El ANALISIS DE ADN PARA PRUEBAS DE PATERNIDAD E IDENTIFICACION FORENSE

GENETICA Acta Científica Venezolana, 50: 24 28, 1999 El ANALISIS DE ADN PARA PRUEBAS DE PATERNIDAD E IDENTIFICACION FORENSE Lennie Pineda Bernal Laboratorio de Genética Molecular. Unidad de Genética Médica. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Apartado 15374. Maracaibo, Venezuela. Teléfonofax: 061-519496. e-mail: lpineda@luz.ve; lpineda@iamnet.com Recibido: 07/07/98; Revisado: 07/09/98 ; Aceptado: 29/09/98 RESUMEN: Del ADN no codificante del genoma humano, gran parte corresponde a ADN repetitivo en tandem, el cual en los ultimos años ha tenido una extensa aplicación para resolver objetivamente, por encima de los marcadores clásicos, casos de paternidad biológica y de identificación de individuos. Una clase particular de este ADN son los loci minisatélites y microsatélites los cuales están constituídos por arreglos de repeticiones en tándem y con una gran variabilidad alélica que los hace marcadores genéticos ideales para esos fines. Este trabajo presenta una revisión sobre estos loci, las técnicas actuales para caracterizarlos, discute su utilidad y plantea algunas consideraciones que deben tenerse en cuenta cuando van a seleccionarse los marcadores para realizar pruebas para determinar paternidad biológica o la identificación de un individuo en el campo de la genética forense. Palabras clave: Minisatélites, microsatélites, perfil de ADN, Huella digital de ADN, paternidad, identificación forense, marcadores genéticos. DNA ANALYSIS FOR PATERNITY TESTING AND FORENSIC IDENTIFICATION ABSTRACT: Non coding DNA of human genome contains an important part of tandem repetitive DNA which last years has been extensively applied to solve paternity disputes and individual identification cases. A class of this DNA are minisatellites and microsatellites loci. Such loci are highly polimorphics because they have a multiple of different alleles to make them ideals genetic markers for these purposes. This article is a review about these loci, methods of their analysis and practical aspects about their applications to determine biological paternity or individual identification in the forensic genetic field are considered. Key Words: Minisatellites, microsatellites, DNA profiling, DNA fingerprinting, paternity testing, forensic identification, genetic markers. INTRODUCCION A excepción de los gemelos idénticos, el material genético de cada individuo es único. Se ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en uno cada 500 nucleótidos. Si el genoma humano contiene 3 10 9 bases, existen entonces, 6 10 6 bases diferentes entre dos personas 20. Esa variabilidad interindividual puede ser estudiada a nivel fenotípico, es decir, a través del producto génico, o a nivel genotípico mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad humana de interés cada vez mayor con el curso de los años, es su aplicación en pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la identificación de seres humanos involucrados en hechos delictivos, ya sea como víctimas o criminales. El tipeaje genético para estos fines empezó con el análisis morfológico, bioquímico o inmunológico, correspondientes éstos ultimos a productos de genes ubicados en una fracción del genoma menor del 10%, quedando un 90% de ADN, no codificador, cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empezó ha ser descubierto a partir de los años 80, cuando se reconoció que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso de las enzimas de restricción y los fragmentos de longitud variable que éstas generaban (RFLP) 3;20. El genoma humano nuclear extragénico está constituído por secuencias únicas y repetidas. Un subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las secuencias repetidas en tandem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de discriminación 24;26. El ADN repetitivo en tandem está constituído por secuencias que no incluyen genes funcionales y que se disponen en arreglos de repeticiones, una al lado de la otra y cada una de ellas contiene una secuencia central básica 16. Se subdivide de acuerdo al tamaño promedio del arreglo en: ADN satélite, ADN minisatélite y ADN microsatélite. (Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatélite y el microsatélite son los que mayor importancia tienen hoy dia para resolver problemas en identificación humana y pruebas de paternidad 1;3,5;11;12;24;26. ADN MINISATELITE: ANALISIS MEDIANTE SONDAS MULTILOCUS, UNILOCUS Y PCR Los loci más variables descubiertos en el genoma humano son las secuencias minisatélites, conocidas como regiones hipervariables (HVR) y posteriormente, como repeticiones en tandem de número variable (VNTR). Su hi-

El análisis de ADN en genética forense 25 pervariabilidad es debida a la diversidad en el número de reiteraciones de determinadas secuencias de nucleótidos las cuales para estos loci, oscilan entre 7 y unos 100 nucleótidos. Existen grandes similitudes en las secuencias de la unidad central que se repite en un gran número de minisatélites. Esta similaridad le sugirió a Alec Jeffreys, en Inglaterra, que si se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa unidad central se podrían detectar fragmentos de ADN de longitud variable a través del método de transferencia de Southern y producir, para cada individuo un patrón específico de bandas de ADN al cual denominó "DNA fingerprinting" o huella digital de ADN 15. Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción, seguida por la separación de los fragmentos en geles de agarosa, transferencia del ADN y la hibridación con una sonda marcada. (Figura 2). Estas sondas detectan entre 15 y 20 fragmentos variables de ADN en el individuo, con rangos de tamaño mayores de 3.5 Kb, más múltiples fragmentos, mucho más pequeños, tan complicados para resolver electroforéticamente que no son considerados en la evaluación estadística de los casos 3;13;15;22. Las sondas multilocus han probado su utilidad en paternidad y otros tipos de relación familiar, inclusive hermanos, y en casos donde pueda faltar la madre 3;14. Sin embargo, su aplicación para pruebas forenses ha presentado algunos problemas, debido entre otras cosas, a dificultades en la interpretación de patrones incompletos que resultan de degradación parcial o a pobre recuperación de ADN en la muestra, y a la inhabilidad de detectar muestras con ADNs mezclados que se originan de más de una persona como ocurre en casos de violación 16. Por otro lado, su análisis que no se realiza locus por locus, por la imposibilidad de identificar a cada uno de ellos, sino más bien, banda por banda, hace que su análisis estadístico, basado en la proporción de bandas compartidas por personas no emparentadas en la población y no en la genética mendeliana sea poco familiar y poco aceptado, particularmente en Estados Unidos y gran parte de los países europeos, donde se prefiere el análisis con sondas unilocus 23 o el análisis de microsatélites 7;11. Con la huella digital de ADN se obtienen fenotipos más no genotipos y es por ello que se han desarrollado una serie de sondas locus específica para proveer información genotípica. De esta manera, por transferencia Southern se detecta una banda por alelo y por ende, comportarse como cualquier locus codominante. Así, los individuos homocigotos y heterocigotos presentarán una o dos bandas, respectivamente, por locus analizado. (Figura 2). Deben tener un buen balance entre variabilidad y estabilidad. Para casos forenses, las sondas minisatélites unilocus escogidas deben tener un extraordinario nivel de variabilidad alélica. Las sondas unilocus son una herramienta poderosa en análisis forenses y de paternidad, sin embargo, al igual que las sondas multilocus, su caracterización metodológica es compleja y laboriosa y el límite de concentración de ADN genómico es de 10 ng. Por estas razones, en algu- Figura 1. Repeticiones en tandem de número variable: locus micro o minisatélite nos casos forenses su aplicación pueda verse restringida. A diferencia del análisis por sondas multilocus, su estudio se denomina perfil de ADN o "DNA profiling" 16. En los casos de minisatélites de menor tamaño, con alelos no mayores de 1Kb, se ha recurrido a la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) utilizando iniciadores diseñados de secuencias únicas de ADN vecinas al arreglo repetido en tandem (Figura 1). Sin embargo, si se aumenta el número de ciclos, alelos hasta de 6 Kb pueden detectarse directamente con bromuro de etidio en geles de agarosa, sin necesidad de hibridación con sondas. Loci con estas características pueden ser analizados con poca muestra lo cual es de gran utilidad en el campo forense ya que permite extender estos estudios a muestras como saliva, pelo, restos óseos, etc. Con ellos se obtienen alelos discretos, fáciles de analizar por PCR y caracterizar mediante electroforesis en poliacrilamida, coloración con bromuro de etidio o nitrato de plata y el contraste con escaleras alélicas. Sin embargo, su variabilidad es mucho menor que la observada para loci minisatélites mayores, encontrándose sus valores de heterocigosis alrededor del 80-85% 25. La evaluación estadística cuando se utilizan minisatélites, ya sea por sondas unilocus o PCR, requiere del conocimiento de las frecuencias alélicas y de la estructura de la población de la cual son estimadas 9;20. Es necesario valorar si se están utilizando bases de datos de referencia apropiados y si la suposición de equilibrio de Hardy Weinberg es válida. En los casos de loci con distribución cuasicontínua, como lo son la mayoría analizados con sondas unilocus, para el cálculo de frecuencias alélicas se establecen categorías de tamaño o "binning" 5. Es importante que el agrupamiento de alelos sea conservador, relativo al criterio empleado para declarar un apareamiento foren-

26 Pineda-Del Villar descritos, múltiples loci microsatélites con heterocigosidades mayores del 80%, en particular, el locus HUMACTB2 (SE33) que es complejo, y tiene una heterocigosis promedio de 94% y más de 35 alelos 17;19. La simplicidad de la técnica de la PCR y su aplicación para el análisis de los STRs le confiere a estos sistemas una gran fortaleza, en relación a aquellas donde se utiliza hibridación. Además, mientras que con VNTR los resultados se obtienen entre 15 días a un mes, una batería de 12 STR, mediante amplificación múltiple, puede arrojar resultados entre 3 y 4 días 1;4;12. Todas estas características, aunadas a la tradicional valoración estadística de loci codominantes con herencia mendeliana clásica, han determinado que su aplicación en la mayoría de los laboratorios dedicados a los estudios de paternidad e identificación forense, se incremente dia a dia 2;7;26. CONSIDERACIONES Y RECOMENDACIONES PARA EL USO DE REPETITIVO EN TANDEM EN ANALISIS DE PA- TERNIDAD BIOLOGICA E IDENTIFICACION FORENSE Figura 2. Procedimiento Southern y sondas uni o multilocus (A: Padre, B: Hijo, C: Madre/ A: Evidencia, S 1 ys 2 : sospechosos). se, es decir, que el peso estadístico de la evidencia esté sesgado en favor del acusado 16. ADN MICROSATELITE Y SU ANALISIS CON PCR El ADN microsatélite, llamado también repeticiones cortas en tandem (STR) están constituídos por unidades que van desde 2 a 6 pares de bases, son abundantes en el genoma y cerca de la mitad de los estudiados hasta ahora, son altamente polimórficos 25 (Figura 1). Estos loci tienen la gran ventaja, en relación a la mayoría de los minisatélites, de que poseen alelos discretos que pueden caracterizarse por PCR y utilizarse técnicas de marcaje no radiactivo en combinación con secuenciadores automáticos 20.LaPCR se realiza utilizando iniciadores que hibridan con secuencias únicas que delimitan el locus STR. Permite el análisis de cantidades de muestras muy pequeñas, con preparaciones crudas de ADN, inclusive ADN degradado y los resultados son fáciles de interpretar. En general, los loci STR tri y tetranucleotídicos ofrecen una ventaja sobre los dinucleotídicos ya que los productos de amplificación, tienden a tener menos artefactos, es decir, bandas extras que dificultan la interpretación de los resultados y que pueden ser más grandes o más pequeñas que el alelo real 25. En general, la variabilidad genética de los STR es menor, entre el 60 y 80%. Sin embargo, recientemente han sido Uno de los criterios de valoración de cualquier marcador, para propósitos de identificación, es su poder de exclusión, es decir, el poder de excluír a un individuo falsamente acusado 23 o simplemente declarar una no inclusión lejos de cualquier duda razonable. Esta cualidad de un marcador está directamente relacionada con su nivel de polimorfismo o heterocigosis, y que a su vez determinará cuan probable es que en la población dos individuos no relacionados coincidan en su genotipo. La identificación de individuos, mediante el análisis de ADN, se basa en el alto nivel de polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un número muy alto de genotipos posibles, a diferencia de los sistemas biológicos de identificación clásicos proteicos, tales como enzimas, grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en cada caso 18. Otra ventaja del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier célula nucleada y es muy resistente a la degradación 3. Con las sondas multilocus o con una batería de 5 a 6 sondas unilocus, con heterocigosis de alrededor del 90%, el poder de exclusión puede llegar a 99,99%. Por el contrario, cuando se utilizan minisatélites o microsatélites, con niveles de heterocigosis menores, el número de loci a analizar debe ser mayor. Chakraborty y Jin 10, derivaron una teoría para establecer cuantos loci, de esta categoría, deberían ser analizados por PCR para alcanzar los mismos niveles de discriminación que con las sondas. Por ejemplo, para loci mini o microsatélites con heterocigosidades de alrededor del 80%, se requeriría analizar unos 11 y 18, cuando la heterocigosidad es de un 70%. Sin embargo, con los nuevos microsatélites descritos, el número de loci es menor. La delicadeza de estas pruebas y las implicaciones de sus resultados determina que cualquiera sea la batería de los marcadores seleccionados, éstos, combinadamente,

El análisis de ADN en genética forense 27 deben tener un poder de exclusión o conducir a una Probabilidad de Paternidad (W), en los casos de inclusión, no menor al 99,99%. A pesar de que la normativa actual recomienda alcanzar este valor, en la mayoría de los paises europeos un valor del 99,73% es considerado como "paternidad practicamente probada" 8. Esto es un muy asunto muy serio porque muchos laboratorios, inclusive en USA, establecen diagnósticos de no paternidad con solo un sistema o marcador 20;21. En los casos delictivos, los loci analizados deben conjuntamente conducir a un Poder de Discriminación no menor al 99.99%. En algunos casos, esto es muy difícil de obtener por la naturaleza de las muestras de las que se dispone 8, sin embargo, cualquiera sea el caso, deben realizarse todos los esfuerzos para analizar los loci que sean necesarios para asegurar un resultado, lejos de toda sombra de duda. REFERENCIAS 1. Alford, R.L., Hammond, H.A., Coto, I. and Caskey, C.T. Rapid and efficient resolution of parentage by amplification of Short Tandem Repeats. Am. J. Hum. Genet. 55: 190-195, 1994. 2. Bär, W., Brinkmann, B., Budowle, B., Carracedo, A., Gill, P., Lincoln, P., Mayr, W.and Olaisen, B. DNA recomendations. Further report of the DNA Commission of the ISFH regarding the use of short tendem repeat systems. Int. J. Legal Med. 110: 175-176, 1997. 3. Bohm, I., Krawczak, M., Nümberg, P., Hampe, J., Hundrieser, J., Pöche, H., Peters, C., Slomski, R., Kwiatkowska, J., Naggy, M., Pöpperl, A., Epplen, J.T. and Schmidtke, J. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA fingerprinting: State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 257-260. 4. Brdicka, R. and Nümberg, P. Checking of individuality by DNA profiling. J. Chromatography 618: 167-179, 1993. 5. Budowle, B., Giusti, A.M., Waye, J.S., Baechtel, F.S., Fourney, R.M., Adams, D.M., Presley, L.A., Deadman, H.A. and Monson, K.L. Fixed-bin analysis for statistical evaluation of continous distributions of allele data from VNTR loci, for use in forensic comparisons. Am. J. Hum. Genet. 48: 841-855, 1991. 6. Carracedo, A. y Pestoni, C. El cálculo de la probabilidad en criminalística. Principales problemas prácticos. En: Problemas estadísticos en Genética Forense.(Carracedo, A., Barros, F., eds) Universidade Santiago de Compostela, Servicio de Publicaciones e Intercambio Científico, 1996, pp. 115-128. 7. Carracedo, A., Rodriguez-Calvo, M.S., Pestoni, C., Lareu, M.V., Bellas, S., Salas, A. and Barros, F. Forensic DNA analysis in Europe: current situation and standardization efforts. Forensic. Sci. Int. 86: 87-102, 1997. 8. Carracedo, A. y Barros, F. Principales problemas forenses en la prueba positiva de paternidad. En: Problemas estadísticos en Genética Forense.(Carracedo A., Barros F., eds) Universidade Santiago de Compostela, Servicio de Publicaciones e Intercambio Científico, 1996, pp. 115-128. 9. Chakraborty, R. The status of DNA Fingerprinting: population databases. In: DNA markers: Protocols, applications, and overviews. (Caetano Anollés, G., Gresshoff, P.M., eds) New York. wiley-vch, 1996, pp. 301-311. 10. Chakraborty, R. and Jin, L. A unified approach to study hypervariable polymorphisms: Statistical considerations of determining relatedness and population distances In: DNA fingerprinting: State of the Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 153-175. 11. Gill, P., Kimpton, C., D Aloja, E., Andersen, J.F., Bar, W., Brinkmann, B., Holgersson, S., Johnsson, V., Kloosterman, A.D., Larew, M.V., Nellemann, L., Pfitzinger, H., Phillips, C.P., Schmitter, H., Schneider, P.M. and Stenersen, M. Report of the european DNA profiling groups (EDNAP)- Towards standardization of short tandem repeat (STR) loci. Forensic Sci. Int. 65: 51-59, 1994. 12. Hammond, H.A., Jin, L., Zhong, Y., Casbey, C.T. and Chakraborty, R. Evaluation of 13 short tandem repeat loci for use in personal identification applications. Am.J.Hum.Genet. 55: 175-189, 1994. 13. Herrera, R.J. and Tracey, M.L. DNA fingerprinting: basic techniques, problems and solutions. J. Ciminal Justice 20: 237-248,1992. 14. Honna, M. and Ishiyama, Y. Application of DNA fingerprinting to parentage and extended family relationship testing. Hum. Hered. 40: 356-362, 1990. 15. Jeffreys, A.J., Turner, M. and Deberham, P. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationship, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840, 1991. 16. Jeffreys, A.J. and Pena, S.D.J. Brief introduction to human DNA fingerprinting. In: DNA fingerprinting: State of the Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 1-20. 17. Lareu, M.V., Pestoni, C., Schürenkamp M., Rand S., Brinkmann B. and Carracedo, A. A higly variable STR at the D12391 locus. Int. J. Legal Med. 109: 134-138, 1996. 18. McElfresh, K.C., Vining-Forde, D. and Balozs, Y. DNAbased identity testing in forensic science. BioScience 43(3): 149-157, 1993. 19. Moller, A. and Brinkmann, B. Locus ACTBP2(SE33) sequencing data reveal considerable polymorphism. Int. J. Leg. Med. 106: 262-267, 1994. 20. Pena, S.D.J., Prado, V.F. and Epplen, J.T. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995.

28 Pineda-Del Villar 21. Pena, S.D.J. Pittfals of paternity testing based solely on PCR typing of minisatellites and microsatellites. (letters to the Editor). Am. J. Hum. Genet. 56: 1503-1504, 1995. 22. Pena, S.D.J., Santos, P.C., Campos, M.C.B.N. and Macedo, A.M. Paternity testing with the F10 multilocus DNA fingerprinting probe. In: DNA fingerprinting: State of the Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 237-248. 23. Pena, S.D.J. and Chakraborty, R. Paternity testing in the DNA era. Trends in Genetics 10: 204-209, 1994. 24. Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers, 1972, p. 160. 25. Sprecher, C.J., Puers, C., Lins, A.M. and Schumm, J.W. General approach to analysis of polymorphic short tandem repeat loci. BioTechniques 20: 266-276, 1996. 26. Van Daal, A. DNA profiling in forensic science and parentage testing. Australasian. BioTechnology 4: 92-96, 1994.