FICHA PÚBLICA DEL PROYECTO PROGRAMA DE ESTÍMULOS A LA INNOVACIÓN NUMERO DE PROYECTO: 214028 EMPRESA BENEFICIADA: PHARMACOS EXAKTA S.A. DE C.V. TÍTULO DEL PROYECTO: DESARROLLO DE UN MINI-ARREGLO DE ANTIGENOS ASOCIADOS A TUMOR (ATT) PARA EL INMUNODIAGNOSTICO OPORTUNO DE CÀNCER DE MAMA
FICHA PÚBLICA DEL PROYECTO PROGRAMA DE ESTÍMULOS A LA INNOVACIÓN OBJETIVO DEL PROYECTO: Obtener Antígenos Asociados a Tumores (AATs) en forma recombinante y utilizarlos para desarrollar un sistema (Miniarreglo) de diagnóstico temprano para cáncer de mama basado en la detección de autoanticuerpos en pacientes con cáncer de mama. PRINCIPALES ACTIVIDADES REALIZADAS: Se amplificaron a partir de líneas celulares y sangre periférica mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los genes de los cinco antígenos asociados a tumor. Se clonaron los genes correspondientes a las cinco proteínas; sin embargo la secuencia clonada para AHSG no coincidió con la secuencia génica publicada. Por lo que no se pudo expresar, pero se continúa en el proceso de su obtención. Se expresaron las proteínas TPI1, PPIA y PRDX2; en cuanto a la proteína A1AT no se logró expresar pero se compró a un proveedor de Canadá para ser incluida dentro del miniarreglo. Se utilizaron las proteínas recombinantes purificadas TPI1, PPIA, PRDX2 y A1AT en la sensibilización del miniarreglo. Para ello fue necesario purificar mediante cromatografía de afinidad en columnas de níquel las tres proteínas obtenidas a partir de la expresión. Se verificó a través de electroforesis en geles de poliacrilamida la pureza de cada una de las proteínas y se cuantificaron por la técnica de Bradford. Una vez cuantificadas se procedió a imprimirlas sobre una membrana de nitrocelulosa con ayuda del equipo Bio-Dot. Se estandarizaron las condiciones de impresión y de revelado para el uso del miniarreglo.
Finalmente, se evaluó la eficiencia para la detección de anticuerpos en los sueros de los pacientes con cáncer de mama. Para dar cumplimiento a esta actividad se obtuvieron los sueros de 12 pacientes del Centro Médico de Occidente que fueron diagnosticadas por el grupo de oncólogos, los cuales seleccionaron pacientes en etapa temprana de cáncer de mama. A la par se obtuvo el suero de 12 mujeres sanas voluntarias que sirvieron como control, las cuales también fueron evaluadas por los oncólogos para descartar signos clínicos de cáncer. Se demostró que la mayoría de los controles fueron negativos y únicamente una persona fue positiva a la proteína A1AT y otra a la proteína PRDX2. En cuanto a los sueros con cáncer se observó que TPI1 fue positivo en el 50% de los pacientes, para PRDX2 el 41%, para PPIA el 41% y para A1AT el 75%. BREVE DESCRIPCIÓN DEL PROYECTO: La mejor forma para reducir la mortalidad causada por el cáncer de mama es la detección oportuna o temprana de la enfermedad. Debido a la naturaleza asintomática típica del cáncer en etapas tempranas y la carencia de métodos de diagnóstico efectivos para detección temprana, el objetivo del trabajo fue desarrollar un prueba que pueda ser utilizada como un diagnóstico inicial o como prueba de tamizaje. En nuestro país el cáncer de mama es también un problema de salud grave pues representa la segunda neoplasia más frecuente en la mujer, con una incidencia de 18.5 casos por 100 mil habitantes, y constituye la primera causa de muerte en mujeres de 29 y 60 años de edad (8).
Por lo tanto existe necesidad clínica de pruebas adicionales para el diagnóstico del cáncer de mama para su uso como ayuda o apoyo a la mastografía, particularmente en mujeres jóvenes (menores de 50 años) en las cuales la mastografía es menos sensible (32). El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea con células tumorales que expresan una variedad de proteínas aberrantes dichas proteínas pueden estar sobreexpresadas, mutadas, malplegadas o degradadas de forma anormal de tal manera que inducen una respuesta inmune en pacientes con cáncer (33). La expresión de proteínas aberrantes asociadas al tumor puede resultar en la inducción de autoanticuerpos producidos contra dichas proteínas=antígenos Asociados a Tumores (AATs). Los auto-anticuerpos producidos contra los AATs pueden proveer una amplificación in vivo de una señal carcinogénica temprana y demostrarse en circulación prematuramente en el inicio del tumor y antes de la aparición de los síntomas clínicos, por lo tanto su detección daría lugar al diagnóstico oportuno o temprano del cáncer de mama. Esos autoanticuerpos que reaccionan con los AATs pueden utilizarse como reporteros que identifiquen o indiquen la presencia de mecanismos celulares aberrantes en la oncogénesis o tumorigénesis y pueden ser útiles como marcadores para el inmunodiagnóstico del cáncer. Investigaciones previas sugieren que el establecimiento o aparición de una respuesta autoinmune contra algunos antígenos ya se encuentra presente en el suero de los pacientes con cáncer antes de que el tumor sea clínicamente aparente y los síntomas aparezcan.
Resultados preliminares obtenidos por nuestro grupo, nos han permitido detectar 2 proteínas que podrían considerarse como AATs, las proteínas: Alfa-1-Antitripsina/A1AT y la Alfa-2 glicoproteína/ahsg. Por otro lado, recientemente y de forma independiente, investigadores de otros países han reportado que pacientes con cáncer de mama presentan autoanticuerpos que reconocen tres proteínas: la Ciclofilina-A/PPIA, la Triosa Fosfato Isomerasa/TPI1 y Peroxiredoxina2/PRDX2. Por lo anterior, se estableció como unos de los objetivos del presente trabajo obtener las secuencias génicas de las cinco proteínas, sintetizarlas en forma recombinante y utilizarlas en el Mini-Arreglo de AATs que pretendemos desarrollar, se utilizarán las cinco proteínas para incrementar la sensibilidad del Miniarreglo. Cabe señalar que los resultados del Miniarreglo se pueden observar a simple vista y en un tiempo no mayor a 12 horas. El Mini-arreglo desarrollado en el presente proyecto es una herramienta con gran potencial para la detección de autoanticuerpos en sueros de pacientes contra los AATs y para el inmunodiagnóstico de cáncer de mama en etapas tempranas, aun en ausencia de síntomas y a partir de una muestra de suero. RESULTADOS DEL PROYECTO: Se elaboró un mini-arreglo con cuatro antígenos asociados a tumores identificados y sintetizados. El miniarreglo desarrollado consiste en una base de acrílico que funciona como cámara de incubación y que tiene pozos rectangulares sobre los que se colocan fragmentos de membrana de nitrocelulosa que tienen impresas las proteínas recombinantes purificadas. Se evaluó la eficiencia del Mini-Arreglo con sueros de pacientes con cáncer de mama en etapa temprana y en personas sanas.
IMPACTOS DEL PROYECTO: Impacto científico. Se cumplió el 100% del impacto científico dado que se utilizaron proteínas recombinantes de antígenos asociados a tumor para la elaboración del miniarreglo que se expresan en mujeres con cáncer de mama en etapas tempranas. Se generó conocimiento científico al demostrar que estas proteínas se producen mayoritariamente en sujetos con cáncer de mama a diferencia de personas sanas lo que permite su aplicación para diagnóstico con una sensibilidad del 85% para la combinación de las cuatro proteínas incluidas en el miniarreglo. Impacto tecnológico. Se logró un cumplimiento del 100% en el impacto tecnológico debido a que se generó un novedoso sistema de diagnóstico para el cáncer de mama en etapas tempranas. El miniarreglo desarrollado consiste en una base de acrílico que funciona como cámara de incubación y que tiene pozos rectangulares sobre los que se colocan fragmentos de membrana de nitrocelulosa que tienen impresas las proteínas recombinantes purificadas. Las membranas de nitrocelulosa conteniendo proteínas recombinantes (TPI1, PPIA, PRDX2 y PPIA) se deben de bloquear con PBS-Tween al 0.1% y leche descremada al 5%. Posteriormente, para realizar el análisis se coloca el suero de los pacientes y se realiza un revelado mediante quimioluminiscencia. Impacto económico. Una vez que el miniarreglo se comercialice se evidenciará el impacto económico principal del proyecto. Debido a que este kit de diagnóstico tiene el objetivo principal de realizar una detección oportuna del cáncer de mama (cuando aún es asintomático); esto se reflejaría como un ahorro en el sistema de salud al disminuir los gastos de los tratamientos que se aplican a las mujeres con cáncer de mama en etapas avanzadas como son la quimioterapia, cirugía, implantes, medicamentos, terapia psicológica, etc.
Impacto ambiental. Se logró un cumplimiento del 100% en el impacto ambiental dado que el proceso desarrollado en este proyecto fue un procedimiento limpio ya que no se emitieron sustancias o productos que afectaran al ecosistema y al hombre.