CROMATOGRAFIA DE GASES

Transcripción

1 Cromatografía de gases 2 Tema 11 CROMATOGRAFIA DE GASES La cromatografía de gases (CG) incluye todos los sistemas cromatográficos en los que la fase móvil es un gas Desde la década de los cincuenta, en la que Martin y James (1952) descubrieron la cromatografía gas-líquido hasta el desarrollo de la HPLC, puede considerarse como el método de separación mas importante En la actualidad, la CG es una técnica analítica usada rutinariamente en multitud de laboratorios universitarios, de investigación e industriales, debido a su alta resolución, sensibilidad y selectividad La utilización de columnas capilares, así como el empleo de la CG en conjunción con otras técnicas, especialmente la espectrometría de masas, han aumentado espectacularmente sus posibilidades, siendo factible la separación, cuantificación y subsiguiente caracterización de una gran variedad de productos en distintas mezclas, desde gases permanentes y mezclas de isótopos, hasta aceites esenciales en perfumes, ácidos grasos en grasas animales y agentes contaminantes en aguas y suelos Además de las aplicaciones típicamente analíticas, la CG puede utilizarse a escala preparativa para la obtención de compuestos de elevada pureza, así como también es posible la obtención de datos físico-químicos relativos a propiedades superficiales, cinética y termodinámica de procesos de adsorción y separación, desarrollo de catalizadores, etc Existen dos tipos de cromatografía en fase gaseosa: la cromatografía gas-sólido (CGS) y la cromatografía gas-líquido (CGL), según se utilice una fase estacionaria sólida o una fase estacionaria líquida (sobre un soporte sólido, o directamente sobre la pared interna de la columna), respectivamente De las dos modalidades, la primera tiene unas aplicaciones bastante limitadas, por lo que en la práctica, casi siempre que se hace alusión a la cromatografía de gases está implicada la CGL Por ello, en este capitulo, se tratará fundamentalmente de la CGL, y solo se hará una breve referencia al final sobre la CGS

2 Claudio González Pérez 3 PRINCIPIOS BASICOS Los principios fundamentales de la cromatografía expuestos en el capítulo anterior son aplicables a la cromatografía de gases con solo algunas ligeras modificaciones resultantes de las propiedades diferenciales entre el estado líquido y el estado gaseoso, principalmente la difusividad Las principales diferencias entre gases y líquidos pueden concretarse en: * Las interacciones entre las moléculas de los gases, a diferencia de los líquidos, suelen ser pequeñas Por otra parte, los gases suelen tener poca capacidad para desalojar las moléculas de soluto no volátiles fijadas a la fase estacionaria (ya sea ésta sólida o líquida) Por ello, en CG, la fase móvil no interacciona con las moléculas de analito, siendo su función únicamente el transporte del analito a través de la columna * Los gases difunden entre sí mucho mejor que los líquidos, lo cual influye en la resolución y en la velocidad de separación Así, a velocidades de fase móvil próxima a su valor óptimo, la cromatografía líquida proporciona mejor resolución, si bien, en CG la velocidad óptima de flujo es del orden de 10 4 a 10 5 veces superior a la CL, con lo que pueden obtenerse separaciones en muy poco tiempo Por otra parte, y como consecuencia de la mayor difusividad de los gases, el equilibrio de separación se alcanza más rápidamente * Las propiedades superficiales de los líquidos también influyen sobre sus características cromatográficas Así, la tensión superficial de los líquidos, y de la que carecen los gases, se utiliza en cromatografía sobre papel y de capa fina como fuerza impulsora de la fase móvil, lo que permite realizar separaciones sin columna Este tipo de separaciones no son posibles en cromatografía de gases * La mayor densidad de los líquidos respecto a los gases permite usar la gravedad o la fuerza centrífuga como fuerza motriz de la fase móvil, mientras que la pequeña viscosidad de los gases, hace posible el empleo de columnas más largas Debido a la compresibilidad de los gases, en CG es más aconsejable utilizar volúmenes de retención en lugar de tiempos de retención Como se indicó anteriormente, V R = t R F y V M = t M F, siendo F la velocidad media de flujo de fase móvil a través de la columna * Estos volúmenes de retención, V R y V M, dependen de la * Generalmente, suele medirse el caudal a la salida de la columna con un medidor de pompas de jabón El caudal medido está relacionado con el caudal medio por la expresión: T c P P H F=F 2 O m T a P donde T a y T c son las temperatura ambiente y de la columna respectivamente, P la presión atmosférica y P H2 O la presión de vapor de agua a T a

3 Cromatografía de gases 4 presión media en el interior de la columna, por lo cual se utilizan volúmenes de retención corregidos, V R o y V M o, obtenidos a partir de, V R o = j V R ; V M o = j V M donde j es el llamado factor de compresibilidad, dado por, j = 3 2 P ipo 2 P ipo 3 siendo P i y P o la presión en el interior y en el exterior de la columna respectivamente En cromatografía de gases, y para estandarizar los volúmenes de retención, suele emplearse el volumen neto, obtenido por diferencia entre V R o y el volumen muerto, 1 1 V N = V R o V M o y también el volumen de retención específico, V g, definido como el volumen neto de analito por gramo de fase estacionaria a 0 ºC: V g = V N m 273 T c donde Tc es la temperatura de la columna y m la masa, en gramos, de la fase estacionaria El volumen de retención específico está relacionado con la constante de distribución, K, por la expresión: V g = K ρ s 273 T c donde ρ s es la densidad del líquido en la fase estacionaria El factor 273/T c corrige V g a la temperatura de referencia de 273 ºK Es necesario poner de manifiesto que a una determinada temperatura, V g depende únicamente de la constante de distribución y de la densidad del líquido que constituye la fase estacionaria, por lo que, en principio, podría ser un parámetro característico con fines de identificación Asimismo, es necesario indicar que en CG la constante de distribución depende marcadamente de las presiones de vapor de los componentes, y éstas, a su vez, de la temperatura El equilibrio dependerá claramente de la temperatura y, por lo tanto, este parámetro deberá mantenerse de la forma más precisa posible

4 Claudio González Pérez 5 LAS MUESTRAS PARA CROMATOGRAFIA DE GASES La separación de compuestos directamente, esto es, sin transformaciones previas, requieren que las muestras cumplan las condiciones siguientes: * Compuestos en estado gaseoso, o bien en estado líquido y sólido, con presiones de vapor de por lo menos 03 mm de mercurio a la temperatura máxima de la fase estacionaria empleada * No descomponibles por el calor a la temperatura de la separación * No adsorbibles o descomponibles por el soporte sólido de la columna * Detectables a la salida Actualmente, se ha ampliado el campo de utilización de la CG a muchos compuestos que no cumplen los requisitos citados Así, es posible analizar compuestos, como azúcares o aminoácidos, totalmente no volátiles, pero que se transforman en derivados volátiles por reacciones apropiadas Por otra parte, los métodos de muestreo de los productos de descomposición pirolítica de muestras no volátiles, no dan información directa sobre la composición de las sustancias, pero suministran datos de sus productos de descomposición Asimismo, compuestos no detectables, se transforman en otros sensibles al método de detección y por diversos artificios se reduce el grado de descomposición de muestras inestables INSTRUMENTACION Un cromatógrafo de gases consta básicamente de los siguientes componentes (figura 111) * Fuente de gas portador con los correspondientes reguladores y medidores de presión * Sistema para la introducción de las muestras * Columna cromatográfica, con un medidor de caudal a la salida * Detector * Sistema para el tratamiento de datos y registrador

5 Cromatografía de gases 6 medidor de caudal de pompas de jabón medidor de presión jeringa termostatos detector válvula reguladora válvula reductora botella de gas portador columna registrador Figura 111 Componentes básicos de un cromatógrafo de gases La columna cromatográfica va introducida en un horno termostatizado por aire, con posibilidad de regular la temperatura entre 25 y 400 ºC, con precisiones comprendidas entre ± 01 y ± 001 ºC, dependiendo de la precisión deseada en la medida de los tiempos de retención Por otra parte, el sistema de introducción de las muestras y el detector se mantienen generalmente a una temperatura superior en un 10% a la de la columna, para asegurar la rápida volatilización de la muestra y prevenir la condensación GASES PORTADORES (FASES MOVILES) El gas portador, que actúa como fase móvil y transporta los componentes de la muestra a través de la columna y hasta el detector, deberá ser una especie químicamente inerte respecto al analito y relativamente barata, ya que es expulsado a la atmósfera al final del proceso cromatográfico En la práctica, los gases más utilizados son: helio, nitrógeno, hidrógeno, argon y dióxido de carbono, especialmente los tres primeros La elección de la fase móvil se hace normalmente en orden al coste, disponibilidad e inercia química, así como también en función del detector utilizado y,

6 Claudio González Pérez 7 ocasionalmente, en cuanto a la eficacia de la separación En este sentido, con nitrógeno suelen obtenerse separaciones más eficaces que con hidrógeno o helio, lo cual puede ser debido a su menor coeficiente de difusión y, consecuentemente, menor valor del término B de la ecuación de Van Deemter Sin embargo, para adquirir esa eficacia se requieren bajas velocidades de flujo, lo cual va en detrimento del tiempo necesario para el análisis Por este motivo, en ocasiones, resulta preferible utilizar hidrógeno o helio para las velocidades optimas más elevadas, aún a costa de sacrificar la eficacia Sin embargo, el empleo de hidrógeno presenta otros problemas, ya que es altamente inflamable, puede formar mezclas explosivas con el aire y a veces puede reaccionar con los componentes de la muestra para originar "artefactos" hidrogenados Un factor muy importante en las separaciones por cromatografía de gases es el ajuste del caudal, ya que este condiciona la velocidad de la separación Normalmente los caudales se controlan mediante un regulador de presión de dos niveles, colocado en la botella del gas, y algún tipo de regulador de presión instalado en el cromatógrafo Los caudales pueden determinarse mediante un rotámetro situado a la cabeza de la columna, si bien, la forma más exacta es utilizar un simple medidor de pompas de jabón colocado a la salida de la columna El caudalímetro de burbuja representado en la figura 112 funciona de la forma siguiente: apretando la pera de goma se eleva el nivel de la disolución jabonosa y se forma una burbuja; midiendo el tiempo que tarda en pasar entre dos marcas sobre un tubo graduado, que corresponden a un volumen conocido, se determina el caudal de gas portador Para su construcción puede utilizarse una bureta de diferente capacidad, según el caudal a medir burbuja gas portador procedente de la columna solución jabonosa Figura 112 Caudalímetro de burbuja

7 Cromatografía de gases 8 SISTEMAS PARA LA INTRODUCCION DE LA MUESTRA Las muestras a separar por cromatografía de gases pueden ser de diferente naturaleza y estado físico, pero necesariamente han de pasarse al estado de vapor El procedimiento de vaporizar las muestras y de introducirlas en la columna tiene gran importancia desde el punto de vista de la eficacia de la separación Para que se cumplan las condiciones teóricas del mecanismo de la separación, la muestra ha de adsorberse totalmente en el primer plato de la columna sin mezclarse con el gas portador Sin embargo, como en la práctica, la inyección no es instantánea, la muestra se mezcla en cierta medida con el gas portador y no se fija totalmente en el primer plato, el proceso de separación se inicia simultáneamente en varios platos a la vez, lo que origina un ensanchamiento de las bandas cromatográficas Por otra parte, es importante que el tamaño de muestra sea el adecuado a las características del equipo utilizado Así, cuando se añade a la columna una cantidad de soluto superior a su capacidad, no se establece el equilibrio entre la fase gaseosa y la fase líquida en los primeros platos, reduciéndose su eficacia, a la vez que aparecen colas Además, el tamaño de muestra viene condicionado por el detector utilizado, no pudiendo exceder el margen lineal de respuesta, para evitar la saturación En resumen, deberá inyectarse la cantidad adecuada de muestra, en el menor tiempo posible y conseguir la vaporización total de las muestras no gaseosas (las muestras sólidas y líquidas se introducen usualmente como disoluciones diluidas en un disolvente volátil) Para ello se emplean diversos artificios y técnicas de muestreo Las muestras gaseosas se introducen generalmente en la columna cromatográfica usando válvulas rotatorias y bucles de volumen conocido, como el representado en la figura 1017 (también pueden usarse estos dispositivos para muestras líquidas) Los distintos bucles son fácilmente intercambiables y sus volúmenes suelen oscilar entre 01 y 100 ml Además, el sistema se diseña para minimizar las fluctuaciones de presión que puedan tener lugar cuando la válvula se cambia desde la posición "llenado" a la de "inyección" Un método prácticamente universal para la introducción de muestras en CG, pero que se utiliza fundamentalmente con muestras líquidas implica el uso de una microjeriga para inyectar a través de un diafragma o "septum" de silicona en una cámara de vaporización situada en la cabeza de la columna y calentada unos 50 ºC por

8 Claudio González Pérez 9 encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra En la figura 113a se representa esquemáticamente un dispositivo de este tipo gas portador cámara de vaporización columna jeringa septum a) gas portador columna g c atmósfera g c a g c a b) Figura 113a) Inyección con jeringa b) Repartidores de caudal Los diafragmas tienen un tiempo de vida limitado, dependiendo de la destreza del operador, la temperatura del inyector y la calidad del propio diafragma Un operador suficientemente hábil pincha el septum en un nuevo lugar en cada inyección, con lo que se aumenta el número de veces que puede usarse Por otra parte, las altas temperaturas del bloque de inyección conducen a una pérdida de flexibilidad del septum de silicona como consecuencia de su degradación, sobre todo cuando se opera a temperaturas superiores a 300 ºC Esta degradación del septum puede originar materiales despolimerizados de bajo peso molecular, los cuales darán origen a picos falsos, a la vez que producen fluctuaciones en la línea base Otro fenómeno es el relacionado con los efectos de memoria producidos como consecuencia de la facilidad para adsorberse de determinados compuestos que posteriormente serán de-sorbidos Alternativamente, la inyección puede realizarse directamente en la columna En estos casos, la aguja hipodérmica llega hasta el relleno de la propia columna, donde se deposita directamente la muestra líquida, de manera que la banda cromatográfica se forma directamente sobre la fase estacionaria Este tipo de inyección se utiliza en el caso de muestras que podrían descomponerse si se calientan por encima de su punto de ebullición La muestra se inserta directamente al principio de la columna operando a a

9 Cromatografía de gases 10 una temperatura inicial relativamente baja, con lo que los solutos quedan en una zona muy estrecha La separación ocurre al elevarse la temperatura de la columna El tamaño de la muestra, para la columnas analíticas ordinarias, varía entre unas pocas décimas de micro-litro y 20 µl, para lo cual suelen utilizarse divisores de muestra, los cuales permiten pasar a la columna solo una parte de la muestra inyectada, desechándose el resto En la figura 113b se muestran diversos modelos de repartidores de caudal En estos dispositivos, el caudal total de gas portador que contiene la muestra vaporizada se divide en dos porciones antes de entrar en la columna: una de ellas, la menor, se dirige a la columna, y la mayor desemboca a la atmósfera En todos estos sistemas se coloca un limitador de caudal en la parte que desemboca a la atmósfera, para lo cual suelen usarse agujas hipodérmicas calibradas y tubos de vidrio capilares Los repartidores de caudal se colocan en ocasiones también a la salida del detector, cuando éste tiene una respuesta lineal muy limitada y las cantidades de soluto separadas son excesivamente grandes, o cuando, al emplear detectores destructivos se ha de recuperar la muestra para su identificación, o con fines preparativos Recientemente se han desarrollado sistemas de vaporización a temperatura programada, los cuales resultan ventajosos cuando se opera con determinado tipo de muestras COLUMNAS Y FASES ESTACIONARIAS La columna constituye la parte esencial del sistema cromatográfico y de la que depende el éxito o el fracaso de los análisis En ella está contenida la fase estacionaria, que determina la selectividad y la eficacia de las separaciones Hasta hace poco tiempo, la mayor parte de las cromatografías de gases se realizaban con columnas empaquetadas o de relleno, mientras que actualmente se utilizan más extensamente las columnas tubulares abiertas o capilares Las primeras suelen tener una longitud comprendida entre 1 y 6 metros, con un diámetro interno que oscila entre 2 y 6 mm, mientras que las columnas capilares tienen longitudes entre 10 y 100 metros y diámetros comprendidos entre 01 y 06 mm En cuanto a los materiales de que están fabricadas, suelen ser acero inoxidable o vidrio para las columnas empaquetadas, y sílice para las capilares, si bien se han utilizado también otros metales como aluminio o cobre, e incluso teflón

10 Claudio González Pérez 11 La temperatura es una variable importante en cromatografía analítica, siendo necesario su control preciso en orden a obtener resultados reproducibles Por ello, las columnas cromatográficas suelen disponerse en rollos de 10 a 30 cm de diámetro, con el fin de poder colocarlas en el interior de un horno termostatado que permita operar entre unos 10 ºC por encima de la temperatura ambiente y unos 450ºC, con una precisión de 01 ºC En la práctica, suelen emplearse temperaturas ligeramente superiores al punto de ebullición medio de la muestra, con lo que se obtienen tiempos de elución razonables Sin embargo, para muestras en las que los puntos de ebullición de los componentes se presenten en un amplio intervalo, los picos correspondientes a los solutos más volátiles estarán muy próximos y los correspondientes a los menos volátiles estarán muy espaciados La resolución no es igual para todos los picos, siendo deficiente al principio y excesiva al final Por otra parte, los picos de los componentes más volátiles son altos y estrechos, mientras que los de los componentes menos volátiles son bajos y anchos Para evitar los inconvenientes anteriormente mencionados suele emplearse una programación de temperatura, aumentando ésta, linealmente o por etapas, mientras se realiza la separación * En la figura 114 se muestran los cromatogramas de una mezcla de hidrocarburos operando en condiciones isotermas (fig 114a) y a temperatura programada (fig 114b) C-8 C-9 C-14 C-6 C-7 C-10 C-16 C-18 C-20 C-6 C-7 C-8 C-9 C-10 a) C-14 C-16 C-18 C-20 b) Figura 114 Cromatogramas de mezclas de hidrocarburos a) Isotérmica b) Temperatura programada * También puede modificarse el caudal de gas portador, habiéndose desarrollado técnicas de programación de esta variable e incluso una programación mixta de temperatura y caudal

11 Cromatografía de gases 12 Columnas empaquetadas Las columnas empaquetadas suelen ser tubos de vidrio o de acero inoxidable con las características de longitud y diámetro interno ya mencionadas, y que se llenan con un soporte sólido de grano fino ( mallas, mm) recubierto de una capa delgada (005-1 m) de un líquido no volátil que actúa de fase estacionaria Una buena columna empaquetadas puede contener entre 1000 y 2000 platos teóricos por metro, mientras que las columnas capilares pueden llegar hasta los platos por metro El soporte sólido deberá presentar las siguientes características: * Superficie relativamente grande, para que la película de la fase líquida depositada sea fina y se mantenga distribuida de forma que ofrezca el máximo contacto con los solutos de la fase móvil, para facilitar el rápido intercambio entre ambas fases * Material relativamente duro, para que las partículas no se rompan durante el proceso de impregnación con la fase líquida y de llenado * Material estable térmicamente y poroso, para no producir una caída de presión excesiva Por otra parte, la uniformidad del tamaño de las partículas reduce el término A de la ecuación de van Deemter, con lo que se reduce la altura de plato y se incrementa la resolución * La superficie ha de ser químicamente inerte y no absorbente de los solutos, es decir, no deberá contribuir a la separación cromatográfica Aunque se han estudiado muchos materiales, ninguno cumple rigurosamente todas las condiciones enumeradas previamente De todos ellos, el más frecuentemente utilizado se prepara partir de tierra de diatomeas, constituida por esqueletos de miles de especies de plantas unicelulares que habitaban antiguos mares y lagos Por tratamiento térmico de las diversas variedades de estas especies, con o sin adición de fundentes, se modifican sus características generales y se obtienen los soportes sólidos conocidos por distintas denominaciones comerciales, de las que, posiblemente, la más popular sea "Chromosorb" Las variedades más utilizadas de Chromosorb son: * Chromosorb P Soporte de color rosa, constituido por granos muy duros, de área superficial elevada (40 m 2 /g) y que puede soportar gran cantidad de fase estacionaria (35% w/w) Presenta una marcada interacción con los solutos, particularmente a temperatura elevada

12 Claudio González Pérez 13 * Chromosorb W Soporte siliceo de color blanco, obtenido por tratamiento a 1600 ºC con un fundente alcalino Presenta menor área superficial (10 m 2 /g) que el Chromosorb P y puede impregnarse, como máximo, con un 15 % de fase líquida * Chromosorb G Es el más duro de todos y doblemente denso que el Chromosorb W, presentando relativamente poca interacción con compuestos polares Debido a su pequeña superficie, tiene poca capacidad de retención de fase líquida Un problema importante que presentan los soportes sólidos diatomáceos es la marcada actividad superficial que presentan Esta se debe, sobre todo, a la presencia de los grupos silanol (Si OH) que se forman sobre la superficie de los silicatos, debido a la humedad, los cuales constituyen puntos activos que provocan adsorción de compuestos polares, así como la formación de enlaces de hidrógeno con determinados compuestos, traduciéndose todo ello en la presencia de picos distorsionados y la aparición de colas (El mismo problema presentan las columnas capilares de sílice) La reducción de la actividad superficial (desactivación) de los soportes sólidos puede llevarse a cabo de diversas formas, si bien, la más utilizada es la silanización, consistente en el tratamiento con dimetilclorosilano * soporte sólido Si OH Cl O + Si Si OH Cl Si O O Si O Si + 2 HCl Para que la reacción sea completa, los grupos OH deben ocupar puntos activos adyacentes En presencia de un solo hidroxilo la reacción es: soporte sólido Si OH Cl + Si Si O Si + HCl Cl Cl 3 * Tambien puede usarse hexametildisilazano, en cuyo caso la reacción es Si OH Si O Si CH O + ( ) 3 Si NH Si( ) 3 O + NH 3 Si OH Si O Si

13 Cromatografía de gases 14 Mediante un lavado con metanol, el segundo cloruro se sustituye por un grupo metoxi, soporte sólido Si O Si + OH Si O Si + HCl Cl Los tratamientos silanizadores reducen considerablemente el área de los soportes e influyen significativamente en los volúmenes de retención de los solutos Por otra parte, la presencia de impurezas minerales (en muchas ocasiones, óxidos metálicos) sobre la superficie de los soportes dan lugar a puntos activos que interaccionan con determinados tipos de compuestos En estas ocasiones, un lavado con ácidos, nítrico o clorhídrico, previo a la silanización, elimina estas impurezas Entre los soportes no diatomáceos usados en CG están las micro-bolas de vidrio, el teflón y las micro-bolas de polímeros orgánicos, cuyas características mas importantes son: * Micro-bolas de vidrio Soporte no poroso, de área superficial baja y muy duro Tiene una figura geométrica muy definida y tamaño uniforme, con lo cual se reduce el término A en la ecuación de van Deemter, disminuyendo la altura de plato e incrementándose la resolución Por el contrario, admite cantidades muy pequeñas de fase estacionaria * Teflón Desde el punto de vista de la actividad superficial, el teflón se acerca al ideal, ya que presenta muy poca interacción sobre los solutos, pero tiene el inconveniente de su poca capacidad de retención de líquidos sobre su superficie Es útil para la separación de compuestos polares, tales como agua, ácidos orgánicos, fenoles, aminas y gases ácidos como HF, HCl, SO 2 y óxidos de nitrógeno * Micro-bolas de polìmeros orgánicos Se preparan por polimerización, en suspensión, del estireno, usando como agente entre-cruzador el divinal-benceno Su estructura física es la de una esfera porosa en la que se ha controlado el tamaño de poro durante el proceso de fabricación, si bien no puede considerarse estrictamente como soporte sólido, ya que también actúa como fase estacionaria

14 Claudio González Pérez 15 La fase estacionaria para cromatografía gas-líquido deberá reunir las siguientes características: * Baja volatilidad a la temperatura de la columna Se sugiere que su punto de ebullición sea, al menos, 100 ºC mayor que la máxima temperatura de trabajo * Estabilidad térmica a la temperatura de la columna * Inercia química, ya que, salvo casos especiales, no deberá reaccionar químicamente con los componentes de la muestra En cuanto a la selección de la fase estacionaria más adecuada a cada caso, hay que considerar, además de los factores mencionados, que el líquido deberá tener un cierto poder disolvente para la muestra En este sentido, la antigua regla de que "lo semejante disuelve a lo semejante", donde el término "semejante" se refiere a las polaridades del soluto y de la fase estacionaria, permite predecir qué solutos serán retenidos por cada fase líquida Así, por ejemplo, el hidrocarburo saturado escualano (C 30 H 62, punto de ebullición 350ºC) de polaridad muy baja, es una buena fase líquida para la separación de alcanos, mientras que el polietilenglicol, de polaridad mucho más elevada, se puede utilizar para la separación de alcoholes Sin embargo, no es necesario que el líquido estacionario tenga un grupo funcional igual al del soluto y, en ocasiones, una fase líquida puede servir para la separación de una amplia variedad de mezclas Esto ha llevado a considerar algunas "columnas para propósitos generales", si bien esto no debe interpretarse de forma estricta, ya que ninguna fase líquida puede tener una eficacia completa para separar todo tipo de solutos El número de fases líquidas empleadas en las separaciones por cromatografía de gases es muy elevado, si bien, puede afirmarse que el 90 % de los análisis pueden llevarse a cabo utilizando un reducido número de ellas En la tabla 111 se muestran algunas de más utilizadas, situadas en orden creciente de polaridad De todas las fases estacionarias que se indican en la tabla, el escualano obtenido por hidrogenación del escualeno, C 30 H 50, es la fase líquida menos polar, utilizándose fundamentalmente para la separación de hidrocarburos saturados Por su parte, el Apiezon L tiene algo de polaridad debida a impurezas que pueden eliminarse por tratamiento térmico; es una fase de uso general para compuestos de puntos de ebullición elevados

15 Cromatografía de gases 16 Tabla 111 Fases estacionarias para cromatografía de gases Fase líquida Estructura ºC Usos Escualano 2,6,15,19,23,hexametiltetracosano, C 30 H hidrocarburos, haluros de alquilo, mercaptanos Apiezon L [CH 2 CH CH CH 2 ] n comp poco polares de punto de ebullición elevado Polidimetilsiloxano SE 30* Si O n hidr aromáticos polinucleares, esteroides, PCBs Fenildimetilsilicona Si O Si O C 6 H 5 C 6 H 5 n 5% OV 3* 50% OV 17* drogas esteroides, pesticidas 50% trifluoropropilmetil silicona OV 210* aromáticos clorados nitroaromáticos Polietilenglicol Carbowax 1000* [O CH 2 CH 2 ] n OH alcoholes, ácidos libres, éteres, glicoles, aminas * Denominación comercial Los polímeros basados en la estructura Si O Si constituyen la base de un grupo muy amplio de fases estacionarias Se diferencian unas de otras en su peso molecular medio, su estabilidad térmica y su viscosidad, mientras que sus propiedades químicas dependen del grado de sustitución en los átomos de silicio Las metil fenil siliconas constituyen un conjunto de fases estacionarias en las que diferentes proporciones de grupos metilo han sido sustituidas por grupos fenilo, y en ellas, la polaridad aumenta al hacerlo el número de grupos fenilo Además, es posible obtener fases líquidas de mayor polaridad mediante la sustitución de grupos metilo de las dimetil-siliconas por grupos polares como trifluoropropil o ciano

16 Claudio González Pérez 17 Los compuestos conocidos con el nombre de Carbowax ( y más recientemente, Superox) son polietilenglicoles, y en ellos, el número después del nombre indica el peso molecular medio del polímero Cuanto menor es, mayor es la polaridad Además de las fases mencionadas, se han desarrollado fases estacionarias especiales para determinadas técnicas analíticas, tales como cromatografía de gases espectrometría de masas, donde es esencial que el "sangrado" * sea mínimo, o bien para separaciones de ciertos tipos de solutos En este sentido, se han desarrollado fases estacionarias estables a elevadas temperaturas (del orden de 450 ºC) consistentes en copolímeros silicona carboranos (figura 115), así como fases quirales, utilizadas para la separación cromatográfica de enantiómeros Si C BH CH3 Si O Si O Si O "Dexil 300" Figura 115 Estructura de fase estacionaria para operar a temperaturas elevadas La cantidad de fase líquida aplicada al soporte sólido es necesario controlarla de forma adecuada, ya que si hay demasiado líquido, los solutos pasan mucho tiempo difundiéndose en esa fase, disminuyendo la eficacia de la separación, y si se carga la columna con una cantidad de fase líquida insuficiente, los solutos pueden interaccionar con el sólido mediante fenómenos de adsorción, con la consiguiente perturbación de la separación La carga de líquido depende del tipo de soporte sólido, el tamaño de la muestra y otros factores, pero, en general, varía entre el 3 y el 15 % (en volumen) Columnas capilares Las columnas tubulares abiertas o columnas capilares son mucho más estrechas y suelen ser mucho más largas que las columnas empaquetadas La teoría de las columnas * El "sangrado" de una columna consiste en la pérdida de fase estacionaria, bien durante el proceso de elución, o cuando se limpia con un disolvente para eliminar los contaminantes

17 Cromatografía de gases 18 sin relleno fue inicialmente expuesta por Golay en 1957 y como consecuencia inmediata de esta teoría se deduce que el primer término (A) de la ecuación de van Deemter debe ser cero, si el flujo de la columna es laminar Los dos tipos más importantes de columnas capilares son las de pared recubierta (WCOT) y con soporte recubierto (SCOT) (ver figura 104), existiendo una tercera modalidad denominada de capa porosa (PLOT), cuyas características se resumen más adelante Las columnas de pared recubierta son sencillamente tubos capilares con la pared interna recubierta de una fina capa de fase estacionaria, mientras que en las columnas SCOT la superficie interna del capilar está recubierta de una fina capa de un material soporte recubierto a su vez de una fase líquida estacionaria En general, la eficacia de una columna SCOT es menor que la de una columna WCOT, si bien bastante mayor que la de una columna empaquetada Por ello, las columnas SCOT han sido sustituidas casi en su totalidad por las WCOT Inicialmente, las columnas WCOT se construyeron con acero inoxidable, vidrio tratado químicamente para que la superficie interna fuera rugosa, plástico y algunos metales como cobre o aluminio Actualmente, casi todas son de sílice fundida, fabricadas con sílice prácticamente exenta de óxidos metálicos y con un recubrimiento externo protector de poliimida Las principales diferencias entre las columnas WCOT y las columnas empaquetadas son: * Las columnas capilares proporcionan mayor resolución que las columnas empaquetadas Ello se debe a que la longitud de la columna es mayor, con lo que se aumenta el número de platos teóricos, pudiéndose llegar a los , frente a de las columnas empaquetadas * El tiempo necesario para realizar un análisis (tiempos de retención) con columnas WCOT es menor que con columnas empaquetadas, como consecuencia del menor contenido de fase estacionaria, con lo que los solutos se retienen menos tiempo * La cantidad de muestra utilizada con columnas capilares suele ser del orden de los nano-gramos, frente a los microgramos que se usan frecuentemente en las columnas empaquetadas * Aunque en las columnas capilares se utiliza una cantidad de muestra considerablemente menor que en las columnas empaquetadas, el límite de

18 Claudio González Pérez 19 detección es del mismo orden de magnitud, debido a que con aquellas tiene lugar un menor ensanchamiento de las bandas, originándose picos estrechos bien definidos Las fases estacionarias usadas en las columnas capilares suelen ser las mismas que en las columnas con relleno, si bien se denominan comercialmente de forma distinta Así, la fase SE 30 (ver tabla 111) corresponde con X 1 en una columna WCOT, la OV 210 con X 200, la Carbowax 20M con X WAX, etc En la práctica, con solo cuatro o cinco fases estacionarias diferentes, pueden separarse los componentes de casi todas las muestras a analizar, especialmente cuando se opera a temperatura programada Asimismo, se han desarrollado fases estacionarias especiales para aplicaciones muy concretas, tales como muestras de productos petrolíferos, fases quirales para la separación de enantiómeros, etc Las columnas capilares de capa porosa consisten en columnas de sílice en las que la fase estacionaria está constituida por partículas de un sólido activo sobre su superficie interna Con esta finalidad, desde 1981 viene utilizándose alúmina, en la que la actividad superficial se debe a la matriz Al O Al, si bien, dicha actividad puede modificarse por la adición de sales, tales como KCl o Na 2 SO 4 Estas columnas se desarrollaron inicialmente para el análisis de compuestos de bajo peso molecular, tales como gases atmosféricos e hidrocarburos C 1 a C 6 DETECTORES Los solutos eluidos de una columna cromatográfica se ponen de manifiesto mediante detectores que deben medir el componente minoritario en mezclas binarias muy diluidas En CG se han utilizado numerosos métodos de detección que van desde los más sencillos, como la valoración volumétrica directa, usado por Martin y James en sus trabajos iniciales, hasta los más sofisticados, como el espectrómetro de masas Clasificación Debido a la gran diversidad de fenómenos físicos o físico-químicos implicados en los métodos de detección, no es fácil hacer una clasificación racional de los detectores De todas formas, suelen agruparse según algunas características comunes en:

19 Cromatografía de gases 20 * Integrales, diferenciales * Destructivos, no destructivos * Discriminativos, no discriminativos Los detectores integrales proporcionan en cualquier instante una medida de la cantidad total del material eluido desde que comienza la detección Los cromatogramas consisten en una serie de escalones cuyas alturas indican las cantidades de soluto (figura 116a) La bureta de Martin pertenecía a este tipo de detectores a) 2 3 Respuesta del detector b) tiempo Figura 116 Cromatogramas de la misma muestra a) Detector integral b) Detector diferencial Los detectores diferenciales responden a la primera derivada de la variación de la concentración del efluente en función del tiempo, y el cromatograma consiste en una serie de picos, como se muestra en la figura 116b: Estos detectores tienen la ventaja sobre los integrales de su mayor versatilidad (ver más adelante) Por otra parte, el área de pico es la variable que normalmente se utiliza desde el punto de vista cuantitativo Los detectores destructivos descomponen las sustancias durante el proceso de detección y suelen responder a la velocidad a la que la muestra pasa por el sistema de detección (flujo másico) Por su parte, los detectores no destructivos tienen la propiedad de no alterar los compuestos medidos y responden generalmente a la concentración del compuesto medido en el gas portador En cromatografía de gases

20 Claudio González Pérez 21 preparativa o en sistemas multi-canales con varios detectores montados en serie, se han de emplear detectores no destructivos Sin embargo, los muy sensibles, aunque sean destructivos, pueden aplicarse a la preparación de compuestos puros En estos casos, el efluente de la columna se divide en dos partes con un repartidor de caudal, pasando al detector una fracción muy pequeña del compuesto, y la mayor parte, a otro detector o al sistema colector de fracciones Los detectores no discriminativos dan información de la cantidad de muestra eluida, pero no la identifican Como los datos de retención por sí solos no suelen ser suficientes para caracterizar de forma inequívoca las sustancias, tiende a utilizarse detectores discriminativos Los más empleados son el espectrómetro de masas y el espectrómetro de infrarrojo Por otra parte, existen detectores que pueden considerarse como intermedios entre unos y otros, pues solamente responden a un determinado número de compuestos y presentan cierto grado de discriminación Características Aunque ninguno de los métodos de detección utilizados en CG puede considerarse como el detector universal, y tampoco parece probable que pueda llegar a diseñarse, el detector ideal debe reunir las características siguientes: * Sensibilidad adecuada Puede considerarse que la sensibilidad es una medida de la magnitud de la señal originada por el detector para una cantidad o concentración de analito determinada Podría expresarse, por ejemplo, en mv/concentración (mvg 1 s) En principio, la sensibilidad debería ser independiente de la concentración de analito, por lo que la representación gráfica de la señal del detector frente a la concentración sería lineal Sin embargo, en la práctica, esta linealidad únicamente se observa en un margen de concentración determinado Por ello, el margen dinámico lineal de un detector se define como el intervalo de concentración en el cual la respuesta es constante en un 5% Generalmente se expresa por un número que representa la relación entre la máxima y la mínima concentración entre las que la respuesta del detector es lineal La creciente demanda de análisis de trazas en distintos campos ha estimulado el desarrollo de detectores cada vez más sensibles Así, el conocimiento que actualmente se tiene sobre el impacto de trazas de contaminantes en los ecosistemas biológicos ha creado un mercado de detectores muy sensibles para

21 Cromatografía de gases 22 estudios de contaminación de aguas, así como residuos de pesticidas en productos alimenticios * * Buena estabilidad y reproducibilidad La línea base de un cromatograma está sometida a fluctuaciones fortuitas, conocidas como "ruido de fondo" (figura 117a), el cual se puede originar en los distintos componentes del instrumento, como los amplificadores, registradores, etc, así como en fluctuaciones del gas portador Respuesta del detector b) R N a) tiempo Figura 117 Líneas base de cromatogramas a) Ruido de fondo b) Deriva Muchos de estos ruidos pueden eliminarse utilizando componentes de alta calidad y operando adecuadamente con el cromatógrafo, si bien, siempre existirá un ruido inherente al detector, el cual, junto con la sensibilidad, establece el límite de detección de un determinado soluto (ver en el Tema 1, "Sensibilidad y límite de detección de los métodos instrumentales") En cromatografía, el límite de detección suele considerarse como la mínima cantidad de muestra para la cual el detector proporciona una señal, S, de, al menos, el doble del nivel de ruido En la práctica, esto corresponde a un pico cuya altura sea, al menos, el doble del nivel de ruido, S 2 R N y h min 2 R N Por otra parte, la línea base puede desviarse, tal como se muestra en la figura 117b, lo que se conoce con el nombre de "deriva" En ocasiones, la deriva se observa cuando en una operación a temperatura programada la columna alcanza una temperatura a la que se volatiliza la fase estacionaria * Tiempo de respuesta El detector debe responder con rapidez a los cambios de concentración del analito, si bien en el tiempo total de respuesta del cromatógrafo influyen también la inercia de otros componentes, como el registrador * Respecto a los niveles de contaminantes detectados en relación con cuestiones medioambientales, es preciso señalar que un nivel "cero" para un político significa cero, mientras que para un químico analítico significa una cantidad inferior a la que puede detectarse con la metodología disponible

22 Claudio González Pérez 23 * Versatilidad El detector deberá responder a una gran variedad de analitos y, a ser posible, proporcionar una respuesta semejante para todos ellos Los detectores más utilizados en cromatografía de gases, y de los que se indicarán seguidamente sus principales características, son el de conductividad térmica (TDC), el de ionización de llama (FID) y el de captura electrónica (ECD), si bien, también se usan otros, como el de nitrógeno-fósforo (NPD), el fotométrico de llama (FPD), el de ionización (PID) etc Detector de conductividad térmica (TCD) Se basa en los cambios de conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia del analito Consiste en un filamento metálico o un termistor * que al calentarlo, en condiciones de estado estacionario, adquiere una temperatura por la conductividad térmica del gas que se encuentra en sus proximidades Cuando cambia la composición del gas, cambia la temperatura del elemento (filamento o termistor) y esto se refleja mediante un cambio en su resistencia eléctrica Las medidas absolutas de conductividad térmica son muy difíciles de realizar, por lo que se emplea un método de medida diferencial Para ello, se utilizan dos células, conteniendo cada una de ellas un sensor Por una pasa gas portador puro, y por la otra, el gas portador que sale de la columna cromatográfica (figura 118) filamentos efluente de la columna bloque metálico gas portador puro conexiones al puente de Wheatstone Figura 118 Esquema de un detector de conductividad térmica * Los termistores son glóbulos pequeños fabricados con mezclas de óxidos metálicos, con una capa protectora de vidrio y con un coeficiente de temperatura/resistencia eléctrica extraordinariamente grande

23 Cromatografía de gases 24 Los elementos sensibles se hallan incorporados a un puente de Wheastone, de forma que cuando pasa solamente gas portador a través de ambas células, el puente se equilibra a cero Cuando se eluye de la columna algún componente, la conductividad térmica de la mezcla de gases varía, por lo que cambia la temperatura del elemento sensible, y como consecuencia de ello también la resistencia, desequilibrándose el puente Con este tipo de detector deberá usarse helio o hidrógeno como gas portador, ya que su conductividad térmica es mucho mayor que la de casi todos los compuestos orgánicos, de modo que, incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica, tiene lugar una disminución relativamente grande de la conductividad térmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento de temperatura * El detector de conductividad térmica es uno de los primeros detectores que se usaron en CG; es relativamente sencillo y no es muy caro Responde adecuadamente a una gran cantidad de compuestos orgánicos e inorgánicos, con límites de detección del orden de 10 9 g/ml Por su parte, es un detector no destructivo y el margen lineal es de 10 4 Detector de ionización de llama (FID) Se basa en la conductividad eléctrica de los gases A temperatura y presión normales, los gases se comportan como aislantes, pero si en su interior existen átomos o moléculas cargadas eléctricamente, o electrones libres, se produce un incremento en la conductividad El detector de ionización de llama, representado esquemáticamente en la figura 119, consiste en un quemador en el que se produce una llama de hidrógeno, la cual origina muy pocos iones Sin embargo, la energía térmica de la llama es suficiente para ionizar muchas moléculas, con lo que aumenta la conductividad eléctrica a través de los compuestos de la llama Entre el extremo del mechero y un segundo electrodo colector de iones se aplica un potencial de unos cientos de voltios, midiéndose la intensidad de la corriente originada por la ionización en la llama, la cual difiere de la presentada por el gas portador y la originada por una gran variedad de sustancias * Si se toma como referencia el helio, al que se le asigna un valor de 100 para su conductividad térmica, la correspondiente para el hidrógeno es 128, mientras que para una gran cantidad de analitos orgánicos, los valores oscilan entre 6 y 17

24 Claudio González Pérez 25 Como las corrientes originadas son muy pequeñas (10 12 A) es necesaria la correspondiente amplificación llama amplificador registrador aire H 2 efluente de la columna Figura 119 Detector de ionización de llama El detector de ionización de llama es uno de los más utilizados actualmente Responde a casi todos los compuestos orgánicos, mientras que es insensible a gases no combustibles como CO 2, SO 2, óxidos de nitrógeno y el propio vapor de agua Esto hace que el detector sea particularmente adecuado para el análisis de compuestos orgánicos contaminados con agua, azufre u óxidos de nitrógeno Su sensibilidad es más elevada que la del TCD ( g/ml) y presenta un gran intervalo lineal (10 7 ), si bien, se trata de un detector destructivo Detector de captura electrónica (ECD) En el detector de captura electrónica se mide una pérdida de señal cuando el analito se eluye de la columna cromatográfica En la figura 1110 se representa un esquema del ECD, que opera de la forma siguiente: el gas portador, N 2 ó Ar, se hace pasar a través de una cámara que contiene un emisor de partículas β (Ni-63 o tritio adsorbido sobre una lámina de platino) de alta energía, las cuales, al interactuar con dicho gas portador producen grandes cantidades de electrones térmicos que se dirigen hacia un electrodo colector (por aplicación de un voltaje entre 1 y 100 V), originándose una corriente uniforme o corriente-base N 2 + β < > N e Ar + β < > Ar* + Ar + + e

25 Cromatografía de gases 26 columna 63 Ni electrodo colector Figura 1110 Detector de captura electrónica Cuando moléculas del analito con alta afinidad electrónica entran al detector, capturan algunos electrones según el proceso, AB + e > AB y A + B con lo que se produce una disminución de la corriente Esta señal se procesa electrónicamente para formar el cromatograma El detector de captura electrónica tiene un límite de detección pequeño (10 16 mol/ml) y no altera la muestra significativamente, si bien la respuesta no es lineal, aunque, pulsando el voltaje, puede alcanzarse un margen lineal de 05 a 10 3 La mayor ventaja de este detector es su selectividad, no respondiendo a hidrocarburos (excepto algunos aromáticos), alcoholes y cetonas, mientras que es especialmente sensible a moléculas que contienen halógenos, grupos carbonilo conjugados, grupos metilo, compuestos nitro y compuestos organometálicos Por ello, muchas de sus aplicaciones inciden en análisis de trazas de muestras medioambientales para disolventes clorados, gases clorofluorocarbonos, pesticidas y herbicidas (DDT, γbhc/lindano, aldrín), organometálicos (plomo tetraetilo), hidrocarburos aromáticos polinucleares cancerígenos, etc APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDO Las aplicaciones más numerosas de la CGL se encuentran en el campo del análisis cualitativo y cuantitativo de mezclas complejas de compuestos orgánicos Aunque la cromatografía es básicamente un método de separación, de cada cromatograma se

26 Claudio González Pérez 27 obtiene información cualitativa a partir de la posición de los picos, y cuantitativa, a partir de la medida de su altura o de su área Análisis Cualitativo Teóricamente, el tiempo de retención o el volumen de retención de un determinado soluto, obtenido en una columna particular a una temperatura y velocidad de flujo controlados cuidadosamente, es una propiedad característica suya, como lo es el punto de ebullición o el índice de refracción, y podría servir para identificarlo Sin embargo, cuando se parte de una muestra totalmente desconocida, es prácticamente imposible identificar sus componentes por este procedimiento, ya que los miles de compuestos conocidos hace que existan demasiadas posibilidades entre las que elegir En este sentido, la CG no puede competir con técnicas como la espectrometría de masas, la espectrometría de infrarrojo o la resonancia magnética nuclear Afortunadamente, el analista no siempre se enfrenta con muestras totalmente desconocidas, por lo que, en muchos casos, el problema puede resolverse cromatográficamente Para ello pueden seguirse varios caminos El procedimiento más simple de análisis cualitativo se realiza con ayuda de patrones: los tiempos de retención de los picos desconocidos se comparan con los tiempos de retención de compuestos conocidos, separados en la misma columna y en las mismas condiciones experimentales Como alternativa, si se sospecha la existencia de un determinado compuesto en una mezcla, se añade éste, con lo que el área de ese pico aumentará respecto a los otros picos del cromatograma Esta identificación no es definitiva cuando se realiza con un mismo tipo de columna, pero es casi concluyente cuando se hace con dos o más tipos de columnas Es muy poco probable que dos compuestos con el mismo tiempo de retención en una fase estacionaria tengan el mismo tiempo de retención en dos fases estacionarias distintas El tiempo de retención no es el parámetro ideal para la identificación de un compuesto, ya que, como se ha mencionado, depende de la temperatura, velocidad de flujo y volumen de fase líquida Por ello, es más adecuado utilizar un parámetro que sea independiente de dichos factores En este sentido se han propuesto los índices de retención de Kóvats, los cuales relacionan el volumen de retención, V R (o el tiempo de retención, t R ) del compuesto desconocido con el de dos alcanos lineales que se eluyan inmediatamente antes y después del compuesto problema Para ello, a cada uno de los dos alcanos lineales se adscribe un índice I, dado por, I = 100 n