RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B

RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B Art. n.: N0803 R-Biopharm AG, An der neuen Bergstraße 17, D-64297 Darmstadt, Germany Tel.: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: +49 (0) 61 51 81 02-20

1. Área de aplicación Para el diagnóstico in vitro. El test RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B es un ensayo inmunocromatográfico rápido para la identificación cualitativa de las toxinas A y B de Clostridium difficile en muestras de heces y en sobrenadantes de cultivos. 2. Resumen y explicación del test Las enfermedades diarreicas son efectos adversos relativamente frecuentes en las antibioticoterapias. Especialmente después de la introducción de la clindamicina a principios de la década del 70 aparecieron cada vez con mayor frecuencia formas más graves de la enfermedad que se desarrollaron hasta llegar al cuadro de afección masiva que produce la colitis seudomembranosa (PMC). Esta diarrea asociada a antibióticos (DAA) es causada esencialmente por Clostridium difficile y en consecuencia, denominada también como diarrea asociada a Clostridium difficile (DACD). Se trata de una de las más frecuentes infecciones nosocomiales en los países industrializados. La tasa de portadores entre los pacientes hospitalizados ha ascendido entretanto a 16-35%. Entretanto se conocen cepas de creciente virulencia basadas en sus mecanismos de patogenicidad especiales, mediante los cuales han convertido la infección por Clostridium difficile (CDI) en un elevado factor de coste para el sistema de salud publica. En el cuadro de manifestaciones de la enfermedad se destaca por su importancia la producción de las toxinas A y B por cepas toxígenas de Clostridium difficile. Estas dos proteínas de la toxina poseen un alto peso molecular, cada una alrededor de 300 kda y son diferenciables inmunológica y funcionalmente. En el caso de la toxina A se trata de una enterotoxina, y la toxina B es una citotoxina. Ambas toxinas actúan independientes, pero también en forma sinérgica. Debido a que no todas las cepas de Clostridium difficile son generadoras de toxinas y que aprox. del 2-8% de la población adulta sana y hasta el 80% de los niños menores de 2 años pueden estar colonizados por Clostridium difficile, reviste importancia decisiva en relación con la manifestación de una DACD, en primer lugar, la identificación de las toxinas A y B en la muestra de heces a fin de determinar el diagnóstico y la terapia a seguir. El RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B es un test rápido en el cual se emplean anticuerpos monoclonales y policlonales para la identificación específica y simultánea de las toxinas A y B en las muestras de heces de pacientes. A los 15 minutos se obtiene ya un resultado fiable del análisis, de manera que se posibilita de forma temprana la toma de medidas terapéuticas efectivas. 3. Fundamento del test El presente test rápido es un ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral de un solo paso, en el cual se emplean tanto anticuerpos antitoxina A y antitoxina B biotinilados, así como también marcados con oro. Tan pronto como en una muestra positiva se encuentren las toxinas A y/o B RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 2

de Clostridium difficile, se forman inmunocomplejos con los anticuerpos de las antitoxinas A y antitoxinas B marcadas, los cuales se desplazan a través de la membrana. La estreptavidina presente en la línea de análisis T se une con los inmunocomplejos que fluyen hacia ella a través de la biotina acoplada a los anticuerpos de las antitoxinas A y antitoxinas B y produce una coloración rojo-violeta de la línea T. Los anticuerpos marcados con oro no acomplejados se enlazan a la línea de control C. Por consiguiente, en caso de muestras negativas no se lleva a cabo la unión de los inmunocomplejos marcados con oro a la línea T, sino solamente a la línea C. La línea C roja siempre indica que el desarrollo del ensayo ha sido válido. 4. Contenido del envase Los reactivos de un envase alcanzan para 25 determinaciones Cassette 25 det. 25 Casetes envasados individualmente Reagent A 13,5 ml Anticuerpos específicos contra antitoxina A y antitoxina B; contiene azida al 0,05 %; listo para el uso; teñido de azul Reagent B 13,5 ml Anticuerpos específicos contra antitoxina A y antitoxina B; contiene azida al 0,05 %; listo para el uso; teñido de amarillo Pipet 25 piezas Bolsa con 25 pipetas desechables Reagent vial 25 piezas Bolsa con 25 microtubos Pipet Tip 25 piezas Bolsa con 25 puntas de pipetas Microlit Pipet 1 pieza Micropipeta de 150 µl 5. Reactivos y su almacenamiento El envase se puede conservar entre 2 25 C y se puede usar hasta la fecha de vencimiento impresa en la etiqueta. Después de la fecha de vencimiento no se asumen garantías de calidad. Del mismo modo tampoco se puede garantizar la capacidad de uso de casetes cuyo envase haya sido dañado. 6. Reactivos adicionales necesarios accesorios requeridos - Agitador Vortex (opcional) - Recipiente de desechos con una solución de hipoclorito de sodio al 0,5% RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 3

7. Medidas de seguridad Sólo para el diagnóstico in vitro. Este test debe ser realizado solamente por personal calificado de laboratorio. Se deben observar las líneas directivas de trabajo para laboratorios médicos. Las instrucciones para el uso del test deben cumplirse estrictamente. Los reactivos contienen azida de sodio como agente conservante. Se debe evitar, por tanto, el contacto con la piel o mucosas. No pipetear las muestras o los reactivos con la boca. Evitar el contacto con la piel lesionada o las mucosas. Durante el trabajo con las muestras deben usarse guantes desechables y lavar las manos después del test. En los locales donde se trabaje con las muestras no está permitido fumar, comer o beber. Es necesario que todos los materiales y reactivos que entren en contacto con muestras potencialmente infecciosas se sometan a un tratamiento con agentes desinfectantes adecuados (por ej. hipoclorito de sodio) o se esterilicen en autoclave por lo menos durante una hora a 121 C. 8. Recolección y conservación de las muestras Las muestras de heces se deben colectar en recipientes limpios sin ningún tipo de aditivo y conservar entre 2 8 C antes del comienzo del test. Si se guarda por más de 3 días, la muestra se debe congelar a -20 C. En este caso la muestra se descongela completamente antes del inicio del test y se lleva a temperatura ambiente. Evite congelar y descongelar las muestras varias veces. Si se van a utilizar frotis rectales se debe prestar atención a que haya suficiente material de heces (aprox. 50 mg) para la realización del test. 9. Realización del test 9.1. Generalidades Las muestras, los reactivos y los casetes de prueba deben adaptarse a la temperatura ambiente (20 25 C) antes de proceder a utilizarlos. Los casetes del ensayo sólo deben extraerse del envase exterior poco antes de su uso. Los casetes que se hayan usado una vez no se deben volver a utilizar. Se debe evitar la incidencia directa de la luz solar durante la realización del test. Las cantidades sobrantes de reactivo no se deben retornar a los frascos, ya que esto puede provocar una contaminación. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 4

9.2. Preparación de las muestras de ensayo En un microtubo Reagent vial etiquetado se pipetean 0,5 ml (aprox.12-14 gotas) del reactivo A Reagent A e igual cantidad del reactivo B Reagent B. Es importante prestar atención a la graduación de 0,5 ml y 1,0 ml en el microtubo, independientemente de la cantidad de gotas de los reactivos A y B. Los reactivos A y B tienen que estar en una relación de 1:1. 9.2.1 Uso de muestras de heces En el caso de una muestra líquida de heces se aspiran con una pipeta desechable Pipet 50 μl (tomando hasta el segundo espesamiento) y se hace una suspensión con la mezcla de reactivos preparada antes. En caso de muestras sólidas de heces se suspenden de forma similar aprox. 50 mg en la mezcla. A continuación se cierra bien el microtubo y se homogeneiza la muestra por medio de un mezclado a fondo (opcionalmente con Vortex). Después se deja sedimentar la suspensión homogénea 5 minutos para que se forme un sobrenadante que esté en gran medida libre de partículas. Para la sedimentación se puede colocar el microtubo en una de las tres aberturas centrales del soporte de reactivos. 9.2.2. Uso de cultivos líquidos y sólidos de Clostridium difficile Se pipetean 50 µl de un caldo de cultivo (por ej. caldo de tioglicolato) y se transfieren al microtubo que contiene 1,0 ml de la mezcla de reacción preparada antes con el reactivo A (0,5 ml) y el reactivo B (0,5 ml) y se procede a mezclar todo el contenido. De esta mezcla se toman 150 µl para el análisis de las muestras (Punto 9.3.). En caso de utilizar caldos de cultivo sólidos se extraen la mayor cantidad de colonias del medio de cultivo de la placa y se suspenden completamente en 1,0 ml de agua destilada o en solución salina (NaCl al 0,9%). Seguidamente se pipetean 50 µl de esta suspensión y se transfieren al microtubo que contiene 1,0 ml de la mezcla de reacción preparada antes con el reactivo A (0,5 ml) y el reactivo B (0,5 ml) y se procede a mezclar todo el contenido. De esta mezcla se toman 150 µl para el análisis de las muestras (Punto 9.3.). 9.3. Análisis de las muestras Se retira la envoltura exterior del casete para el test Cassette, y se coloca éste sobre una superficie plana. Posteriormente se inserta una punta de pipeta nueva Pipet Tip en la micropipeta Microlit Pipet, se extraen 150 µl del sobrenadante de cada microtubo y se pipetean en el campo de reacción del casete. Se debe prestar atención a que el líquido fluya sin impedimento a través de la membrana. Si el test se ha llevado a cabo correctamente aparecerá a los 3 minutos aprox. la banda de control en la línea de control C. En caso que al transcurrir los 3 minutos la línea de control no aparezca, es necesario procesar una muestra nueva para RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 5

obtener una mayor cantidad de sedimento (opcionalmente mediante una centrifugación a 2000 g durante 2 minutos) y aplicar igualmente en el campo de reacción de un casete nuevo. El resultado del test siempre se obtiene mediante la lectura a los 15 minutos. La coloración de las bandas y su intensidad puede modificarse durante el tiempo total de procesamiento y tras el secado de la tira, desde el rojo-violeta al azul hasta gris-violeta. 10. Control de calidad Indicios de reactivos caducados El test sólo debe evaluarse si el casete de ensayo está intacto antes de pipetear la suspensión de la muestra y no se ven en él cambios de coloración o bandas. Además es imprescindible que después de un tiempo de incubación de 15 minutos al menos esté visible la banda de control rojo violeta. Si ésta no aparece, se deben hacer las siguientes comprobaciones antes de repetir el test: - Durabilidad de los casetes de ensayo y de los reactivos utilizados - Ejecución correcta del test - Contaminación de los reactivos Dado el caso que al repetir el test con un nuevo casete tampoco sea visible la banda de control, usted debe dirigirse al fabricante o a su distribuidor local de R-Biopharm. 11. Evaluación e interpretación Como máximo, solamente deben aparecer dos bandas, vistas desde el punto de aplicación de la muestra y en el siguiente orden: Una banda rojo violeta producto de la reacción en la línea de análisis T y una banda de control de color también rojo violeta en la línea de control C. Si no aparece la banda de control el test no es evaluable y por tanto inválido! Las siguientes interpretaciones son posibles: - Toxina de Clostridium difficile positiva: Ambas bandas son visibles. - Toxina de Clostridium difficile negativa: Sólo aparece la banda de control. - Inválido: No aparecen bandas o existe otra situación diferente a la descrita más arriba. De igual modo, si aparecen otras coloraciones de las bandas después de 15 minutos, éstas deben evaluarse como carentes de valor diagnóstico. 12. Limitaciones del método El RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B detecta las toxinas A y/o B de Clostridium difficile en muestras de heces o en cultivos de C. difficile tras su enriquecimiento. No es posible establecer una relación entre la intensidad de la banda específica visible y la manifestación o gravedad de síntomas clínicos. Los resultados obtenidos siempre deben interpretarse de conjunto con el cuadro clínico. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 6

Un resultado positivo no excluye la presencia de otros agentes infecciosos u otras causas. Un resultado negativo no excluye una posible infección con Clostridium difficile. La causa de ello puede ser una excreción intermitente de la toxina o una cantidad demasiado baja de toxina en la muestra. Si existe la sospecha anamnésica fundada de una infección con el agente patógeno analizado se debe repetir el análisis con otra muestra de heces del paciente. Un exceso de muestra de heces puede provocar una coloración parduzca de la tira de análisis que puede enmascarar el color rojo violeta de la banda específica del ensayo. En tales casos es preciso realizar un nuevo análisis con una cantidad de heces menor o con una suspensión de heces más transparente obtenida por centrifugación a fin de esclarecer si las toxinas de Clostridium difficile que se desean detectar están realmente presentes en la muestra y fueron enmascarados por usar demasiada matriz de heces. 13. Características de rendimiento 13.1 Sensibilidad y especificidad clínicas Basado en un estudio de validación usando 181 muestras de heces congeladas y previamente analizadas por PCR (116 negativas y 65 positivas) se realizó una comparación entre el test rápido RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B y 5 kits de ELISA comerciales. Para este propósito se descongelaron las muestras de heces, se homogeneizaron y se procesaron según las instrucciones del fabricante en cada uno de los 5 tests. A partir de los resultados obtenidos se determinaron la sensibilidad y la especificidad relativas para cada uno de los kits de ensayo. Los datos se resumen en la siguiente Tabla 1. Tabla 1. Sensibilidad y especificidad del RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B en comparación con 5 kits ELISA comerciales para la identificación de las toxinas A y B de Clostridium difficile en muestras de heces. [ % ] RIDA Quick ELISA 1 ELISA 2 ELISA 3 ELISA 4 ELISA 5 Sensibilidad 100 97 100 93 87 83 Especificidad 91 99 89 96 91 97 13.2 Sensibilidad analítica Para la determinación de la sensibilidad analítica del test rápido RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B se adicionaron y se diluyeron en serie las toxinas A y B puras y en RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 7

concentraciones definidas, respectivamente, a una muestra de heces negativa. Se comprobaron los distintos grados de dilución tanto en el RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B como también en otros dos ensayos inmunocromatográficos comerciales rápidos en cuanto a su reactividad. Los resultados se resumen en la Tabla 2. Tabla 2: Sensibilidad analítica del RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B en comparación con otros dos kits ELISA comerciales de ensayo rápido para la identificación de las toxinas A y B de Clostridium difficile en muestras de heces. Concentración de toxina Toxinas A y B ng/ml RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B Inmunoensayo rápido 1 Inmunoensayo rápido 2 A B A B A B 0 - - - - - - 1 - - - - - - 2 - (+) - - (+) - 4 (+) + - + + - 8 + ++ - + + (+) 16 ++ +++ (+) + ++ + La sensibilidad analítica del test RIDA QUICK Clostridium difficile se determinó con 4,2 ng/ml para la Toxina A y 2,1 ng/ml para la Toxina B utilizando toxinas purificadas. 13.3 Precisión Para la determinación de la precisión del test RIDA QUICK Clostridium difficile se investigaron la reproducibilidad intraensayo, la reproducibilidad interdía (para 10 días), la reproducibilidad interoperador (para 3 operadores) y la reproducibilidad interlote (para 3 lotes). Para cada análisis se examinaron 5 referencias por duplicado: una negativa, una moderada-positiva con Toxina A y una con Toxina B, una débil-positiva con Toxina A y una con Toxina B. El test RIDA QUICK Clostridium difficile mostró el resultado esperado en el 100% de las mediciones. 13.4 Reactividad cruzada Diferentes gérmenes patógenos del tracto intestinal fueron analizados con el test RIDA QUICK Clostridium difficile y no presentaron reactividad cruzada. Los análisis se realizaron con suspensiones de bacterias (10 7 hasta 10 9 UFC/ml), con cultivos de parásitos (10 7 hasta 10 9 microorganismos/ml) y con sobrenadantes de cultivos celulares de células infectadas con virus. Los resultados se resumen en la tabla 2. RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 8

Germen de prueba Origen Denominación/ fuente Resultado Adenovirus sobrenadante de cultivo celular Micromun GmbH negativo Aeromonas hydrophila cultivo DSM 30014 negativo Astrovirus sobrenadante de cultivo celular Micromun GmbH negativo Bacillus cereus cultivo DSM 22650 negativo Candida albicans cultivo DSM 11948 negativo Citrobacter freundii cultivo DSM 30039 negativo Cryptosporidium muris cultivo Waterborne Inc. negativo Cryptosporidium parvum cultivo Waterborne Inc. negativo E. coli EPEC cultivo DSM 8695 negativo E. coli ETEC cultivo DSM 10973 negativo E. coli STEC cultivo DSM 8579 negativo Enterobacter cloacae cultivo DSM 30054 negativo Enterococcus faecalis cultivo DSM 2570 negativo Giardia lamblia cultivo Waterborne Inc. negativo Klebsiella oxytoca cultivo DSM 6673 negativo Proteus vulgaris cultivo DSM 13625 negativo Pseudomonas aeruginosa cultivo DSM 288 negativo Rotavirus sobrenadante de cultivo celular Micromun GmbH negativo Serratia liquefaciens cultivo DSM 30068 negativo Shigella flexneri cultivo DSM 4782 negativo Staphylococcus aureus cultivo DSM 20372 negativo Staphylococcus epidermidis cultivo DSM 1798 negativo Vibrio parahaemolyticus cultivo DSM 2172 negativo Yersinia enterocolitica cultivo DSM 11502 negativo 14. Interferencia de otras sustancias Las sustancias que se relacionan a continuación no mostraron efecto sobre los resultados del análisis cuando se adicionaron a las muestras de heces positivas y negativas de toxina A/B Clostridium difficile en las concentraciones indicadas: Sulfato de bario (5% p/p), Loperamida (antidiarreico; 5% p/p), Pepto-Bismol (antidiarreico; 5% v/p), mucina (5% p/p), ciclamato (edulcorante sintético 5% v/p), sangre humana (5% v/p), ácido esteárico / ácido palmítico (mezcla 1:1, 40% p/p), Metronidazol 0,5 (antibiótico 5% v/p), Diclofenaco (0.00263% v/p). RIDA QUICK Clostridium difficile Toxin A/B 10-04-20 9

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