BIOTECNOLOGÍA Y RECURSOS DE ZONAS ÁRIDAS

BIOTECNOLOGÍA Y RECURSOS DE ZONAS ÁRIDAS Liberato Portillo, Ana Lilia Vigueras, Rafael Soltero y Carlos Ramírez Serrano Departamento de Botánica y Zoología, portillo@cencar.udg.mx INTRODUCCIÓN La Biotecnología, es una actividad multidisciplinar que mediante el conocimiento técnico y científico (sensu lato), vía el uso de cualquier organismo (completo o sus partes), genera bienes o servicios. En este sentido los recursos bióticos de las zonas áridas presentan una excelente oportunidad para utilizarlos a través de procesos biotecnológicos y desarrollar alternativas de aprovechamiento sostenible, ya que en México más de la mitad del territorio está considerado árido o semiárido. El Cuerpo Académico No. 22, Biotecnología en Zonas Áridas de la Universidad de Guadalajara (UDG-CA-22) está comprometido para apoyar el desarrollo de las zonas áridas, que es una área de creciente interés, mediante actividades docentes, de investigación y extensión, vía gestión con entidades gubernamentales y no gubernamentales como son empresas, asociaciones civiles, entre otras. Ya que trabajar en procesos biotecnológicos involucra el manejo de organismo (sus células, tejidos, partes, o sistemas), es oportuno mencionar que se tienen que atender bases éticas y de bioseguridad, las cuales al seguir con respeto el entorno natural, se cubren íntegramente. Lo anterior se explica porque toda actividad que se realiza dentro de esta disciplina, no es más que el reflejo de procesos que ocurren en la naturaleza. Sin embargo, es imperativo mencionar que el apego a la lógica debe ser directriz en cada proceso biotecnológico, como lo debe ser en cualquier actividad que realiza el hombre, lo cual da fundamento a la sustentabilidad. El presente escrito tiene como objetivo mostrar diversos conceptos relacionados con procesos biotecnológicos de varias especies, la mayoría de ellas con distribución pantropical, muy típicas de las zonas áridas y semiáridas de la República Mexicana. MATERIALES Y MÉTODOS La metodología se presenta en cuatro secciones, la primera abarca el uso de extractos botánicos para el control de dos plagas del nopal; la segunda aborda la micropropagación

del agave tequilero mediante el uso de un biorreactor desarrollado en el CUCBA; la tercera sección también trata sobre micropropagación, pero de diversas especies de cactáceas; finalmente la cuarta cubre el concepto de propiedad intelectual de los recursos de las zonas áridas. I. Formulación de aceites y extractos alcohólico acuosos para el control de Cactoblastis cactorum Berg., 1885 y Dactylopius opuntiae Cockerell, 1896 Para el control de huevos y larvas de Cactoblastis cactorum se formularon dos extractos botánicos y aceites esencial (orégano y albahaca) por separado. En un vaso de precipitado con capacidad de 500 ml, se adicionaron 2.5, 3.0, 5 y 10 ml de tres emulsificantes (estas proporciones variaron de acuerdo a cada experimento) y después se sometió a calentamiento en baño María a una temperatura de 70 C, para luego adicionar el aceite o extracto alcoholico acuoso, después se retiró y todo se mezcló con un batidor, una vez que se obtuvo una mezcla homogénea, se guardaron en frascos plásticos de color ámbar, fueron rotulados y almacenados a temperatura ambiente (Cuadro 1 y 2). Extractos alcohólico-acuosos para controlar la cochinilla silvestre. Fueron formulados 100 ml de cada extracto alcohólico acuoso, para lo cual se utilizó 1% de cada extracto, con 90 ml de agua desionizada y 5% de emulsificante (Cuadro 3). Primero se calentó en baño María el emulsificante y después se agregó el agua desionizada y el extracto, se incorporó todo con ayuda de un batidor. Cada producto fue rotulado, etiquetado y guardado hasta su posterior uso. Testigo. Para comparar la eficiencia de los bioinsecticidas se emplearon como testigos dos productos químicos de marcas comerciales existentes en el mercado: NIMOIL-AZ 0.20 EC y Agrobion. Se obtuvo de cada extracto botánico debidamente formulado la cantidad de 100 ml (Cuadros 1, 2 y 3), después se determinaron las dosis para cada uno de los insectos a tratar. Cuadro 1. Formulación de aceites y extractos botánicos para evaluar la actividad insecticida en huevos y larvas de Cactoblastis cactorum Berger, en Santiago del Estero, Argentina. Tratamiento Extracto/Emulsificante (ml)

1 Albahaca/Panodan 90:10 2 Orégano/agua/Tween 20 2:95:3 3 Santa María/Tween 20 95:5 4 Albahaca/Tween 20 95:5 5 Santa María/SLS 90:10 6 Cempasúchil/SLS 97.5:2.5 7 Cempasúchil/Tween 20 90:10 Cuadro 2. Formulación de extractos botánicos para evaluar la actividad insecticida en huevos y larvas de Cactoblastis cactorum Berger en Santiago del Estero, Argentina. Tratamiento Extracto/Emulsificante (ml) 1 Santa María/Tween 20 95:5 2 Santa María/SLS 95:10 3 Cempasúchil/SLS 97.5: 2.5 4 Cempasúchil/Tween 20 90:10 5 Albahaca/Tween 20 95:10 6 Menta/Tween 20 97.5:2.5 7 Menta/SLS 97.5:2.5 8 Epazote/SLS 97.5:2.5 9 Epazote/Panodan 97.5:2.5 10 Hierbabuena/Tween 20 97.5:2.5 Cuadro 3. Formulación de extractos botánicos para evaluar la actividad insecticida en ninfas y hembras adultas de Dactylopius opuntiae (Cockerell) en Ojuelos, Jalisco. Tratamiento Extracto/ Emulsificante (ml) 1 Cempasúchil (flores)/tween 20 90:10 2 Cempasúchil (flores)/sls 97.5:2.5 3 Cempasúchil/SLS 97.5:2.5 4 Cempasúchil (flores)/tween 20 97.5:2.5

5 Ruda/Tween 20 90:10 6 Santa María/Tween 20 95:5 7 Santa María/SLS 95:10 8 Santa María/SLS 95:10 9 Albahaca/Tween 20 90:10 10 Epazote/Tween 20 97.5:2.5 11 Santa María/Tween 20 95:5 12 Albahaca/Tween 20 90:10 13 Santa María/Tween 20 95: 5 II. Micropropagación de Agave tequilana Weber en biorreactor Se estableció la regeneración por embriogénesis somática de A. tequilana en biorreactor Orbitabión (Figuras 1a y b), el cual es un sistema de inmersión temporal desarrollado tanto para la investigación como para la producción comercial (Vigueras et al., 2013). Los procesos de inducción y expresión fueron de acuerdo a Portillo et al. (2007), para ello se realizaron varios experimentos para probar su factibilidad de uso (Portillo y Santacruz, 2006). Se evaluaron tres experimentos con cinco réplicas cada uno, se utilizó 1 g de callo por réplica con 25 ml de medio de expresión por recipiente, el cual estuvo compuesto de las mismas sales y vitaminas ya descritas, pero sin reguladores de crecimiento. El primer experimento consistió en comparar la producción de embrioides en medio sólido frente a Orbitabión con inmersión continua. En el segundo experimento se evaluó la inmersión por 1 min cada 24 h que se comparó con los resultados del tratamiento de inmersión continua del primer experimento. El tercer experimento consistió en comparar de nuevo el medio sólido contra Orbitabión con inmersión de 1 min pero ahora cada 48 h. Las inmersiones se lograron al colocar los biorreactores en agitadores orbitales a 100 rpm. La variable de respuesta de los tres experimentos fue el número de embrioides obtenidos, la cual se analizó estadísticamente mediante pruebas de Student.

III. Micropropagación de cactáceas Se utilizaron como explantes, ápices de brote de los cactos en medio de cultivo basal MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con 30 g/l de sacarosa, 8 g/l de agar y la mezcla de vitaminas L2 (Phillips y Collins, 1979), la cual consiste en Inositol 250 mg/l, Tiamina 2 mg/l y Piridoxina 0.5 mg/l. Las dosis de reguladores de crecimiento utilizadas se muestran en el cuadro 4, así como la referencia donde los experimentos fueron publicados. IV. Propiedad intelectual y recursos genéticos de las zonas áridas Se revisó la situación actual que guarda la Propiedad Industrial (PI) en México, así como las Indicaciones Geográficas y Denominaciones de Origen de algunos recursos genéticos (RG) de interés para la zonas áridas, en particular el caso del A. tequilana (DOT). Asimismo se analizaron los ámbitos de impacto de la PI y se consideraron las figuras de propiedad industrial relacionadas con la protección de RG. Finalmente se evaluaron las perspectivas de aplicación de la PI en el país. RESULTADOS I. Formulación de aceites y extractos alcohólico acuosos para el control de C. cactorum y D. opuntiae (Cockerell) Los aceites y extractos fueron evaluados, con resultados favorables, ya que se detectó mortalidad del 100 % en huevos de C. cactorum con aceite de orégano formulado con SLS y con Tween 20 ; la formulación con aceite de albahaca-panodan exhibió un 75.9 % de mortalidad con respecto al insectida NIMOIL-AZ 0.20 EC con el que se registró sólo el 70.8 %, lo que indica mejor eficiencia de los formulados porque se emplea menor dosis. La mortalidad obtenida en el tratamiento control (sólo agua desionizada) fue de 0 %. La mayor mortalidad de larvas fue de 100 % en los tratamientos con aceite de albahaca formulado con PANODAN, SLS, Tween 20 y orégano con Tween 20, con dosis de 0.01 ml/100 ml en un lapso de 24 h, las larvas no presentaron movilidad, se dejaron hasta completar 72 h para observar cualquier indicio de sobrevivencia. El insecticida de referencia NIMOIL-AZ 0.20 EC presentó mortalidad del 37.5 % en concentración del 1 ml/100 ml, asimismo el control arrojó una mortalidad del 0 %; la formulación del aceite

de orégano y CITRIM presentó un 75 % de mortalidad, lo que representa viabilidad en su empleo, sin embargo es posible que con una segunda aplicación se obtengan buenos resultados. La mortalidad registrada en la población de D. opuntiae fue favorable, a los 7 d de aplicados los extractos con santa María más Tween 20, cempasúchil SLS y Tween 20, al igual que el epazote con emulsificante PANODAN, registraron mortalidad superior al 50%, esto resulta satisfactorio puesto que en la primer evaluación la mitad de la población disminuyó con una sola aplicación; además se observó desecación del cuerpo y eliminación de una parte de la cubierta cerosa del cuerpo. Asimismo, se encontró que muchos insectos, principalmente hembras adultas se encontraron expuestas a los rayos solares, ya sin la cera que las protege, facilitó aún más la deshidratación y por consiguiente la muerte (Figura 3). El insecticida Agrobion registró una mortalidad del 100 %. II. Micropropagación de A. tequilana en biorreactor El sistema de inmersión temporal Orbitabión, permitió el desarrollo de células somáticas embriogénicas, mismas que completaron las etapas embrionarias hasta la germinación (Figura 1c), lo cual demostró la factibilidad de este proceso morfogénico de A. tequilana en biorreactor. De entre los resultados sobresalientes se tuvo que la germinación de los embrioides inició a los 30 d en medio sólido y a los 60 d en Orbitabión, pero a los 90 d, de acuerdo con la prueba de Student, no se encontraron diferencias significativas (P = 0.9783) entre ambos sistemas. Se supone que este retraso es influenciado por la excesiva humedad dentro de los biorreactores, por lo que la disminución de la frecuencia de inmersión a 1 min cada 24 h, confirmó que el número de embrioides con hiperhidricidad (Figura 1d) fue de 65%, que es menor al observado en inmersión continua; sin embargo, este número disminuyó con respecto al tratamiento de inmersión continua, cuya diferencia de promedios fue de 31.4 embrioides, lo que no se atribuye a la modificación en la frecuencia de inmersión del sistema, pero es posiblemente se deba a la variación somaclonal del genotipo utilizado.

b a c d Figura 1. Embriogénesis somática de Agave tequilana Weber cultivar azul en el sistema de inmersión temporal Orbitabión. a) vista lateral del biorreactor donde se observan los espacios para el medio del cultivo líquido (flecha) y el cultivo de los explantes, b) extracción del soporte de cultivo mediante el tornillo central donde se observa también la malla que separa el medio de cultivo y los explantes en desarrollo, c) desarrollo de embriones somáticos de la etapa escutelar hasta torpedo y germinación (inserto), d) embriones somáticos hiperhídricos. Barras = 1 cm. III. Micropropagación de cactáceas En el laboratorio de biotecnología se han obtenido buenos resultados empleando los métodos de micropropagación antes mencionados (Figura 2). En términos generales, los trabajos de micropropagacion de cactáceas se han desarrollados con la finalidad de propagar especies amenazadas, en peligro de extinción o con interés ornamental. Se utiliza como método privilegiado la proliferación de brotes axilares y en algunos casos la organogénesis o embriogénesis somática, pero en estos

últimos, no se ha logrado determinar con exactitud cuáles son los factores que intervienen en la morfogénesis, tanto de órganos como de embriones somáticos. Cuadro 4. Resultados de la micropropagación de cactáceas en el Laboratorio de Biotecnología del CUCBA, UdeG. Especie Dosis de Brotes por Resultados del Adaptación ex Referencia Epithelantha micromeris var. micromeris Turbinicarpus schmiedickeanus var.klinkerianus Pelecyphora strobiliformis Opuntia ficusindica reguladores de crecimiento (mg/l) explante (promedio) enraizamiento 17.25 de KIN 17.25 El testigo 4 de 2iP y 0.2 de ANA 14.75 presentó el mayor número de raíces 2 y 3 de 2iP 4.50 El testigo presento el mayor número de raíce 6 de KIN 5.00 6.5 raíces por explante con 0.5 vitro 84% Velásquez y Adaptación exitosa En la mezcla inorgánica: 94% 6 de 2iP 2.75 mg/l de ANA En la mezcla Experimento 1: 5.0 de KIN Experimento 2: 0.5 de KIN Experimento 3: 1.0 de 2iP y 1.0 de KIN Experimento 4: 0.5 de KIN Experimento 5: 0.4 de BA Experimento 6: 2.2 de BA Experimento 7: 0.3 de BA 1.60 6.8 raíces en 5.20 1.30 y 3.10 6.00 24.50 53.70 9.70 medio sin reguladores de crecimiento parcialmente orgánica: 69% Soltero, 1997. Arias et al., 2001. Arias, 2002. 98% Zuñiga, 2012.

Al-Ramamneh et al. (2006) explica claramente y de forma convincente el proceso de embriogénesis somática en cactáceas,, esto es importante ya que se puede utilizar como modelo para otras especies, y asi poder aplicar diversos procesos biotecnológicos de mejoramiento genético como selección celular, mutación, hibridación somática y transformación genética entre otras. a b c Figura 2. Micropropagación de cactáceas en el Laboratorio de Biotecnología. a) Incubador (cámara de crecimiento), b) Brotes axilares de Turbinicarpus schmiedickeanus, c) Brote enraizado de Mammillaria bocasana, d) Plantas de Epithelantha micromeris adaptadas a condiciones ex vitro. IV. d a Propiedad intelectual y recursos genéticos de las zonas áridas Actualmente la Propiedad Industrial (PI) es una herramienta sub-utilizada en México debido al desconocimiento de su uso y aplicación. Es particularmente notable el rango de protección que tienen los recursos genéticos, intrínsecos a la cultura del país, los cuales en

otras latitudes tienen mejor aprovechamiento. La PI así como los recursos genéticos son indispensables para el desarrollo sustentable y generación de satisfactores con alto valor agregado. Por ello, las Indicaciones Geográficas, así como las Denominaciones de Origen, en México, son ejemplo de éxito que reúne recursos genéticos y PI, que puede ser perfectible para mantener la sustentabilidad, equilibrio ecológico y bienestar social. Un ejemplo de ello es la Denominación de Origen Tequila (DOT), que representa la aplicación y beneficios de la PI, que en conjunto con marcas y secretos industriales, a los cuales se debe agregar las innovaciones. Cabe remarcar la importancia de la creatividad para generar innovaciones. Entre más objetivas (o realistas) sean las percepciones, mejores innovaciones se desarrollarán para satisfacer las necesidades o demandas de un mayor número de consumidores (Naranjo- González, 2004), y de esta forma las pequeñas y medianas empresas de base tecnológica son competitivas (IMPI, 2011). Por esta vía se agrega valor, de tal forma que los recursos humanos, materiales y financieros se optimizan, para ofrecer productos a un menor costo y también inducir nuevas necesidades en la sociedad. Al agregar valor a una organización, se ahorra tiempo y esfuerzo a todos sus integrantes. Por otra parte, las figuras de PI útiles para proteger recursos genéticos (Cuadro 5), como parte del Derecho, considera como Invenciones de acuerdo a la Ley de la PI (DOF, 2010): toda creación humana que parte de una idea, que permite en la práctica transformar los materiales y la energía para dar una solución a un problema determinado o de provecho para el hombre. Cuadro5. Figuras jurídicas y periodos de protección industrial (LPI, 2012). Nombre/Tiempo Protege (sin prórrogas) Requisitos Invenciones Patente/20 años Proceso, producto, uso y máquina Novedad, invento y uso industrial Modelo de utilidad/10 años Modificación de utensilios Novedad y uso industrial Diseños industriales Dibujos y modelos industriales Novedad y uso industrial 15 años Secreto industrial permanente Información Industrial y Comercial Confidencialidad en medio físico Variedad vegetal* Variedades comerciales Nueva, estable y homogénea 15-18 años Marcas/10 años Nombres, figuras tridimensionales Nombre corto, cordial, legal y más Marca colectiva Nombres, figuras Igual a la anterior Denominación de origen Nombre para un producto original Calidad por el ambiente y cultura *Ley de Variedades Vegetales (DOF, 2012).

CONCLUSIONES México tiene una contradicción ancestral, por un lado una enorme diversidad biológica aprovechada en el mundo entero y por el otro, con bajo impacto económico en el país. Los recursos bióticos de las zonas áridas ofrecen una excelente oportunidad para desarrollar procesos biotecnológicos sustentables. El presente escrito es una modesta contribución en este sentido, pero que puede ser tomado como modelo, al integrar los diversos conceptos aquí expuestos. AGRADECIMIENTOS Parte de las investigaciones que permitieron escribir este documento fueron apoyadas directa e indirectamente mediante la Universidad de Guadalajara y el CONACyT. La documentación de las mismas fue facilitada por el PIFI a través del libro Biotecnología de Zonas Áridas (ISBN 978 6075 07285-2) y del Boletín Nakari (ISSN 1405-1613) de la Sociedad Jalisciense de Cactología, ambos disponibles bajo solicitud a los autores. LITERATURA CITADA Al-Ramamneh, E., Sriskandarajah S. y Serek M. 2006. Plnat regeneration vio somatic embryogenesis in Schlumbergera truncata. Plant cell, Tissue and Organ Culture 84: 333-342. Arias A., A. 2002. Micropropagación de Pelecyphora strobiliformis (werdermann) Fric et Scheelle (cactacea) especie mexicana en peligro de extincion. Tesis de Licenciatura. Universidad de Guadalajara. Guadalajara, México. 72 p. Arias A., Santa Cruz R. M.E. y Soltero Q. R. 2001. Micropropagación de Turbinicarpus schmiedickeanus (Bodeker), F. Buxbaum y Backeberg var. klinkerianus, Cactaceae En: IX Congreso Nacional de Biotecnología y Bioingeniería, Veracruz, México. p. OXII-3. DOF. 2010. Ley de la Propiedad Industrial. Última reforma. H. Congreso de la Unión, México. 6 de enero de 2010. pp. 1-73. DOF. 2012. Ley Federal de Variedades Vegetales. Ultima reforma. H. Congreso de la Unión. México. 9 de abril de 2012. pp. 1-14. IMPI. 2011. Gaceta de la Propiedad Industrial. http:/ /siga.impi.gob.mx/work/sites/ SIGA/gacetas/2011/8/17/PA_MV_2011_03_004_001.pdf. 21 de septiembre de 2011.

LPI, 2012. Ley de Propiedad Industrial 1991, Última Reforma. Cámara de Diputados del H. Congreso de la Unión. Diario Oficial de la Federación, 09-04-2012. Pp. 1-78. Macías-Macías, A. y Valenzuela Zapata, A. 2009. El tequila en tiempos de la mundialización. Comercio Exterior. Vol. 59 (6): 459 472. Murashige, T. y F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Pl. Physiol. 15: 473-479. Naranjo-González, M.A. 2004. Innovación y desarrollo tecnológico: una alternativa para los agronegocios. Revista Mexicana de Agronegocios 14: 237-250. Phillips, G. C. y G. B. Collins. 1979. In vitro tissue culture of selected legumes and plant regeneration from callus cultures of red clover. Crop. Sci. 19: 59-64. Portillo, L. y F. Santacruz-Ruvalcaba. 2006. Factibilidad de uso de un nuevo sistema de inmersión temporal (Orbitabion ) para embriogénesis somática de Agave tequilana Weber cultivar azul. Bol. Nakari 17(2): 43-48. Portillo, L., Santacruz-Ruvalcaba, F., Gutiérrez-Mora A. y B. Rodríguez-Garay. 2007. Somatic embryogenesis in Agave tequilana Weber cultivar azul. In Vitro Cell. Dev. Biol. 43: 569-575. Velázquez E. y Soltero R., 2001. Micropropagación de Epithelantha micromeris (Eng.) Weber ex Britton et Rose. Var. micromeris, Cactaceae. Cactáceas y suculentas mexicanas, 46(3): 56-62 Vigueras, A. L., G. Arroyo-Figueroa, C. Llanderal-Cazares, L. Portillo y E. Lobos. 2013. Desarrollo de productos biotecnológicos con recursos de zonas áridas. pp. 11-44. En: Portillo, L., A. L. Vigueras y R. Soltero (eds.). Biotecnología de Zonas Áridas. Universidad de Guadalajara, México. Zúñiga R., C. 2012. Micropropagación de varios cultivares de Opuntia ficus-indica (L.) Miller (Cactaceae). Universidad de Guadalajara. Tesis de Licenciatura. Guadalajara. México. 36 p.