PGCs convergentes se separan por varios ARNt la transcripción termina dentro de los genes de ARNt? (ej. Cromosoma 3 L. major) Variantes de Histonas en regiones switch estructura de la cromatina importa en la finalización de la transcripción? Para la ARN-pol III: Finaliza en varias Ts en el 3 (nº variable en cada ARNt). No se ha identificado alguna proteína involucrada Para la ARN-pol I: Finaliza en el 3, en área conteniendo secuencias cortas con potencial de formar un loop (similar a bacteria indep de rho) En genes de PRO: 3 elementos de secuencias en el 3 que actúan sinergisticamente en una manera dependiente de la orientación

3 ARN polimerasa II Promotor para ARN-pol II Tripartita Inr 100pb Es responsable de la transcripción de genes estruct (act, tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snoarn No parece existir promotores clásicos de eucariotas Expresión constitutiva sin gran regulación en el inicio de la transcripción (similar a los TATA-less de eucariotas superiores) Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi) Transcripción policistrónica mrna maduro monocistrónico: capping, poli(a) 3 subunidades una TBP-like PBP1 PBP2 Inr Evidencia que recluta la pol II SL-RNA Inr = CYAC/AYR(+1) T...T Qué se sabe sobre los pre-arnm Todos los genes de un PGC son transcriptos al mismo nivel como unidad policistrónica trans-splicing y poliadenilación están acoplados Todos los ARNm maduros comienzan con la misma secuencia de nt -> miniexon (ME - SL) Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado Existen genes para ME por núcleo en tandem c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb Su transcripto presenta Cap 4 (m7g, metilaciones 2 OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico Generan ARNm maduro para ser exportado del núcleo

4 Si todos los genes del una PGC se transcriben en un mismo transcripto primario por qué se tiene diferente concentración de las proteínas codificadas por esos genes? Incluso diferente concentración de ARNm maduro? ARNm de las sintetasas de aminoacil-trna Regulación de la expresión Transcripción constitutiva de genes para proteínas La principal regulación se da a nivel POST-TRANSCRIPCIONAL Destinos de los ARNm en tripanosomátidos (modelo) CAP4 ORF 5 UTR 3 UTR RBP Elongación Regiones intergénicas (ME/poli(A)) Estabilidad ARNm (3 UTR) Traducción Estabilidad de la proteína Esta regulación es la clave para los cambios en la expresión génica Elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR) 5 UTR 3 UTR Reg. Cod. ME AAAAA n

5 GP82: gp de superficie presente solo en la forma infectiva Promotor para ARN-pol III Transcribe ARN pequeños (5S, tarns, 7SL-ARN y todos snarn) usando snarn Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3 como 5 TSS/Inr Punto de inicio Tipo I Tipo II 5 DSE PSE TATA A A C ARNr 5S B ARNt T. brucei U2-U6 Promotor para ARN-pol I Transcribe: ARN ribosomal (nucleolo) y genes de Ags de superficie (VSG y PRO) ARNr maduro: 20% 5 PO4 y 80% 5 OH Promotor parecido de los eucariotas superiores Promotor para ARN Pol I Aparentemente están siempre activos (regulación de las unidades de VSG y de PRO?). Core Punto de inicio Upstream control element Core promoter Suficiente para transcribir VSG Dom III (distal) Dom II DomI Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5 (UCE)

6 El gen que codifica para la subunidad 28S en eucariotas superiores, en los tripanosomátidos se presenta en regiones modulares separadas por espaciadores de la transcripción, lo que lleva a un procesamiento atípico generando una subunidad mayor de ribosoma conteniendo un mayor número de moléculas de ARN (dos grandes y cuatro pequeñas) VSGs Variant Surface Glycoprotein Existen aprox 1000 genes VSG Cada VSG es codificada por una copia básica interna (a >50kb del telómero) o telomérica (a 5-15kb) T. brucei: Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando Acs contra VSG 221 Sitio de expresión activo (ES) Expresión algo programada (aparentemente involucra a la cantidad de repetidos de 70pb) VSG VO2

7 VSG La formación del ELC ocurre por conversión génica Cambio de Expresión VSG(copia-act) Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL) 1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización. 2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b) Copia Básica (BC) Copia ligada a la expresión (ECL) a b c d...etc Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón ARN pol mitocondrial (karnpol) El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi-(30-50kb) y mini-( kb) círculos copias copias genoma mitocondrial ARNguias RET1 (RNA editing TUTase 1). No se han encontrado secuencias promotoras consenso Transcribe ARN poli-cistrónicos que luego se procesa (corte en ARN monocistrónicos seguido/acompañado de editado (+/-U), poli-a para ARNm y poli-u para ARNg) NOTA: en el núcleo se transcriben:.el ARN karnpol, que se sintetiza en el citosol (1 subunidad).los ARNt del kinetoplasto y se deben importar (9S y 12S prot codif ADN nuclear y 1 en kadn-rps12) RPS12?

8 Editado Modificación de información génica codificada en el ADN Se adicionan o se remueven bases del ARNm (en general se introducen o se sacan U ) Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial. Editado ARNg Todos los ARNg tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3 de COXII) Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición. anclas El extremo 5 de cada ARNg es pre-arnm complementario a la secuencia cercana a 5 3 la región editada hacia el 3 del mrna. 3 Se corrige el marco de lectura. Simple: número pequeño de U en el extremo 5 cox2 T.brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen > 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3 El extremo 3 de los grnas tienen una cola de U (5-15nts), agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa). La región intermedia contiene la secuencia complementaria a la porción editada del mrna. (AU, GC y GU) 5 ARNg Seq guía de edición Editosoma: corta el transcripto y agrega Us (TUTasa), mantiene los extremos abiertos, elimina las Us no apareadas (exoribonucleasa Uespecífica) y liga los extremos del transcripto mrna editado. et al. 1990

9 GRBC1/2: Estabiliza el garn TbRGG2 REMC: interacciona con el complejo mediador de la edición de ARN PAMC: interacciona con el complejo mediador de la poliadenilación de ARN Editado Algunas consideraciones Armar marcos de lectura: - crear codón de inicio y de terminación, - establecer marcos de lecturas funcionales La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios ( mec. de regulación?)

10 RET1 (RNA editing TUTase 1). La edición alternativa del RNAm de la citocromo C oxidasa mitocondrial III (COXIII) en Trypanosoma brucei produce una nueva proteína de unión a ADN: AEP-1. Se propone que AEP-1 interacciona físicamente con el kadn y cuerpos basales flagelares. La expresión en tripanosmátidos el entenderla ayudaría a comprender procesos (diferenciación, virulencia, variación antigénica) y a encontrar blancos claves para controlar la infección. es un mecanismo único (transcrip policistrónica, trans-splicing, editado de ARNm, la ARNpol I sintetiza ARNm). PREGUNTAS? La iniciación de la transcripción de genes de proteínas parece ser comparable a los promotores sin caja TATA de humanos y otros mamíferos (cr 1 de L major). La transcripción no parece ser atípica ya que se han identificado diferentes factores de transcripción generales.