Trabajo práctico Nº MEDICIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS La determinación de la concentración de pigmentos fotosintéticos nos permite estimar la biomasa y la capacidad fotosintética del fitoplancton. La calidad, distribución y relación entre las distintas clases de pigmentos nos indica el estado fisiológico de la comunidad y la composición del fitoplancton en cuanto a grupos algales. La concentración de pigmentos varía ampliamente y depende del metabolismo algal y de factores físico-químicos como la luz, la temperatura y la disponibilidad de nutrientes. Los pigmentos algales consisten principalmente en clorofilas (a, b y c) y carotenoides (carotenos y xantófilas). Para estimar su concentración el método consiste en extraer los pigmentos mediante un solvente orgánico y leer en un espectrofotómetro la absorción de luz a la longitud de onda específica para cada pigmento. Se toma una muestra de agua cuyo volumen varía entre 0,5 y 5 litros de acuerdo a la concentración algal. La muestra se filtra con filtro de fibra de vidrio para retener las algas en el mismo. Luego el filtro se tritura agregándole un volumen de 10 ml de acetona al 90% para preparar un extracto. El mismo se coloca en un tubo de ensayo y se guarda a 4ºC durante 24 horas. La finalidad de estos procedimientos es que las células algales se rompan y los pigmentos se disuelvan en la acetona. Posteriormente los tubos de ensayo se centrifugan (2.000 a 3.000 rpm durante 10 minutos) para separar los restos del filtro. El extracto resultante se coloca en una celda de 1 cm de recorrido óptico (o de 5 cm si su concentración de clorofila es muy baja) y se leen las densidades ópticas (absorbancias) a las distintas longitudes de onda en un espectrofotómetro: - 750 nm: turbidez de la muestra - 664 nm: clorofila a - 647 nm: clorofila b - 630 nm: clorofila c - 430 nm: carotenoides para el cálculo del Indice de Margalef 1
Luego de realizar estas lecturas se agregan 3 gotas de HCl 0,1 N al extracto en la celda para acidificarlo, logrando que toda la clorofila se degrade y se transforme en feofitina, entonces se vuelve a leer la absorbancia a 665 y 750 nm. A las lecturas de absorbancia a 664, 647, y 630 nm se les debe restar la lectura a 750 nm, obteniéndose las lecturas corregidas. Se utilizan diferentes fórmulas para estimar la concentración de pigmentos en la muestra de agua a partir de estos datos (Clesceri et al., 1998): Clorofila a, mg/m 3 = 26.7 (DO 664 antes DO 665 después ) V 1 V 2 L Feofitina a, mg/m 3 = 26.7 [1,7 (DO 665 después ) DO 664 antes ] V 1 V 2 L V 1 = volumen del extracto en ml V 2 = volumen de la muestra filtrado en litros L= largo del paso de luz, o sea, ancho de la celda en cm 664 antes = densidad óptica o absorbancia del extracto antes de acidificarlo 665 después = densidad óptica o absorbancia del extracto después de acidificarlo Método tricromático para determinación de clorofilas a, b y c Cl a = 11,85 (DO 664) - 1,54 (DO 647) 0,08 (DO 630) Cl b = 21,03 (DO 647) 5,43 (DO 664) 2,63 (DO 630) Cl c = 24,52 (DO 630) 7,60 (DO 647) 1,67 (DO 664) Luego de determinar la concentración de estos pigmentos en el extracto (para celda de 1 cm de paso de luz) se calcula su concentración en la muestra de agua con la siguiente fórmula: Clorofila a, b o c, mg/m 3 = Cl a, b o c V 1 V 2 El Indice de Margalef (DO430/DO665) nos da una idea del estado de madurez de la asociación algal y se calcula dividiendo las absorbancias a estas longitudes de onda (Margalef, 1983). El valor del índice es bajo (alrededor de 2) cuando se trata 2
de una asociación joven con alta productividad por unidad de biomasa y alto (de 5 a 7) cuando se trata de una comunidad madura con baja tasa de renovación. BIBLIOGRAFIA Clesceri L. S., Greenberg A. E. & Eaton A. D. (Eds.). 1998. Standard methods for the examination of water and wastewater. (APHA, American Public Health Association, Washington D.C.) Margalef, R. 1983. Limnología. Barcelona, 1010 p. 3
Grupos algales y sus principales pigmentos (+ = presente) (Margalef, 1983) Cianofíceas (Cyanophyta, Cianobacteria, Nostocophyceae, Schizomycophyta) Clorofilas a b c 1 c 2 d Ficobilinas Carotenoides principales + - - - - + β-caroteno, equinenona, zeaxantina, mixoxantofila, oscilaxantina Rodofíceas (Rodophyta) + - - - + + α- y β-caroteno, luteína, zeaxantina, anteraxantina Dinofíceas (Dinophyta) + - + + - - β-caroteno, fucoxantina, diadinoxantina, peridinina Criptofíceas (Cyptophyceae) + - - + - +? α-caroteno, aloxantina Rafidofíceas (Raphidophy- + - + - - - ceae, Chloromonadales) Crisofíceas (Chrysophyceae+Haptophyceae+ Craspedophyceae) Diatomeas (Bacillariophyceae) Xantofíceas (Xanthophyceae, Heterocontae+ Eustigmatophyceae) Feofíceas (Phaeophyta, Fucophyceae) Euglenales (Euglenophyceae) Prasinofíceas (Prasinophyceae) Clorofíceas (Euchlorophyceae+Zygophyceae (conyugadas)+charophyceae) + - + - - - α- y β-caroteno, fucoxantina, diatoxantina, diadinoxantina + - + - - - β-caroteno, fucoxantina, diatoxantina, diadinoxantina + - + - - - β-caroteno, diadinoxantina + - + - - - β-caroteno, fucoxantina, violaxantina + + - - - - β-caroteno, equinenona, anteroxantina, neoxantina + + - - - - α- y β-caroteno, neoxantina, violaxantina + + - - - - α- y β-caroteno, luteína, neoxantina, violaxantina, zeaxantina (macrófitos) 4
Muestra V1 (ml) volumen solvente Peso seco (g) V2 (L) volumen filtrado T Turbidez D 750 D 430 D 430 -T D 630 D 630 -T D 647 D 647 -T D 664 D 664 -T D 665a D 750a D 665a -T a Muestra Clorofila a (µg l -1 ) Clorofila b (µg l -1 ) Clorofila c (µg l -1 ) Feopigmentos (µg l -1 ) D 430 /D 665 5