ANIMALES TRANSGENICOS
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- Carlos Parra García
- hace 8 años
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1 ANIMALES TRANSGENICOS KNOCK-OUT: disrupción o deleción de un gen o de un dominio funcional del mismo KNOCK-IN: introducción de modificaciones en un gen o de otro gen heterólogo * APLICACIONES Mecanismos de regulación de la expresión génica Función de genes: bases genéticas de la enfermedad Aplicaciones biotecnológicas: granjas moleculares Modelos de enfermedades humanas : estudios fisiopatológicos Identificación factores ambientales y genéticos asociados a enf. complejas Modelos para terapia génica Banco de pruebas de drogas y medicamentos, transplantes...
2 OBTENCIÓN DE UN TRANSGÉNICO: -recombinación homóloga vs no-homóloga no-homóloga: Efecto posicional (expresión dependiente de sitio de integración) Inserción en un gen endógeno Número de copias del transgén integradas homóloga: frecuencia muy baja -expresión del gen: tipo de promotor (ubicuo, específico de tejido, inducible...) -vectores: virales y no virales -introducción del vector: microinyección, transfección de células ES
3 OBTENCION DE TRANSGENICOS I
4 OBTENCION DE TRANSGENICOS II
5
6 TIPOS DE VECTORES VIRALES : RETROVIRUS ADENOVIRUS Y ADENOASOCIADOS LENTIVIRUS NO VIRALES
7 TERAPIA GÉNICA: PROBLEMAS CON VECTORES VIRALES REPUESTA INMUNE ELIMINACIÓN GENES VIRALES EN EL VECTOR (ADENOVIRUS) ESPECIFICIDAD MODIFICACION PROTEÍNAS CAPSIDA, TRANSCRIPCION DIRIGIDA.. MUTAGENESIS INSERCIONAL (RETROVIRUS) GENES SUICIDAS INTEGRACION ESPECIFICA
8 2. TERAPIAS FARMACOLOGICAS Y GENETICAS BASADAS EN EL GENOTIPO -TRATAMIENTO PRETRANSCRIPCIONAL (activadores transcripción) -TRATAMIENTO POSTTRANSCRIPCIONAL (SOBRE EL RNA) readthrough mutaciones nonsense (aminoglucósidos) modulación de splicing (drogas, AONs) silenciamiento génico (RNAi, AONs) -TRATAMIENTO POSTTRADUCCIONAL (SOBRE LA PROTEÍNA) chaperonas farmacológicas (mutaciones de plegamiento) cofactores (mutaciones de Km)
9 Oligonucleótidos antisense (AONs): Oligoribonucleotidos o oligodeoxinucleotidos Se modifica el esqueleto para evitar degradación por nucleasas (fosforotioato)
10 TERAPIAS CON AONS EN LA ENFERMEDAD DE DUCHENNE La distrofia muscular de Duchenne (DMD) y su forma más leve, la distrofia muscular de Becker (BMD), están causadas ambas por mutaciones en el gen DMD, localizado en el cromosoma X, el cual codifica por distrofina. En DMD, la ausencia de distrofina induce una pérdida continua de fibras musculares, que finalmente causa la muerte prematura en la adolescencia. En BMD, una distrofina parcialmente funcional permite un fenotipo más suave y una esperanza de vida mayor. DMD afecta a 1:3.500 varones recién nacidos. BMD tiene una incidencia de 1:
11 La distrofina es un componente esencial del complejo distrofinaglicoproteína (DGC), que mantiene la integridad de la membrana en las fibras musculares.
12 BASES MOLECULARES DE DISTROFIA MUSCULAR Las mutaciones más frecuentes en DMD son deleciones de exones que provocan cambios en la fase de lectura y ausencia de distrofina FENOTIPO GRAVE= DMD Cuando las deleciones en el gen DMD no causan cambios en la fase de lectura, se produce una proteína parcialmente funcional FENOTIPO LEVE =BMD
13 De todas las mutaciones asociadas a DMD, la más frecuente es la deleción del exón 45, que provoca cambio en la fase de lectura La deleción de los exones (EN FASE) está asociada a la forma más suave BMD.
14 OBJETIVO convertir un fenotipo grave de DMD en uno más suave de BMD, modificando el mecanismo de splicing mediante AONS AON EX 46 Se diseñan AONs que hibridan de manera específica con secuencias de splicing del exón de interés, bloqueando estas secuencias y promoviendo la deleción (skipping) de ese determinado exón
15 Diseño de AONs contra el exón 46. Transfección de células musculares de pacientes RT-PCR y secuenciación SE RESTAURA LA SINTESIS DE DISTROFINA:
16 Mecanismo RNAi (sirna:small interfering RNA) (RISC: RNA Induced Silencing Complex)
17 Metodología para la aplicación del RNAi en humanos
18 Chaperona farmacológica
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