GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ. Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero de Producción Agroindustrial

DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH REGULADO Y TEMPERATURA DE 25 C EN EL BIORREACTOR BIOFLO 3000 M1227 Y ESTUDIO INICIAL DE FERMENTACIONES EN SISTEMA CONTINUO GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero de Producción Agroindustrial Director BERNADETTE KLOTZ Bióloga ROSA ERLIDE PRIETO Química UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL BOGOTA, D.C. 2001

Nota de aceptación Presidente del Jurado Jurado Jurado Bogotá D.C, 16 de Julio del 2001

A mis Padres por su paciencia y colaboración durante estos dos años. Julián Pedroza A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma y mis hijos. Mauricio Ramírez

AGRADECIMIENTOS Los autores expresan sus agradecimientos a: La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto, por su valiosa colaboración y orientación para el desarrollo del mismo.

CONTENIDO RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV INTRODUCCION --------------------------------------------------------------------- XV 1. OBJETIVOS -------------------------------------------------------------------------16 1.1 GENERAL --------------------------------------------------------------------------16 1.2 ESPECÍFICOS---------------------------------------------------------------------16 2. REVISION BIBLIOGRAFICA----------------------------------------------------17 2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ---------------------------------------------------------------------------17 2.1.1 Biología de las fermentaciones ------------------------------------------------------------ 17 2.1.1.1 Glucólisis -------------------------------------------------------------------------------------- 17 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos-------------------------------------------- 21 2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura------------------------------------------- 22 2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono-------------------------------------- 23 2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrógeno------------------------------------ 23 2.1.3 Condiciones de la fermentación ----------------------------------------------------------- 24 Pág 2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA 25 2.2.1 Temperatura ------------------------------------------------------------------------------------ 25 2.2.2 ph-------------------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.2.2.1 Ajuste del ph --------------------------------------------------------------------------------- 27 2.2.2.2 Buffers ----------------------------------------------------------------------------------------- 27 V

Contenido VI 2.2.3 Aireación ----------------------------------------------------------------------------------------- 28 2.3 BIORREACTORES ------------------------------------------------------------------------- 28 2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores ----------------------------------------------------- 28 2.3.2 Monitoreo de la fermentación -------------------------------------------------------------- 29 2.3.3 Retroalimentación ----------------------------------------------------------------------------- 30 2.4 CULTIVOS CONTINUOS ---------------------------------------------------------------- 30 2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo --------------------------------------- 32 2.4.2 Cinética del cultivo continuo----------------------------------------------------------------- 32 3. MATERIALES Y METODOS ------------------------------------------------------------- 35 3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35 3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36 3.2.1 Diagramas de flujo ---------------------------------------------------------------------------- 36 3.2.1.1 Pruebas preliminares ---------------------------------------------------------------------- 36 3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------ 36 3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares ---------------- 37 3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo ------- 38 3.2.4 Activación e inoculación de la levadura ------------------------------------------------- 38 3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar ------------------------------- 39 3.2.5.1 ph ----------------------------------------------------------------------------------------------- 39 3.2.5.2 Número de microorganismos ------------------------------------------------------------ 39 3.2.5.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa--------------------------------- 39 3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares---------------------- 39 3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo --------------------------------------------------------- 39 3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo ----------------------------------------------------- 40 3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de ph ---------------------------------------- 40 3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo--- 40 3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo --------------------- 41 3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación ----------------------------------------- 41 3.2.11.2 Técnicas utilizadas------------------------------------------------------------------------ 42 3.2.11.3 Validación estadística de los datos--------------------------------------------------- 42

Contenido VII 3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42 3.3 MATERIALES Y METODOS------------------------------------------------------------ 42 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total-------------------------- 42 3.3.1.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 42 3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 43 3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 44 3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 45 3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.3.2.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 45 3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47 3.3.2.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 48 3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara de conteo Neubauer Improved --------------------------------------------------------------------- 48 3.3.3.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 48 3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 49 3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por el método de destilación simple ------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 50 3.3.4.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ------------ 51 3.3.5.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 51 3.3.5.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 51

Contenido VIII 3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51 3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51 4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS ----------------------------------------53 4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS PERISTÁLTICAS ----------------------------------------------------------------------53 4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de ph--------55 4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56 4.2.1 Porcentajes de variación de ph para los medios semisintético y natural ------ 57 4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO---- 57 4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación alcohólica-- 57 4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base--------------------------------- 58 4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58 4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58 4.4.1 Calibración de método de determinación de nitrógeno total ----------------------- 59 4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea ------------------------------- 59 4.4.1.2 Curva de calibración para etapa de destilación y titulación---------------------- 60 4.4.2 Calibración del método de determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62 4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS EN EL BIOFLO-------------------------------------------------------------------------------------- 63 4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63 4.5.2 Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa-------------------------------- 65 4.5.3 Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66 4.5.4 Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol----------------- 66 4.5.5 Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación de ph ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67 4.5.6 Variación de ph en las fermentaciones sin control de ph -------------------------- 68 5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69

Contenido 5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69 5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 70 5.3 ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS-------------------- 70 5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de nitrógeno total------------------------------------------------------------------------------------------- 70 5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de azúcares reductores residuales-------------------------------------------------------------------- 71 5.4 ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72 5.4.1 Crecimiento de microorganismos --------------------------------------------------------- 72 5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa-------------------------------------------73 5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ----------------------------------- 76 5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------------------- 76 5.4.4.1 Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones---------------- 77 5.4.5 Comportamiento del ph en fermentaciones sin regulación de ph --------------- 82 5.5 ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO-------------------------------------------------------------- 82 CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 85 RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 87 ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 88 BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------- 105 IX

LISTA DE TABLAS Pág Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23 Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis------- 24 Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29 Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados--------------------------------------------------------- 35 Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintéticos ------------------------------------------------------ 37 Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38 Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristálticas------------------------------- 54 Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida empleando tubo de silicona de 1/8 --------------------------------------------------------------- 55 Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético ----------------------------------------------- 56 Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56 Tabla 4.5 Porcentajes de variación de ph------------------------------------------------------ 57 Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes velocidades de agitación-------------------------------- 57 Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes concentraciones ------------------------------------------- 58 Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl--------------------- 59 Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilación y titulación del método Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61 Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azúcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62 Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64 Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógenos celular por mililitro ---------------- 65 Tabla 4.13 Resultados de toma de Brix a 20 C--------------------------------------------- 66 Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales-------- 67 X

Lista de Tablas Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67 Tabla 4.16 Variación de ph en una fermentación sin control de ph -------------------- 68 Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total en diferentes estandarizaciones realizadas---------------------------------------------------- 71 Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo ----------------------------------------------------------------------------------------------- 72 Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo -------------- 73 Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula ----------------------------------- 74 Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula ----------------- 75 Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio ------------------------------------------------------------------------------- 79 Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------- 80 Tabla 5.8 Valores de s e y x e a diferentes valores de tasa de dilución y µmax para una fermentación en sistema continuo.---------------------------------------- 84 XI

LISTA DE FIGURAS Pág Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis ------------------------------------------------------------ 19 Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis ------------------------------------------------------- 20 Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis --------------------------------------------------------- 20 Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21 Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular ------------------------ 22 Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30 Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31 XII

LISTA DE ANEXOS Pág Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88 Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90 Anexo C Datos del seguimiento de una fermentación con flujos de entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94 Anexo D Sistema de bombas peristálticas del Bioflo 3000 M1227 --------------------- 100 XIII

RESUMEN En la línea de investigación de fermentación, se continuó con el conocimiento en el manejo y funcionamiento del biorreactor; este trabajo presentó un aporte complementario enfocado a la evaluación del sistema de regulación de ph y su incidencia en el desarrollo de una fermentación alcohólica. Para establecer la influencia de la variable ph se determinó parámetros como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno, consumo de sólidos solubles totales, contenido de sacarosa, contenido de etanol y contenido de azúcares residuales, comparando una fermentación con regulación de ph contra una sin regulación, presentando mejor rendimiento al controlar el ph. Para el estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo, el biorreactor presentó inconsistencias en los flujos que no permitieron desarrollar dicho proceso. Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated ph on an ethanolic fermentation at 25 C. Also, through this study it was want to complete instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non controlled ph: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized. XIV

INTRODUCCION La facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana adquirió un biorreactor para investigación en el área de fermentaciones y como apoyo en la formación académica. Los trabajos anteriormente realizados en el Bioflo se centraron en establecer una guía de manejo y funcionamiento de éste, determinando la precisión y la reproducibilidad de fermentaciones alcohólicas a temperatura constante de 30 C y 25 C. El presente trabajo es un complemento al manejo del biorreactor, en el cual se evalúa el sistema de regulación de ph y los sistemas continuos de cultivo, brindando un aporte al protocolo de operación del equipo. El monitoreo y control de una fermentación es un área activa de investigación que busca mejorar la eficacia de los bioprocesos, alcanzando uniformidad y confiabilidad en el proceso de fermentación. La variable ph es de gran importancia ya que afecta al proceso fermentativo de diversas maneras, produciendo reacciones no deseadas, inhibiendo la actividad enzimática de las levaduras y formando productos no esperados en el proceso de fermentación. Es por esto que el trabajo está orientado al manejo y funcionamiento del biorreactor en el desarrollo de una fermentación alcohólica a ph regulado y temperatura óptima de 25 C para el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de medir la reproducibilidad de esta fermentación se realiza el seguimiento de parámetros tales como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles, contenido de azúcares reductores residuales y contenido de etanol. Adicionalmente se continuó con la estandarización de los métodos analíticos aceptados internacionalmente a las condiciones del laboratorio de investigación de la Facultad. Se han realizado nuevas adquisiciones de equipos, que ofrecen mejor exactitud y precisión en los análisis, como lo es la determinación de contenido de nitrógeno total en una muestra. A la vez se empleo el método de titulación de Lane y Enyon, alternativo para determinación de azúcares reductores residuales diferente al método colorimétrico empleado en las anteriores investigaciones. Como parte principal de la guía complementaria de manejo y funcionamiento del Bioflo, se encuentra la configuración de los sistemas de bombas peristálticas, necesarias para controlar variables como ph en una fermentación alcohólica y dar pie al uso del biorreactor en sistema continuo, lo cual se evaluó de manera preliminar en el presente trabajo y servirá para el que desee profundizar las investigaciones realizadas por la facultad de Ingeniería en la línea de fermentación. XV

CAPITULO 1 OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar una fermentación alcohólica a ph regulado y temperatura constante en el Bioflo y realizar un estudio preliminar de fermentaciones en sistema continuo. 1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS Determinar mediante fermentaciones alcohólicas preliminares, qué medio de cultivo, semisintético o natural, presenta un mayor rango de variación de ph. Determinar la concentración necesaria de ácido y base a ser utilizada en la regulación de ph y configurar de manera preliminar los sistemas de bombas peristálticas del Bioflo. Determinar la reproducibilidad de una fermentación alcohólica en el biorreactor a ph constante y temperatura de 25 C. Establecer una guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del biorreactor en una fermentación alcohólica utilizando el sistema de regulación de ph. Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos 16

CAPITULO 2 REVISION BIBLIOGRAFICA En éste capítulo se presenta el marco teórico para el desarrollo del siguiente trabajo. Básicamente se hace una revisión sobre la fermentación alcohólica, variables que afectan la fermentación, el funcionamiento de un Biorreactor y la teoría básica sobre fermentaciones en sistema continuo. 2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE. La fermentación en gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos, levaduras o bacterias, pero las levaduras son las más utilizadas por su papel en la fabricación de bebidas alcohólicas. Son los microorganismos que más se usan en la bioindustria, se pueden cultivar por las células mismas y por los productos finales que se producen durante la fermentación alcohólica. La producción de alcohol por levadura se realiza por una fermentación alcohólica anaeróbica, del cual resulta un rendimiento menor de células, pero cantidades satisfactorias de alcohol y CO 2. Durante los primeros días del proceso de fermentación, las células de levadura crecen por respiración consumiendo oxigeno y creando un medio anaerobio. Tan pronto como él oxigeno desaparece se inicia la fermentación, produciendo alcohol. La levadura pasa de metabolismo aerobio al anaerobio. La tolerancia al alcohol depende, además de las características genéticas de la cepa, de diversos factores ambientales como la concentración de azúcares en el medio desde el inicio de la fermentación y en fases posteriores, temperatura, ph y de manera importante la concentración del etanol en las diferentes etapas de la fermentación. 2.1.1 Biología de las fermentaciones. 1

Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El etanol se produce en la ruta de glucólisis, específicamente en la vía anaeróbica, en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehído y etanol. La reacción global es la siguiente: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi 2 Etanol + 2 CO 2 +ATP + Energía El rendimiento teórico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49 gramos de CO 2. Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO 2 alcanzan el 90% del valor teórico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la célula (Owen, 1991, 134). En cuanto a la estructura celular de la levadura, la envoltura de la célula de levadura incluye una membrana plasmática, un espacio periplásmico y una pared celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos. La pared tiene una estructura semirrígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil. 2.1.1.1 Glucólisis La glucólisis ejemplifica de que manera los procesos bioquímicos de una célula se desarrollan en pequeños pasos secuenciales, los cuales son catalizados cada uno por una enzima específica. Los primeros pasos de la glucólisis requieren de un ingreso de energía, que es suministrada por el acoplamiento de estos pasos al sistema ATP/ADP. La secuencia completa comienza con una molécula de glucosa. Se invierte energía en los pasos 1 y 3 por transferencia, en cada paso, de un grupo fosfato desde una molécula de ATP a la molécula de azúcar. La molécula de 6 carbonos, proveniente de la glucosa presenta la lisis en el paso 4 y a partir de este paso en adelante la secuencia produce energía. Cabe anotar que en este paso se producen 2 moléculas de gliceraldehído fosfato que en el paso final producirá las dos moléculas de ácido pirúvico. En los pasos 6 y 9 las moléculas de ADP toman energía del sistema, fosforilándose a ATP. De esta forma la molécula de glucosa se ha convertido en dos moléculas de ácido pirúvico. La ganancia neta de energía son dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH por molécula de glucosa. El ácido pirúvico obtenido en la glucólisis puede seguir dos vías. Una vía es aeróbica (respiración) y la otra es anaeróbica (fermentación). La vía aeróbica es la vía principal del metabolismo energético de las levaduras en presencia de oxígeno y la vía anaeróbica es la vía fermentativa que funciona en ausencia de un aceptor externo de electrones. En ausencia del oxígeno el ácido pirúvico se convierte en etanol. La siguiente gráfica muestra las dos etapas de la glucólisis; La primera etapa usa ATP y la segunda produce ATP y NADH. 2

Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis Fuente: CURTIS, Helena. Biología. Vía anaeróbica o fermentación: Los pasos por los cuales el ácido pirúvico, formado por la glucólisis, se convierte anaerobiamente en etanol. En el primer paso se desprende CO 2. En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el acetaldehído. La mayoría de la energía potencial de la glucosa permanece en 3

el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol más 2 moléculas de CO 2 a partir una molécula de glucosa. Glucosa 2 Etanol + 2 CO 2 Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis Fuente: CURTIS, Helena. Biología. Vía aeróbico o respiración: En presencia de oxígeno, la siguiente etapa de la degradación de la glucosa implica la oxidación progresiva del ácido pirúvico a CO 2 y agua, proceso conocido como respiración. El paso previo es la oxidación del ácido pirúvico a un grupo acetilo de dos carbonos que se combina con la coenzima A para formar el acetilcoa. El acetilcoa entra en el ciclo de Krebs que es el siguiente paso de la respiración, en el cual los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a CO 2 y los átomos de hidrógeno pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la glucólisis, en cada paso interviene una enzima específica. Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis Fuente: CURTIS, Helena. Biología 4

La secuencia respiratoria completa es: Glucosa + 6 O 2 6 CO 2 + 6 H 2 O + Energía 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos Una población de microorganismos presenta generalmente un patrón de crecimiento característico cuando se inocula en un medio de cultivo fresco. Fase de retraso: En esta fase las células se ajustan a las nuevas condiciones. Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el crecimiento exponencial continua a la misma velocidad. Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las células aumenta progresivamente. Transcurrido un periodo de tiempo, las células crecen a una velocidad máxima constante y no dependen de la concentración de substrato. La siguiente gráfica ilustra este comportamiento. Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de crecimiento de un microorganismo Fuente: TREVAN, M. Biotecnología: principios biológicos. La zona B a C equivale a la fase exponencial del cultivo, con substrato en exceso y un crecimiento a una velocidad máxima constante. La zona A a B corresponde a la desaceleración de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase exponencial hasta el inicio de fase estacionaria. En la fase exponencial, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse mediante la siguiente ecuación: N t = N 0 x 2 n donde: N t es número de células en un tiempo t N 0 es el número de células inoculadas n es el número de generaciones al tiempo t 5

Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de los nutrientes indispensables se agota o algún producto de desecho fabricado en el medio llega a un nivel en el que es inhibidor y cesa el crecimiento exponencial. En la fase estacionaria no hay incremento ni decremento en la cantidad de células, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar, incluyendo el metabolismo energético y la producción de metabolitos secundarios. Fase de muerte: Después de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la incubación de las células, estas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más probable es que mueran. En algunos casos, la muerte se acompaña por lisis celular, dando a lugar a disminución en el conteo microscópico directo junto con la disminución del conteo de viabilidad. Gráficamente, en escala semilogarítmica se observa el comportamiento típico del crecimiento de una población de microorganismos. Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular Fuente: BROCK, T. Microbiología. 2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han añadido los nutrientes apropiados. La solución acuosa que contiene los nutrientes necesarios 6

se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que pueden ser substancias orgánicas o inorgánicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener fuentes de carbono, de nitrógeno y macro y micro nutrientes respectivos. Un medio de cultivo óptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la máxima producción. La composición de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentación. En general los requerimientos básicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla. Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes NUTRIENTE FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO CARBONO GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO DE LEVADURA, PEPTONA NITROGENO ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO 3, (NH 4) 2SO 4, FOSFORO Na 2HPO 4, KH 2PO 4 AZUFRE Na 2SO 4, H 2S POTASIO KCL, K 2HPO 4 MAGNESIO MGSO 4, MgCL 2 SODIO NaCl HIERRO QUELATOS DE HIERRO, FeCl 3 MICRONUTRIENTES MnSO 4, CuCl 2, ZnCl 2, CoCl 2, NiCl 2, Na 2MoO 4, Na 2Se 4 Fuente: BROCK, T. Microbiología 2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energía en la industria de la fermentación. Por razones económicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez son utilizadas como única fuente de carbono, excepto en los procesos que exigen el control exacto de la fermentación. La melaza, el extracto de malta, el almidón, las dextrinas, la celulosa y los aceites vegetales son utilizados comúnmente como fuentes de carbono en diversos procesos fermentativos. 7

2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrógeno Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso como fuente de nitrógeno. Una fuente de nitrógeno que es metabolizada eficientemente es el líquido de maceración del maíz, que se forma durante la formación de almidón a partir de maíz. Los extractos de levadura son excelentes substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras para la aplicación industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de maní, la harina de soya, las semillas de algodón y las semillas de girasol. El extracto de levadura es medio complejo y su composición se presenta a continuación. Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis COMPOSICIÓN (%) MATERIA SECA 70 NITROGENO TOTAL 8.8 PROTEINA (N * 6.25) 55 AMINOACIDOS 38.4 CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm) TIAMINA 20-30 RIVOFLAVINA 50-70 PIRIDOXINA 25-35 ACIDO PANTOTENICO 200 NIACINAMINDA 600 Fuente: CRUEGER, W. Biotecnología: Manual de microbiología industrial. El extracto de levadura al ser un medio complejo, provee de la mayoría de los factores potenciales de crecimiento, factores que consisten en vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas, los cuales no pueden ser sintetizados por algunos microorganismos. Se establece que los medios de cultivo para llevar a cabo una fermentación alcohólica a nivel laboratorio, que muestran mayor rendimiento son los que utilizan extracto de levadura, acompañado de un complejo vitamínico (Alba y Sierra, 1999, 123) 2.1.3 Condiciones de la fermentación. En la fermentación alcohólica las levaduras utilizan los azúcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular. 8

Aunque las fermentaciones alcohólicas son en gran medida anaerobias, las levaduras necesitan algo de oxígeno para sintetizar algunos esteroles y ácidos grasos insaturados. Muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de hasta el 12 % al 14%. Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18% a 20% de alcohol, aunque la velocidad de fermentación se ve fuertemente reducida cuando la concentración de etanol aumenta (Owen, 1991, 136). En las levaduras, los valores de ph comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaria. La velocidad de fermentación aumenta generalmente con la temperatura entre los 15 C y los 35 C y los niveles de glicerol, acetona, acetaldehído y piruvato se elevan en los medios de fermentación. La formación de niveles elevados de alcohol también depende de la temperatura (Owen, 1991, 136). En la producción de bebidas alcohólicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con aromas característicos y deseables, y por otro lado, se minimice la formación de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol, ésteres, compuestos carbonílicos, ácidos orgánicos, compuestos azufrados, aminas y fenoles. A medida que la riqueza alcohólica aumenta, la población de otras levaduras que se encuentran en el medio a fermentar decrece y va siendo sustituida como población dominante por la Saccharomyces cerevisiae. Este patrón de sucesión está fuertemente influenciado por las condiciones de fermentación como son la temperatura y el ph; por ejemplo, a una temperatura de 25 C y ph de 3.0 a 3.5, las cepas de Saccharomyces cerevisiae dominan la fermentación y las otras especies mueren. Como también la adición de SO 2 reduce la población de levaduras silvestres en el medio y de esta manera favorece la preponderancia de Saccharomyces cerevisiae, ya que esta especie es más resistente a este biocida (García, 1993, 295). 2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA La fermentación es un proceso determinante en la composición final del producto fermentado. Son muchos los factores que influyen en el desarrollo de una fermentación: Temperatura, ph y aireación. 2.2.1 Temperatura La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las levaduras. La temperatura más adecuada para su reproducción y la fermentación 9

oscila entre 22 C a 27 C y se reproduce con mayor rapidez cuando la temperatura es de 25 C. A temperaturas superiores a 30 C, las levaduras pierden capacidad para desdoblar los azúcares y al aproximarse a 40 C dejan de crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentación alcohólica nunca se debe superar temperaturas de 32 C durante el periodo fermentativo ya que se corren varios riesgos(madrid, Marzo de 1991): Inactivación de las levaduras responsables de la transformación de los azúcares en alcohol y CO 2. Pérdida de alcohol por evaporación con merma de grado alcohólico. Iniciación de fermentaciones indeseables. La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el grado alcohólico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas o superiores a los 30 C ó 35 C (Suárez, 1990, 211). Además las fermentaciones alcohólicas efectuadas a 25 C obtienen mejores resultados que las efectuadas a 30 C ya que: El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 C la levadura se desarrolla un 25.5% más que a 30 C; El consumo de sólidos solubles, sacarosa y grado alcohólico a 25 C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 GL respectivamente mientras que a 30 C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 GL(Merchan y Castillo, 1999, 120). El buen desarrollo de la fermentación esta en parte ligado a la necesidad de evitar que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La experiencia ha demostrado que son tanto más sensibles a la elevación de temperaturas cuanto más vieja sea la población, lo que constituye una causa de ralentización y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en el medio azúcares aun no transformados en alcohol. A partir de 30 C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 C. El hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentación y mayor grado alcohólico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilización de una fracción importante de compuestos aromáticos (Suárez, 1990, 211). 2.2.2 ph El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación no se ve afectado por la variación de ph entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de ph entre 3.05 hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un máximo de rendimiento de acuerdo a la formación de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998). En una fermentación alcohólica, el ph varía normalmente entre un mínimo de 2.8 y un máximo de 3.8, rango que depende básicamente de la composición del medio 10

a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el ph en valores menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenómeno de inhibición por ph, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado estado de ionización y este estado varía en función del ph el medio. Por lo tanto, la actividad enzimática es función del número de centros activos y estos, dependen del ph del medio. Por otra parte, este fenómeno puede interpretarse por el importante efecto que el ph del medio tiene sobre la estructura y la permeabilidad de la membrana celular (Revista Alimentación, equipos y tecnología, Junio de 1993). La marcha fermentativa depende además del ph del medio y los productos que resultan son mejores en cuanto a rendimiento a valores de ph bajos. También el conjunto de las floculaciones coloidales están reguladas por el ph del medio, así como algunas de sus características organolépticas tales como color y sabor. En la levadura Saccharomyces cerevisiae el crecimiento se da más rápido que en las bacterias a bajos valores de ph, ofreciendo la ventaja de operar una fermentación alcohólica evitando contaminación. Si se utiliza sacarosa como fuente de carbono el sistema es más sensible al ph que al utilizar glucosa, ya que la inversión de la sacarosa se acelera a ph bajos. El producto final de una fermentación alcohólica esta constituido esencialmente por una solución hidroalcohólica de ácidos orgánicos salificados en distintas proporciones, especialmente de potasio, magnesio y calcio. Esta solución contiene diferentes sustancias, que pueden permanecer en estado de solución verdadera, de solución coloidal o de simple suspensión. Las proporciones de estos constituyentes pueden ser sensiblemente variables entre ellos y esto en función de diversos factores tales como ph. El ph es una característica de primaria importancia, y esto por diferentes motivos. Ante todo organolépticamente el ph influye fuertemente sobre la sensación de acidez, dado que ésta depende más de la concentración hidrogeniónica (fuerza ácida) que de la cantidad de ácidos contenidos. Sobre la formación del fosfato férrico y consiguiente quiebra fosfática tiene fuerte influencia el ph, y se ha podido demostrar que el ph óptimo para el pleno desarrollo de éste fenómeno se sitúa sobre el valor de 3.3. A valores sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Se puede comprender como las desviaciones de ph pueden hacer aparecer riesgos que no se tenían, hecho que se produce, por ejemplo, a continuación del tratamiento de un vino con un desacidificante o también por la adición directa de un ácido (De Rosa, 1998, 239). 2.2.2.1 Ajuste del ph Adición de ácido tartárico o de ácido cítrico: Los dos únicos ácidos que se pueden usar tanto tecnológicamente como legalmente, son el ácido tartárico y el cítrico. 11

Desacidificación: Los desacidificantes utilizables técnicamente en las fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el tartrato neutro de potasio. 2.2.2.2 Buffers En los medios de cultivo es deseable mantener un ph constante (rango 3.0 3.5) durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de amortiguadores o buffers. También sucede que el ph en un medio de cultivo se ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidróxido de sodio si el ph es demasiado ácido; o un compuesto ácido, por ejemplo el ácido clorhídrico, si el ph es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios en el ph de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de cultivo un amortiguador de ph, actuando dentro de los límites máximos de ph; por lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de ph. Para límites próximos a la neutralidad (ph 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo. 2.2.3 Aireación La velocidad de fermentación al inicio del proceso fermentativo, depende estrechamente de las condiciones de aireación, desarrollándose dicha fermentación más rápidamente cuando las levaduras están mejor aireadas. Por lo tanto, es conveniente airear el medio hasta el máximo, máximo que coincidirá con él limite de solubilidad de un gas (oxígeno) en un liquido y que es muy bajo. Por mucho que se airee al principio, se tenderá a alcanzar muy pronto la saturación del mosto en oxígeno. La utilización del oxígeno por levaduras sólo tiene lugar al comienzo de la fermentación. Una vez arrancada ésta, no necesita oxigenación o de lo contrario se desviaría el proceso alcohólico, y comenzaría entonces la metabolización de los azúcares por vía respiratoria, produciendo mayor cantidad de células. La fermentación con agitación es ligeramente más rápida que la fermentación sin agitación. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azúcar obtenidos son similares en ambas condiciones de operación, observándose un ligero aumento en el grado alcohólico y el azúcar residual en la fermentación sin agitación (López, Marzo de 1995, 55). 2.3 BIORREACTORES Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto de la densidad de la población, como de la velocidad de crecimiento. Su aplicación incluye la preparación de bebidas alcohólicas, como una amplia gama en la industria biotecnológica. Se pueden adaptar para realizar cultivos 12

discontinuos o continuos. En cultivos discontinuos, el microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En cambio en el tipo continuo se emplean dos elementos en su control, la velocidad de flujo y la concentración de un nutriente limitante. 2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores En el ambiente dentro de un biorreactor se debe asignar la óptima actividad catalítica para las levaduras mediante parámetros como temperatura, ph, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, que tienen un significativo efecto en el desarrollo de la fermentación y las reacciones enzimáticas. Para proveer el ambiente deseado, las propiedades del sistema deben ser monitoreadas y se deben tomar acciones de control para rectificar cualquier desviación de los valores deseados. El monitoreo y control de las fermentaciones es un área activa de investigación destinada a mejorar la productividad de los bioprocesos y alcanzar una confiable y uniforme operación de fermentación. Varios niveles de procesos de control existen en la industria de la fermentación. El control manual es el más simple, requiere de operación humana para manipular dispositivos tales como bombas, motores y válvulas. La retroalimentación es usada para mantener parámetros a valores específicos. Con la creciente aplicación de los sistemas de computadoras en la industria de la fermentación, también se quiere apuntar a la implementación de controles avanzados y estrategias de optimización basado en modelos de fermentación. 2.3.2 Monitoreo de la fermentación Para entender el control del estado de una fermentación se debe conocer las variables críticas que afectan a un bioproceso. Estas variables pueden ser agrupadas en tres categorías: físicas, químicas y biológicas. Muchas de las medidas físicas están establecidas en la industria; otras están actualmente siendo desarrolladas o son foco de investigación para obtener nuevos instrumentos. Idealmente las medidas deben realizarse in situ y en línea. Actualmente el monitoreo en línea tiene aplicación en los siguientes grupos: Producción de biomasa. Producción de enzimas microbianas. Producción de metábolitos microbianos: etanol, ácido cítrico, acetona, butanol, polisacaridos, vitaminas. Procesos de transformación: glucosa a etanol, etanol a vinagre, producción de antibióticos. Las medidas que son realizadas en línea generalmente son: temperatura, presión, ph, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, consumo de energía, nivel de espuma. 13

Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores FISICOS QUIMICOS BIOLOGICOS TEMPERATURA, PRESION, NIVEL DE LIQUIDO, NIVEL DE ESPUMA, VELOCIDAD DE AGITACION, CONSUMO DE ENERGIA, VELOCIDAD DE FLUJO DE GAS, VELOCIDAD DE FLUJO DE MEDIO, VISCOSIDAD DEL CULTIVO PH, OXIGENO Y CO 2 DISUELTO, POTENCIAL REDOX, COMPOSICION DE GAS DE SALIDA, CONDUCTIVIDAD, COMPOSICION DEL MEDIO CONCENTRACION DE BIOMASA, CONCENTRACION DE ENZIMAS, COMPOSICION DE BIOMASA(ADN, ARN, PROTEINA, ATP/ADP/AMP/NAD), MORFOLOGIA. FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principies. 2.3.3 Retroalimentación Cuando se necesita mantener el valor de una variable constante durante el proceso, por ejemplo el ph a un valor dado, se tienen diferentes sistemas controladores. Uno de los controladores más simples es el de retroalimentación, el cual consta de un aparato de medición (potenciómetro) que envía el valor de la medición al controlador. En el controlador el valor medido es comparado con el valor establecido o fijo y se registra la diferencia. La desviación con respecto al valor real se llama error, el cual es usado por el controlador para determinar que acción debe seguir para corregir el proceso. El controlador produce una señal la cual es transmitida al ejecutar encendiéndolo o apagándolo; Para el caso del ph, si la medida baja del punto determinado, una bomba adiciona álcali a la fermentación hasta retornar el valor de ph requerido. Figura 2.6 Componentes del retroalimentador FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principles. 2.4 CULTIVOS CONTINUOS 14