PEPTIDASAS Peptidasas: Hidrolizan la unión entre el carboxilo de un aminoácido y el α-amino del siguiente (unión peptídica) en una proteína. Pueden ser exopeptidasas, si hidrolizan a partir del extremo N- terminal (aminopeptidasas) o del extremo C-terminal (carboxipeptidasas), o endopeptidasas, si hidrolizan en cualquier unión peptídica (según su especificidad). Existen también dipeptidasas, dipeptidil-peptidasas, etc. El término peptidasas suele reservarse para las enzimas que cortan péptidos pequeños, en tanto que el de proteasas o proteinasas se aplica más frecuentemente a las endopeptidasas capaces de hidrolizar péptidos grandes y proteínas. 1
1) Función digestiva. a) Extracelular. b) Intracelular. 2) Turnover proteico. FUNCIONES DE LAS PROTEINASAS. 3) Procesamiento post-traduccional de proteínas. a) Proteasas del péptido señal. b) Proteasas de procesamiento de pro-hormonas y otras proteínas. c) Dominio pro- en muchas proteinasas. 4) Invasión de tejidos (parásitos, metástasis tumorales). 2
CLASIFICACION DE LAS PEPTIDASAS. Se las suele clasificar según los siguientes criterios: 1) Por la reacción catalizada: Son pocos los casos en que se conoce exactamente la reacción catalizada, en términos de qué unión es hidrolizada en el substrato. Se aplica sobre todo a exopeptidasas. 2) Por el mecanismo catalítico: Es la más usada, desde su propuesta por Brian Hartley hace más de 30 años. Se basa en cuáles son los grupos que intervienen en la catálisis y en cómo actúan. 3) Por su secuencia y estructura: Es la clasificación más moderna, propuesta por Alan Barrett, y complementa a la anterior. 3
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ENDOPEPTIDASAS. Pueden ser denominadas en base a la preferencia por un determinado residuo en P 1 o en P 1 (por ejemplo, glicil-endopeptidasa; peptidillisil endopeptidasa). Si hay varias enzimas con igual especificidad, hay que distinguirlas (glutamil endopeptidasas I y II). En la gran mayoría de los casos, la especificidad es demasado compleja, y se usan nombres triviales (pepsina, tripsina, quimotripsina, papaína, termolisina) 6
REACCIONES CATALIZADAS POR LA QUIMOTRIPSINA. Benzoil-L-tirosilglicinamida + OH 2 Hidrólisis Benzoil-L-tirosina + Glicinamida Benzoil-L-tirosina + Glicinanilida Benzoil-L-tirosilglicinalida + OH 2 Síntesis Benzoil-L-tirosinamida + glicinamida Benzoil-L-tirosilglicinamida + NH 3 Transferencia Acetil-L-tirosina etil ester + OH 2 Hidrólisis de ester Acetil-L-tirosina + etanol 7
CLASES DE PROTEINASAS Serin proteinasas. Cistein proteinasas. Aspartil proteinasas Metaloproteinasas Treonin proteinasas Intermediario covalente con el OH de Ser. Inhibidas por DIFP, PMSF, TLCK, TPCK, leupeptina, quimostatina, inhibidores proteicos (serpinas). Intermediario covalente con el SH de Cys. Inhibidas por E-64, organomercuriales, TLCK, TPCK, leupeptina, inhibidores proteicos (cistatinas). Dos residuos de Asp, que en las de mamíferos provienen uno de cada uno de dos dominios homólogos, y en las virales (HIV) de dos subunidades. ph óptimo muy ácido. Inhibidas por pepstatina. Atomo metálico (frecuentemente Zn) ligado por dos His y un Glu. Resto de la molécula en general poco conservado. Inhibidas por quelantes de metales (o-fenantrolina, EDTA). Proteasoma (proteinasa multicatalítica). Treonina en el sitio activo. Inhibidor: lactacistina. Mecanismo desconocido: "lista de espera de las proteinasas". 8
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CLASIFICACION POR RELACION EVOLUTIVA (Alan J. Barrett, Cambridge, U.K.) Comparación de secuencias proteicas. Clasificación en Familias, cuyos miembros derivarían de una misma proteína ancestral por evolución divergente. Tienen homología estadísticamente significativa, al menos en el dominio catalítico (es decir, en el que tiene actividad de proteasa). Clanes, grupos de familias con una proteína ancestral común. La homología de secuencia entre ellas es mucho mas baja, pero se conservan el orden lineal de los residuos del sitio activo y los pequeños grupos de residuos que los rodean; además, tienen una estructura terciaria similar. 10
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PURIFICACION DE PROTEINASAS 13
SUSTRATOS USADOS PARA PEPTIDASAS 1. Proteínas o péptidos grandes, de origen natural. 2. Dipéptidos o tripéptidos con grupos cromogénicos o fluorogénicos. 3. Péptidos sintéticos. Problemas que pueden presentarse si las enzimas no estan puras: Z-Ala-Ala-Phe-- NHMec Enzima con especificidad de quimotripsina Neprilisina Aminometilcumarina (fluorescente) + Z-Ala-Ala-Phe Z-Ala-Ala + Phe-- NHMec Aminopeptidasa Phe + Aminometilcumarina 14
DESCRIPCION DE LA ESPECIFICIDAD DE LAS PEPTIDASAS. 15
SUSTRATOS PROTEICOS. 1) Proteínas naturales como sustratos generales (hemoglobina, caseína) a) Precipitación de proteína no digerida y determinación de A 280 nm en el sobrenadante. b) Precipitación y reacción de Folin en el sobrenadante. 2) Derivados cromogénicos de proteínas naturales (azocaseína, azoalbúmina) Precipitación y lectura de la A 440 nm de los azopéptidos. 3) Derivados fluorogénicos de proteínas naturales (FITC-caseína). 4) Proteínas específicas. a)colágenos para colagenasas. b) Pre-proteínas radioactivas (sintetizadas por traducción in vitro de su mrna), para las proteinasas del péptido señal. 16
5) Proteínas naturales marcadas con radioisótopos ( 125 I en Tyr). Precipitación y determinación de radioactividad en el sobrenadante. 6) Separación de fragmentos grandes después de proteólisis limitada. a) HPLC en fase reversa. b) SDS-PAGE. c) Filtración por gel. 7) Determinaciónes en fase sólida (proteinasa, o sustrato, o ambos, inmovilizados). a) Electroforesis en gel de poliacrilamida. i) Actividad determinada in situ después de la electroforesis. - Métodos histoquímicos: β-naftilamidas y Fast Garnet. - Proteína copolimerizada: Gelatina, fibrinógeno. ii) actividad determinada poniendo el gel electroforético en contacto con otro que contiene el sustrato ("réplica blotting"). - Geles de agarosa embebidos en solución de la proteína. - Transferencia por capilaridad a nitrocelulosa y reacción histoquímica. b) Ensayos de ELISA i) Determinación de colagenasa. 17
SUSTRATOS SINTETICOS: Péptidos cromogénicos o fluorogénicos. a) Sustratos de endopeptidasas (sin amino ni carboxilo libres). b) Sustratos de aminopeptidasas (sólo el carboxilo bloqueado). c) Sustratos de carboxipeptidasas (sólo el amino bloqueado). Grupos bloqueantes del amino: Benzoil (Bz); Benzoiloxicarbonil (Z); O-Aminobenzoil (Abz); Acetil (Ac); Succinil (Suc). 18
Ensayos espectrofotométricos: a) 4-nitroanilidas (NH-Nan): Derivados N-acilados de la 4-nitroanilina. La A 400 nm difiere en aprox. 10.000 M -1 cm -1 entre las 4-nitroanilidas y la 4-nitroanilina a ph 8.0. Utilizables en determinaciones espectrofotométricas continuas. b) 2-naftilamidas (NH-Nap): La 2-naftilamina tiene su máximo de absorción a 340 nm, y difiere de las 2-naftilamidas en aprox. 1.700 M -1 cm -1. Esto depende del ph: por debajo de 5.5 no hay diferencia. Se puede aumentar la sensibilidad por diazotación de la naftilamina libre con N(1-naftil) etilendiamina diclorhidrato, o por reacción con una sal de diazonio estable, el Fast Garnet, que da un producto insoluble (requiere un detergente para mantenerse en solución). c) Amidas y ésteres: La hidrólisis de amidas puede seguirse a 230 nm, o siguiendo la liberación de aminoácidos con ninhidrina. Baja sensibilidad. 19
Ensayos fluorimétricos: a) 2-naftilamidas: 3 ordenes de magnitud más sensible que la diazotación. Sensible al ph. Excitación a 335 nm y emisión de 410 nm. b) 7-amino-4-metil cumarilamidas (NH-Mec): Fluoróforo libre, 500 a 700 veces más fluorescente que el conjugado. Excitación a 380 nm, emisión a 460 nm. c) Sustratos fluorogénicos "quencheados" intramolecularmente. Abz-L-gly-Phe(NO 2 )-Pro. Excitación a 310 nm, emisión a 410 nm. 20
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DETERMINACION DE LA CLASE MECANISTICA A LA CUAL PERTENECE LA PROTEINASA. Métodos actuales: 1) Susceptibilidad a inhibidores. 2) Secuenciación de la proteína. 3) Estudios de mutagénesis dirigida. 4) Cristalografía de Rayos X. Métodos históricos 1) Identificación de intermediarios de la reacción. 2) Dependencia de la actividad con el ph. 3) Determinación del efecto de la sustitución de H 2 0 por D 2 0. 4) Estudios de modificación química. 24
INHIBIDORES DE PEPTIDASAS 1) Moléculas pequeñas, naturales o sintéticas, basadas en una estructura peptídica con el agregado de un grupo químicamente reactivo. 2) Moléculas pequeñas, sintéticas, sin estructura peptídica, pero con grupos capaces de ligarse al sitio activo. 3) Quelantes de metales, en el caso de las metalopeptidasas. 4) Inhibidores proteicos naturales: Serpinas para algunas serin proteinasas. Cistatinas para algunas cistein proteinasas. TIMPs para algunas metaloproteinasas. Inhibidores sin distinción de clase catalítica: α-2-macroglobulina. 25
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