INGENIERIA BIOQUIMICA III (Diseño de biorreactores) Oscar Monroy Hermosillo Departamento de Biotecnología Universidad Autónoma Metropolitana

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1 INGENIERIA BIOQUIMICA III (Diseño de biorreactores) Oscar Monroy Hermosillo Departamento de Biotecnología Universidad Autónoma Metropolitana OBJETIVOS 1. Que alumno comprenda el concepto de velocidad de reacción, aprenda a medir las velocidades de reacción y calcular las constantes cinéticas en los diferentes sistemas. 2. Adiestrar al alumno en la aplicación de balances de masa y energía y los tipos de cinéticas para diseñar biorreactores. 1) INTRODUCCION Todo proceso industrial debe ser diseñado para transformar las materias primas, a través de varias operaciones y reacciones, al menor precio y para producir un bien. El ingeniero bioquímico debe saber diseñar tanto las operaciones unitarias, (transformaciones físicas) como los reactores (transformaciones químicas) para obtener un buen producto. La parte más delicada del proceso, la que el ingeniero bioquímico debe entender y dominar es el cambio bioquímico. Para poder diseñar un biorreactor el ingeniero bioquímico se debe contestar estas preguntas: 1. Que cambios espera que ocurran? Hasta donde va a llegar la reacción, va a liberar o a necesitar calor (termodinámica). 2. Que tan rápido se desarrollarán? Si es muy rápida, entonces los datos termodinámicos de equilibrio serán suficientes, si no es tan rápida, entonces se requiere conocer la cinética de la reacción y la transferencia de calor y masa. 3. Cómo se van a mover y hacer contacto las partículas que toman parte en la reacción? Que tanto y que tan pronto se mezclan? Su estructura y propiedades permiten el contacto con otros reactivos? Dejarán pasar el calor producido o requerido? Con las respuestas se debe poder encontrar una ecuación de diseño o de comportamiento del reactor. condiciones salida = f(cond entrada, cinética, contacto) Con esta ecuación se pueden comparar diseños y condiciones diferentes, seleccionar el mejor y diseñar reactores de mayor tamaño. Tipos de reacciones Hay homogéneas si se llevan a cabo en una sola fase y heterogéneas si se llevan a cabo en dos o más fases. En estas últimas, los fenómenos de transporte se vuelven importantes pues la masa o el calor al pasar de una fase a la otra pueden llegar a frenar o limitar la reacción. Definición de velocidad de reacción

2 La velocidad de reacción está influenciada por la composición y energía (temperatura) del fluido. La velocidad de las reacciones -químicas y bioquímicas- depende de la temperatura y de la composición del medio. La temperatura afecta la constante específica de reacción (k) y la composición (S) que define propiamente la función de la velocidad de reacción. en donde r s = k*f (S) k = f(t) 1.1 Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción El intervalo de temperaturas capaz de activar a las enzimas para llevar a cabo las reacciones bioquímicas esta normalmente entre -5 y 95 o C. El crecimiento y el metabolismo son el resultado de varias reacciones bioquímicas acopladas. Los procariotes se clasifican de acuerdo al intervalo de temperaturas a las que crecen según se muestra en el cuadro 1.1. CUADRO 1.1 CLASIFICACION DE MICROORGANISMOS EN TERMINOS DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA CONSTANTE DE LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO grupo mínima óptima máxima o C termofílicos 40 a a a 80 mesofilicos 10 a a a 47 psicrofílicos obligados -5 a 5 15 a a 22 facultativos -5 a 5 25 a a La influencia de la temperatura esta explicada por la teoría cinética que dice que la energía cinética depende únicamente de la temperatura absoluta. Arrhenius en 1889 la describe en su ecuación empírica: k = A exp(-e a /RT) (1) en donde: k=la constante específica de la velocidad de reacción [dependen del orden de reacción] A = factor de frecuencia (de colisiones totales entre las moléculas que reaccionan) [las de k] E a = es la energía de activación [J/mol] (Figura 1). R = constante general de los gases ideales [8.314 J/mol.o K] T = temperatura absoluta [ o K] El término exp(-e a /RT) proviene de la ley de distribución de Boltzmann y aquí significa la fracción de colisiones moleculares que poseen una energía mayor que o igual a la energía de activación E a.

3 ln k Einterna tiempo Figura 1.1 Diagrama esquemático de la energía de activación de una reacción. (Williams y Williams pag 316) Midiendo la cinética de una reacción para obtener la k o la r s (si es a concentración constante) a diferentes temperaturas y tomando el logaritmo natural de la ecuación 1, se pueden obtener los valores de A y de E a como se ilustra en la figura /T (1/K) Figura 1.2. La gráfica de la ecuación de Arrhenius que muestra los límites impuestos por la temperatura de desactivación de las enzimas. (Ollis y Bailey 133) El cuadro 1.2 muestra algunos valores de la energía de activación para diferentes reacciones químicas y bioquímicas. Se puede apreciar que las primeras tienen valores mas altos, indicando una mayor dependencia en la temperatura. Incluso los valores para las esterilizaciones indican una mayor dependencia en la temperatura.

4 CUADRO 1.2 ENERGIA DE ACTIVACION DE ALGUNAS REACCIONES CARACTERISTICAS Reaccion E a (Kj/mol) Temperatura ( o C) Crecimiento celular A. niger E. coli K. aerogenes E. coli Desactivación Acido fólico Tiamina Pasteurización Esterilización B. stearothermophilus B. subtilis C. botulinum Reacción química hidrogenación de etileno catalizada homogénea descomposición NO 3 acido trimetil acético n.r. n.r. eter dipropílico (cat) 119 n.r. eter dipropílico 253 n.r. H 2 O 2 (no catalizada) (Cat con I - ) (Cat Pt coloidal) 49 (Cat con catalasa Aún a temperatura constante, las enzimas también decaen irreversiblemente siguiendo una cinética de primer orden. r E = -k d E (2) en donde: k d es la constante de desactivación y esta dada por: k d = (K B T/h)exp( S * /R)exp(-E a /RT) K B = constante de Boltzmann [1.38 x J/ o K] h = constante de Planck [ x J. s] Algunos valores de S y E a se encuentran en el Bailey y Ollis pp 134. Para reacciones que ocurren cerca de la T óptima, se propone la ecuación de Hinshelwood (1946) que combina el proceso de síntesis y de decaimiento.

5 k = A 1. exp(-ea1 /RT) - A 2. exp(-ea2 /RT)..... (3) que fue modificada i para estudiar la actividad metanogénica relativa (k) de una metanógena mesófilica y del crecimiento global (µ) en un proceso de digestión anaerobia termofílica. Encontraron que: k ó µ = k 1. exp(a1 (T - T ref ) - k 2. exp (a2 (T - T ref )) k 1 a 1 k 2 a 2 T ref ( C -1 ) ( C -1 ) C para k ó µ(d -1 ) Un parámetro comúnmente usado es el coeficiente de temperatura Q 10 definido como la tasa de cambio en la actividad microbiana entre T 1 y T 2 = T C. De esta definición y de la ecuación 1 se puede obtener la ecuación 4. Q 10 = exp {E a (T 2 - T 1 )/(RT 1 T 2 )} (4) Los valores de Y[gSSV/gDQO] y de b[d -1 ] se pueden considerar independientes de la temperatura. Sin embargo, los valores de K s si son afectados. 1.2 Efecto de la concentración en la velocidad de reacción Las reacciones químicas se pueden clasificar de acuerdo a la correspondencia de la velocidad de reacción con la estequiometría. a. Reacción elemental se llama a aquella en que las moléculas que aparecen en la ecuación estequiométrica son las que interaccionan para formar los productos. Por ejemplo en A + B -----> D la velocidad de desaparición de A está dada por -r A = k. C A. CB. En otras palabras la ecuación estequiométrica nos indica que una molecula de A reacciona con una de B y la ecuación de velocidad de reacción también nos dice que concentraciones equimolares de A y B reaccionan. La molecularidad es una subclasificación de las reacciones elementales y se refiere al número de moléculas que eventualmente reaccionan para formar los productos. De esta manera tenemos las reacciones monomoleculares, bimoleculares y trimoleculares. El ejemplo anterior se refiere a una reacción bimolecular. b. Reacciones no elementales Cuando no hay correspondencia entre la estequiometría con la velocidad de reacción tenemos tenemos este tipo de reacciones que son el resultado global de una secuencia de reacciones elementales. La razón por la que solo vemos una reacción y no a la serie de

6 reacciones elementales es que la cantidad de intermediarios formados no es detectable. Como ejemplos se tienen: 1. Reacciones en cadena: radicales libres H 2 + Br 2 <====> 2HBr Br 2 <=====> 2Br. Br. + H 2 <=======> HBr + H. H. + Br 2 ---> HBr + Br. K 1 [H 2 ][Br 2 ] 0.5 r HBr = (1.2.2) k 2 + [HBr]/[Br2 ] cuyo mecanismo es: que tiene una expresión 2. Mecanismo de intermediarios moleculares: reacciones enzimáticas E + S <=====> E + P cuyo mecanismo es: k 1 E + S <=====> ES k 2 k 3 ES > E + P que tiene una expresión k 3 [E 0 ][S] V [S] max v = = (1.2.3) K M + [S] K M + [S] Este mecanismo presenta las siguientes características que pueden deducirse al estudiar la reacción: 1. La velocidad de reacción (v) es proporcional a la concentración de enzima [E O ] introducida a la reacción. 2. A bajas concentraciones de sustrato [S], la (v) es proporcional a [S]. 3. A altas concentraciones de [S], la velocidad se vuelve independiente de [S]. 4. Se supone que la concentración del intermediario es apreciable en cuyo caso la enzima se distribuye de la siguiente manera: [E o ] = [E] + [ES]. Esta suposición permite plantear la ecuación en términos de la concentración inicial de enzima [E o ] y de [S]. 3. Orden de reacción: es una expresión empírica de la velocidad de reacción y no necesariamente se ajusta al mecanismo de reacción.

7 rp (g/l.min) Algunas veces la velocidad de reacción (involucrando las sustancias A, B, D, etc) se puede aproximar por una expresión del tipo r A = kc A a C B b...cz z en donde a+b+...+z = n a, b,...z no tienen que estar relacionados directamente con los coeficientes estequiométricos. Las potencias a las que están elevadas las concentraciones se llaman orden de reacción. De tal manera que la reacción anterior sería de a orden respecto a A b orden respecto a B z orden respecto a Z n orden respecto a la reacción El orden de reacción puede ser un número fraccional puesto que es un ajuste estadístico a la cinética. La figura 1.3 muestra la curva característica de la velocidad de consumo de sustrato en función de su concentración en el medio reaccionante. Se indica el significado de los dos parámetros V max y K M. El apéndice 1 muestra otros casos de reacciones enzimáticas cuando existen otros sustratos que compiten o inhiben S (g/l) Figura 1.3 Gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten en donde se muestra la velocidad de reacción obtenida a diferentes concentraciones de sustrato y manteniendo constante la concentración total de enzima. 3. Crecimiento de microrganismos La actividad microbiana esta compuesta de un sinnúmero de reacciones enzimáticas que se acoplan para dar lugar al crecimiento celular o a la producción de metabolitos de todos tipos. El conocimiento de la cinética de todas estas

8 funciones metabólicas permite diseñar procesos para optimizar la explotación de los microorganismos. La representación mas conocida en bioquímica es la reacción autocatalítica X o + S ----> X r x = (µ - b) X (1.2.4) en donde X es la concentración de microorganismos [M/L 3 ] t es el tiempo [T] b es la tasa especifica de decaimiento [T -1 ] µ es la rapidez específica de crecimiento [T -1 ] es una función de la concentración de sustrato. La expresión mas conocida es la de Monod. Otras se pueden ver en el Cuadro 1. (1.2.5) µ max = constante especifica máxima de crecimiento [T-1 ] S = concentración del sustrato (o reactivo) [M/L 3 ] K s = constante de saturación o de afinidad de sustrato [M/L 3 ]. Muchas veces es importante seguir la cinética midiendo el consumo de sustrato, para eso es necesario definir el coeficiente de rendimiento Y [M biomasa/m sustrato], {g SSV/g DQO} (1.2.6) Combinando las ecuaciones y se obtiene: (1.2.7) q S = coeficiente de utilización de sustrato[m/m. T] En una reacción del tipo autocatalítica, al empezar, la reacción es lenta y aumenta a medida que X aumenta. A medida que se agota S, la velocidad de reacción disminuye según se esquematiza en la figura 1.4.

9 rx (g/l.hr) g/l rx (g/l.hr) S (g/l) X S tiempo (hr) S (g/l) Figura 1.4 Gráficas esquematizadas que muestran el comportamiento de las reacciones autocatalíticas. (a) Evolución de X y S respecto al tiempo, (b) Evolución de la velocidad de reacción respecto a la concentración de sustrato (Ecuaciones y 1.2.6).

10 2. OBTENCION E INTERPRETACION DE DATOS CINETICOS Como hemos visto una ecuación cinética caracteriza a la velocidad de reacción. Esta expresión puede ser sugerida por consideraciones teóricas o puede ser el resultado de un procedimiento empírico de ajuste de curvas. La determinación de la ecuación de velocidad normalmente es un procedimiento de dos pasos. Primero, se encuentra la dependencia de la concentración a una temperatura fija y después se encuentra la dependencia de las constantes en la temperatura. De esta manera se encuentra la expresión completa de la velocidad de reacción. La información empírica se puede encontrar en dos tipos de equipo de laboratorio; los biorreactores intermitentes y los biorreactores continuos. Los reactores intermitentes son muy sencillos de operar y de escalar. Se deben usar para obtener datos cinéticos en reacciones HOMOGÉNEAS. Los reactores continuos son usados para obtener datos de reacciones heterogéneas aunque algunas veces se usan para complementar la información de los reactores intermitentes. Por ejemplo en las reacciones que son difíciles de seguir, las que dan varios productos, las que son muy rápidas o las que se efectúan en el estado gaseoso son más fáciles de seguir en los reactores continuos. REACTORES IDEALES Estos son el reactor intermitente, el de flujo pistón, el de flujo mezclado. Estos tipos de reactores son los mas fáciles de estudiar. Normalmente uno de estos tres o sus combinaciones representan el mejor modo de poner en contacto a los reactivos. En el laboratorio es fácil aproximarse a cualquiera de estos modelos de flujo y por eso se usan para el estudio de las cinéticas de las reacciones. Los reactores reales son una combinación de reactores ideales. Por esta razón se procura diseñar a los reactores reales para que su operación se asemeje a los ideales. Para interpretar la información cinética que se obtiene de un experimento corrido en cualquiera de los reactores ideales de laboratorio es necesario estudiar, en cada uno de ellos, la forma en que se ponen en contacto los reactivos y eventualmente los productos. El equipo que se usa para tratar las reacciones homogéneas puede ser de tres tipos, el reactor intermitente (batch), el de flujo pistón y el de flujo mezclado. El punto de arranque para diseñar un reactor es la ecuación de balance de un reactivo o un producto en un elemento diferencial (volumen, distancia, area) del reactor: {Acumulación de materia en el reactor} = {Materia que entra} - {Materia que sale} ± {materia que cambia por reacción} Cuando la composición es uniforme en todo el reactor, el balance se puede hacer sobre todo el reactor. Cuando la composición no es uniforme, el balance se hace

11 sobre un elemento diferencial de volumen y después se integra sobre todo el reactor considerando las condiciones apropiadas de flujo y concentración. En operaciones no isotérmicas, como son las fermentativas, se debe hacer también el balance de energía. Reactor intermitente o cerrado. En este tipo de fermentadores los reactivos se añaden al reactor, empieza la reacción, los reactivos se van consumiendo y los productos aparecen hasta que se agotan los primeros o los segundos se acumulan hasta el punto de detener la reacción. El perfil de la concentración de las especies cambia con el tiempo como se ilustra en la figura 1.3. Se considera que los contenidos están perfectamente mezclados o que no hay gradientes de concentración dentro del reactor. El balance de materia en el reactor nos dice que: {Acumulación de materia en el reactor} = {Materia que entra} - {Materia que sale} ± {materia que cambia por reacción} {velocidad de acumulación en el reactor} = {velocidad de cambio por reacción} El cambio de concentración en el reactor se debe exclusivamente a la velocidad de reacción. dc V ---- = V r c (2.1) dt en donde C = X, S, P Integrando: (2.2) Que es la ecuación que calcula el tiempo de reacción en un reactor intermitente. Reactor de flujo pistón (FP). Este modelo ideal de flujo implica que cada sección longitudinal de fluido se mueve sin ningún tipo de interacción con secciones vecinas. El sistema es completamente segregado y cada sección se comporta como un fermentador cerrado. Balance de materia en el elemento diferencial (z+δz)a {Acumulación = {Materia que - {Materia que sale} ± {materia que

12 de materia en el reactor} entra} AuC z - AuC z+ Δz + A. Δz. r c = 0 cambia por reacción} z z+δz A u-----> uc] z ---->uc] z+ z ----->u z=0 z=l en donde r c = velocidad de cambio de la especie C [M/L 3.Ø] A = sección transversal del fermentador [L 2 ] u = velocidad del flujo [L/Ø] C = concentración de la especie C [M/L 3 ] Dividiendo entre A Δz y tomando límites se tiene y al no haber cambio de fase Y como Integrando entre los límites Co y Cf se obtiene el tiempo de reacción en un reactor de flujo pistón. L Si Co i = Co p y t i = t p = ---, entonces Cf i = Cf p (2.3)

13 u Reactor de flujo mezclado. Un balance de materia alrededor del reactor de la figura 3: {Acumulación de materia en el reactor} = {Materia que entra} - {Materia que sale} ± {materia que cambia por reacción} En estado estacionario; (2.5) V/F = t m = D -1 en donde t m es el tiempo de reacción en un reactor de flujo mezclado. D es la tasa de dilución [T -1 ] C puede ser S, P o X