Identificación de antígenos específicos de Leishmania mexicana con sueros humanos inmunes de la Península de Yucatán, México.

197 Rev Biomed 1996; 7:197-204. Identificación de antígenos específicos de Leishmania mexicana con sueros humanos inmunes de la Península de Yucatán, México. José Pérez-Mutul 1, Gener Braga-Cob 1, Tayde Sosa-Cabrera 2, Jorge Zavala-Castro 1. 1 Centro de Investigaciones Regionales "Dr. Hideyo Noguchi", Universidad Autónoma de Yucatán. Mérida, Yucatán, México. 2 Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales, Universidad Autónoma de Campeche. Campeche, Campeche, México. RESUMEN. Introducción. La leishmaniasis cutánea localizada en México, conocida comúnmente como úlcera del chiclero", fue descrita por primera vez en la Península de Yucatán en 1912. El control de esta enfermedad requiere de métodos diagnósticos adecuados. Las técnicas parasitológicas tienen baja sensibilidad y consumen mucho tiempo. Recientemente se introdujo el método ELISA para el serodiagnóstico en la Península. Sin embargo, sólo mostró 76% de sensibilidad y dio reactividad cruzada con los sueros de enfermos de Chagas. Objetivo. Identificar antígenos específicos de Leishmania mexicana por análisis de Western blot utilizando sueros de enfermos procedentes de la Península de Yucatán. Material y métodos. Se utilizó una cepa aislada de un enfermo e identificada por análisis de zimodemos como Leishmania mexicana mexicana. Se prepararon extractos antigénicos a partir de los promastigotes cultivados en medio líquido. Se fraccionaron las proteínas del parásito utilizando metodología convencional (SDS-PAGE). Se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se incubaron con los sueros de los pacientes. Los inmunoblots se revelaron con proteína-a conjugada con peroxidasa y cloronaftol/peróxido de hidrógeno. Resultados. En el análisis electroforético se detectaron 21 componentes parasitarios, entre los cuales predominó el componente de 63 kda. El perfil antigénico detectado en el Western blot con los sueros humanos inmunes consistió en cinco componentes cuyos pesos moleculares son de 84, Solicitud de sobretiros: José Pérez-Mutul, Centro de Investigaciones Regionales "Dr. Hideyo Noguchi", Universidad Autónoma de Yucatán. Calle 59 No.490 x Av. Itzáes. Mérida 97000, Yucatán, México. Fax: (99) 23-61-20. Recibido el 29/Julio/1996. Aceptado para publicación el 11/Noviembre/1996. Vol. 7/No. 4/Octubre-Diciembre, 1996

198 J Pérez-Mutul, G Braga-Cob, T Sosa-Cabrera, J Zavala-Castro. 77, 63, 28 y 18 kda. Conclusiones. Los componentes antigénicos de Leishmania mexicana de 18, 63 y 84 kda podrán ser utilizados para desarrollar ensayos inmunoenzimáticos más sensibles y más específicos, los cuales serán de gran utilidad en el diagnóstico y la epidemiología de la "úlcera del chiclero" en la Península de Yucatán. Palabras clave: Leishmania mexicana, Western blot, Enfermedad de Chagas. SUMMARY. Identification of specific antigens of Leishmania mexicana using immune human sera in the Yucatan Peninsula. Introduction. The cutaneous leishmaniasis found in Mexico, commonly known as "chiclero's ulcer" was first described in the Yucatan Peninsula in 1912. Control of this disease requires adequate diagnostic methods. The parasitological techniques have low sensibility and take a long time. Recently, an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was introduced for serumdiagnosis in the Yucatan Peninsula. However, it only showed 76% sensibility and gave a crossed reactivity with the serum of Chagas disease. Objective. To identify specific antigens to Leishmania mexicana mexicana, by Western blot analysis using serum from patients in the Yucatan Peninsula. Materials and methods. A strain of Leishmania was isolated from a patient and identified as Leishmania mexicana mexicana by Zymodemos analysis. Antigens were prepared from the promastigotes cultivated in a liquid medium. The parasites were separed using conventional methods (SDS-PAGE). They were transferred to nitrocelulose membranes and incubated in the serum from the patients. The immunoblots were revealed with A-protein conjugated with peroxidase and chloronaftol hydrogen peroxide. Results. In the electrophoretic analysis, 21 Revista Biomédica parasitic components were detected, of which the 63 kda component predominated. The antigenic profile from the immune human serum detected by Western blot consisted of five components whose molecular weights are of 84, 77, 63, 28 and 18 kda. Conclusions. The antigenic components of Leishmania mexicana of 18, 63 and 94 kda could be used to develop more sensible and more specific ELISA, which will be useful in the diagnosis and epidemiology of the "rubber planter's ulcer" in the Yucatan Peninsula. INTRODUCCION. La leishmaniasis cutánea localizada en México, conocida comúnmente como "úlcera del chiclero", fue descrita por primera vez en la Península de Yucatán en 1912 (1). Estudios clínicos y epidemiológicos recientes han demostrado que la región selvática de la Península constituye una zona endémica importante de esta enfermedad (2). Nosotros mostramos recientemente la identificación de los parásitos aislados de enfermos con "úlcera del chiclero", empleando metodología de hibridación de ácidos nucleicos con sondas biotinadas de kdna (3). Este análisis demostró que la mayor parte de los parásitos aislados en la Península, 98% de 134 enfermos, correspondieron a Leishmania mexicana. El control de la leishmaniasis cutánea en esta zona endémica del país requiere de métodos diagnósticos adecuados. Las pruebas diagnósticas actuales están basadas en la detección directa del protozoario en improntas y biopsias teñidas, en cultivos in vitro o en hamsters inoculados (4). Sin embargo, estas técnicas parasitológicas tienen baja sensibilidad y consumen mucho tiempo de trabajo en el laboratorio. Además, en muchos casos el nivel de parasitismo es extremadamente bajo y los cultivos del material aspirado en las lesiones pueden requerir largos períodos de incubación. Estas técnicas necesitan ser reemplazadas por ensayos serológicos, particularmente en casos de tasa baja

199 Antígenos de Leishmania mexicana. de infección o de pacientes crónicos en los cuales es imposible detectar el parásito. Recientemente se mostró la utilidad del método ELISA para el serodiagnóstico de la "úlcera del chiclero" en la Península de Yucatán (5). Sin embargo, esta prueba sólo mostró 76% de sensibilidad y dio reactividad cruzada con los sueros de enfermos de Chagas, complicando evidentemente este ensayo serológico. El objetivo del presente trabajo fue identificar antígenos específicos de Leishmania mexicana por análisis de Western blot utilizando sueros de enfermos procedentes de la Península de Yucatán. Este enfoque representa el paso inicial que nos permitirá, primero seleccionar y purificar antígenos específicos del parásito, y segundo desarrollar con estos antígenos purificados ensayos inmunoenzimáticos más sensibles y más específicos, los cuales tendrán gran valor para el diagnóstico y la epidemiología de esta enfermedad en la Península. MATERIAL Y METODOS. Leishmania.- Se utilizó una cepa de Leishmania aislada de un paciente con leishmaniasis cutánea e identificada por análisis de zimodemos como Leishmania mexicana mexicana (MHOM/MX/92/ INDRE AG). Fue donada gentilmente por el Dr. Oscar Velasco-Castrejón, Laboratorio de Parasitología, INDRE, México, D.F. Se utilizó por brevedad la designación de Leishmania mexicana en vez de Leishmania mexicana mexicana. Esta cepa se creció en cultivo axénico a 21 o C, en medio líquido F-12 Nutrient Mixture (GIBCO BRL) suplementado con L-glutamina, 250 U/ml de penicilina, 250 ug/ml de estreptomicina y 15% de suero fetal bovino. Sueros.- Se utilizaron 17 sueros de pacientes diagnosticados clínica y parasitológicamente como "úlcera del chiclero", en fase aguda de la enfermedad (menos de un año de evolución), sin haber recibido tratamiento, procedentes del Estado de Campeche (Península de Yucatán). Los sueros se obtuvieron y se seleccionaron esencialmente de acuerdo con lo que se había descrito (5). Controles negativos.- Se utilizaron sueros de personas sanas, donados por colegas del laboratorio que no refirieron antecedentes de leishmaniasis cutánea. Preparación del antígeno.- Los extractos antigénicos fueron preparados a partir de los promastigotes cultivados de Leishmania mexicana. Estos se cosecharon durante la fase logarítmica tardía de su crecimiento por centrifugación a 500 X g durante 10 minutos, a 4 o C. El paquete de parásitos obtenido se lavó tres veces con PBS ph 7.4 y se resuspendió finalmente en solución SSC 1X (6). Se añadieron como inhibidores de proteasas leupeptin 2 ug/ml y PMSF 100 µg/ml (6). Los parásitos se lisaron por sonicación a través de tres ciclos de un minuto cada uno y espaciados por reposos de un minuto. Las muestras se mantuvieron en hielo durante todo el procedimiento de sonicación. Este sonicado total se centrifugó a 10,000 X g durante 30 minutos para obtener la fracción soluble y la fracción de membranas, y a partir de esta última se extrajeron fracciones con detergentes SDS y Tritón X-100. Cuantificación de proteínas.- Se determinó la concentración de proteína total en los extractos de Leishmania mexicana de acuerdo con el método de Bradford (7). Se utilizó la albúmina de suero bovino (BSA) como el estándar para establecer la curva de calibración. Análisis electroforético de proteínas.- Los componentes antigénicos del parásito se fraccionaron por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y con el sistema de buffer discontinuo, de acuerdo con el método de Laemmli (8). Se utilizaron geles en placa de 1.5 mm de espesor, al 5% para la sección concentradora y al 10% para la separadora. Las muestras se calentaron a 100 o C durante 5 minutos, en presencia de 100 mm de betamercaptoetanol antes de depositar en el gel. Se cargaron 60 µg de proteína por carril. La concentración de la muestra se realizó a 100 Vol. 7/No. 4/Octubre-Diciembre, 1996

200 J Pérez-Mutul, G Braga-Cob, T Sosa-Cabrera, J Zavala-Castro. RESULTADOS. Para analizar electroforéticamente las proteínas de Leishmania mexicana, los promastigotes cultivados se lisaron por sonicación en presencia de inhibidores de tres tipos de proteasas, metaloproteasas, serinproteasas y cisteinproteasas. En la figura 1 se muestra el análisis electroforético de diferentes extractos del parásito. Ahora bien, la preparación de extractos parasitarios por sonicación representa un tiempo considerable de manipulación experimental antes del análisis electroforético. A pesar que la ruptura de los parásitos se realizaba en presencia de inhibidores de proteasas, quisimos demostrar que no había degradación proteolítica durante el procedimiento de sonicación. Para ello, una muestra de los parásitos se lisó directamente en presencia de inhibidores de proteasas con el buffer de carga para electroforesis. Esta preparación del parásito (carril 2) comparada con el sonicado total (carril 3) muestra que el pavoltios constantes y la separación a 200 voltios constantes. Las proteínas se detectaron en el gel mediante tinción con azul de Coomassie R-250 (6). Determinación del peso molecular de las proteínas.- Los marcadores de peso molecular se obtuvieron de Bethesda Research Laboratories (USA). Estos se analizaron por SDS-PAGE en conjunción con los extractos de Leishmania y se obtuvo para cada gel la curva de calibración correspondiente. Estas curvas de calibración se establecieron utilizando el logaritmo del peso molecular de los estándares contra la migración de éstos en el gel medida en cm. Los pesos moleculares de las proteínas de Leishmania se estimaron por interpolación en la gráfica de calibración obtenida con los marcadores de peso molecular conocido. Análisis de Western blot.- Después del fraccionamiento electroforético por SDS-PAGE, el gel Figura 1.- Análisis electroforético de los extractos de Leishmania mexicana en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, teñido con Azul de Coomassie. Los carriles 2,3 y 4 corresponden a promastigotes lisados directamente en buffer de carga, sonicado total y fracción soluble, respectivamente. El carril 1 corresponde a marcadores de pesos moleculares conocidos, cuyos valores están señalados a la izquierda en kilodaltones. Revista Biomédica para inmunoblotting se transfirió a membrana de nitrocelulosa (0.2 µm) durante 15 horas, a 50 voltios en el cuarto frío, esencialmente de acuerdo con lo descrito (9). Después de la electrotransferencia, la nitrocelulosa se bloqueó con solución de gelatina al 3% en PBS durante dos horas a temperatura ambiente. El resto del procedimiento experimental se realizó esencialmente de acuerdo con lo descrito (10). Brevemente, la membrana de nitrocelulosa se cortó en tiras de 4 mm de ancho y se incubaron separadamente con cada uno de los sueros inmunes durante toda la noche a temperatura ambiente. Se utilizaron diluciones 1:100 de los sueros humanos en la solución de bloqueo. Se lavaron los blots de nitrocelulosa tres veces con solución TBS, a temperatura ambiente durante 10 minutos cada vez. Se incubaron con solución de proteína A conjugada con peroxidasa (SIGMA, USA) a 2 ug/ml durante 3 horas a temperatura ambiente. Finalmente, después de tres ciclos de lavados como en etapa previa, las tiras de nitrocelulosa se revelaron con 4-cloro-1-naftol y peróxido de hidrógeno.

201 Antígenos de Leishmania mexicana. trón de proteínas es similar y por tanto estamos seguros que en nuestras condiciones no hay degradación proteolítica durante la preparación de los extractos parasitarios. En lo sucesivo, todos los extractos de Leishmania mexicana se prepararon por sonicación y a partir del sonicado total se prepararon diferentes fracciones, esto es, fracción soluble, extracto-sds, extracto-triton. En el patrón electroforético de las proteínas de Leishmania mexicana se detectaron 21 componentes, los cuales estuvieron comprendidos en un rango de peso molecular de 200 a 11 kda. Existen también algunos componentes mayores de 200 kda. Los componentes identificados en el rango de interpolación tienen pesos moleculares estimados en daltones como sigue: 117k, 110k, 105k, 93k, 89k, 76k, 63k, 60k, 54k, 49k, 40k, 30k, 27k, 25k, 23k, 22k, 20k, 16k, 14k, 12k y 11k. Predominó el componente de 63kDa cuya banda sobresalió por su intensidad y grosor en todos los extractos analizados de L. mexicana. Por otra parte, se electrotransfirieron estos componentes antigénicos de Leishmania mexicana, previamente separados por SDS-PAGE, a membranas de nitrocelulosa y se analizó la reactividad de 17 sueros inmunes de enfermos con "úlcera del chiclero" contra las proteínas parasitarias inmovilizadas en la nitrocelulosa. Nosotros preparamos originalmente, además del sonicado total del parásito, otras fracciones del extracto antigénico como fracción soluble, extracto-sds y extracto-triton. Esto fue con la idea a priori de que podríamos enriquecer en determinada fracción de los extractos parasitarios los antígenos reconocidos por los sueros inmunes y por tanto, poder revelar éstos en mejores condiciones. Sin embargo, en los experimentos preliminares de Western blot encontramos que no había diferencia significativa en la intensidad de las ban- Figura 2.- Análisis de Western blot de las proteínas de Leishmania mexicana que reaccionan específicamente con los anticuerpos presentes en sueros de pacientes con "úlcera del chiclero" procedentes de la Península de Yucatán. El revelado inmunoenzimático se realizó con el sistema de proteína A conjugada a peroxidasa de rábano y se usaron como sustratos enzimáticos cloronaftol y peróxido de hidrógeno. Carriles A, B, C, D y E: cinco sueros inmunes correspondientes a sendos enfermos con títulos de anticuerpos de 1:320. Carril X 1 : suero humano normal. Los valores señalados a la izquierda corresponden a los pesos moleculares expresados en kilodaltones de los marcadores utilizados. Figura 3.- Análisis de Western blot de las proteínas de Leishmania mexicana que reaccionan específicamente con los anticuerpos presentes en sueros de pacientes con "úlcera del chiclero" procedentes de la Península de Yucatán. Carriles F a Q: doce sueros inmunes correspondientes a sendos enfermos con títulos de anticuerpos de 1:80. Carril X 2 : suero humano normal. Los valores señalados a la izquierda corresponden a los pesos moleculares expresados en kilodaltones de los marcadores utilizados. Vol. 7/No. 4/Octubre-Diciembre, 1996

202 J Pérez-Mutul, G Braga-Cob, T Sosa-Cabrera, J Zavala-Castro. das reveladas, sea que utilizáramos el sonicado total o sea que utilizáramos las diferentes fracciones obtenidas. En lo sucesivo, utilizamos el sonicado total para todos los experimentos de inmunoblotting. En la figura 2 se muestra el análisis de Western blot con cinco sueros humanos inmunes, los cuales tenían el mayor título de anticuerpos (1:320). El revelado inmunoenzimático de estos blots permitió detectar 5 componentes parasitarios, cuyos pesos moleculares estimados en daltones son de 84k, 77k, 63k, 28k y 18k. En la figura 3 se muestra la inmunotransferencia realizada con doce sueros de enfermos con títulos bajos de anticuerpos (1:80). Como se observa, estos sueros no presentaron reactividad significativa, esto es, en nuestras condiciones no fue posible detectar antígenos específicos con estos sueros. DISCUSION. Los inhibidores de proteasas que utilizamos en este estudio fueron adecuados para inhibir la degradación de proteínas de Leishmania mexicana, durante la manipulación experimental que precede al análisis de Western blot. Esto nos permitió obtener patrones electroforéticos reproducibles de las proteínas del parásito y estimar los pesos moleculares de éstas. Entre los componentes parasitarios que detectamos por SDS-PAGE, predominó un componente de 63 kda en todos los extractos analizados de L. mexicana. Esta molécula corresponde al componente más abundante de la membrana del promastigote, ampliamente descrito en la literatura (11; 12; 13). El perfil antigénico de Leishmania mexicana que detectamos en el Western blot con los sueros humanos a títulos altos de anticuerpos consistió en cinco componentes, cuyos pesos moleculares estimados en kda son 84, 77, 63, 28 y 18. De éstos, destacaron por su alta reactividad los componentes antigénicos de 18, 63 y 84 kda, los cuales fueron reconocidos por la mayoría de estos sueros humanos. La revisión extensiva de la literatura a Revista Biomédica este respecto nos mostró los siguientes estudios pero en relación con otras especies de Leishmania. Jaffe y col. (14) demostraron que dos componentes parasitarios específicos, de 5 y 50 kda, son reconocidos por la mayoría de los sueros de pacientes y pueden ser útiles como antígenos diagnósticos en la leishmaniasis cutánea causada por Leishmania major. Marty y col. (15) utilizaron sueros de pacientes con leishmaniasis cutánea y visceral debidas a Leishmania infantum y detectaron por Western blot cuatro antígenos de 18, 21, 23 y 31 kda, cuya presencia simultánea caracteriza la leishmaniasis clínica aguda y pueden por tanto ser útiles en el diagnóstico. Reed y col. (16) establecieron el potencial diagnóstico de una fracción antigénica de 62-63 kda de Leishmania chagasi utilizando sueros de enfermos con leishmaniasis visceral. Mary y col. (17) definieron el potencial de dos antígenos de L. infantum, de 14 y 16 kda, como herramienta valiosa en el diagnóstico y la epidemiología de la leishmaniasis visceral. Bogdan y col. (18) detectaron varios antígenos potencialmente diagnósticos de 65-66, 42, 14 y 12-13 kda de L. major, utilizando análisis de Western blot con sueros de pacientes de leishmaniasis visceral y leishmaniasis cutánea con lesiones múltiples. En relación con los sueros inmunes a títulos bajos de anticuerpos, la sensibilidad del sistema que utilizamos para revelar el Western blot no permitió detectar antígenos específicos con estos sueros. Nuestro sistema de revelado se basó en un solo conjugado y en la enzima peroxidasa. Será necesario en consecuencia incrementar la sensibilidad de detección de la inmunotransferencia. Para ello proponemos utilizar como enzima la fosfatasa alcalina en vez de la peroxidasa, ya que la detección de aquélla es aproximadamente 5-10 veces más sensible que la detección de ésta (16) y utilizar el sistema de triple capa, es decir, un anticuerpo secundario marcado más un anticuerpo terciario marcado, amplificando de esta manera la fuerza de la señal al incrementar el número de moléculas marcadas unidas al antígeno (10).

203 Antígenos de Leishmania mexicana. Por otra parte, se conoce desde hace mucho el problema de reactividad cruzada entre la leishmaniasis y la enfermedad de Chagas (19), lo cual deriva de la utilización de extractos parasitarios crudos en los métodos serológicos convencionales para el diagnóstico de estas parasitosis. El problema más importante de esta reactividad cruzada en muchas áreas de la América Tropical radica en que las zonas endémicas y epidémicas para ambas enfermedades parasitarias frecuentemente se traslapan. Este es el caso de la Península de Yucatán (2, 20, Sosa-Cabrera T, comunicación personal). Recientemente se introdujo el método ELISA como ayuda diagnóstica de la leishmaniasis cutánea en la Península de Yucatán (5). En este estudio el 86% de los sueros de pacientes con enfermedad de Chagas dio reacción positiva, ya que se utilizaron mezclas antigénicas complejas de Leishmania mexicana. Por tanto, el uso de antígenos específicos purificados es la única manera de obtener diagnósticos serológicos inequívocos de estas parasitosis. Nosotros hemos analizado por Western blot el suero de un enfermo de Chagas contra el extracto complejo de Leishmania mexicana (resultado no mostrado). Este suero reconoció varios antígenos de Leishmania, cuyos pesos moleculares son uno de más de 200, 85, 56, 50 y uno de menos de 6 kda. Así, los antígenos de Leishmania mexicana que nosotros demostramos en el presente estudio, que dieron alta reactividad y que fueron reconocidos por la mayoría de los sueros humanos a títulos altos de anticuerpos y cuyos pesos moleculares son de 18, 63 y 84 kda, representan candidatos adecuados para eliminar la reactividad cruzada con los sueros de enfermos de Chagas. Estos antígenos, por tanto, podrán ser purificados y utilizarlos para desarrollar ensayos inmunoenzimáticos más sensibles y más específicos, los cuales serán de gran utilidad en el diagnóstico y la epidemiología de la "úlcera del chiclero" en la Península de Yucatán. Por último, este enfoque recientemente se ha aplicado también a la enfermedad de Chagas (21). Ellos utilizaron inmunoblotting y desarrollaron un método ELISA con un antígeno purificado de Trypanosoma cruzi para el serodiagnóstico diferencial de esta enfermedad con respecto a las leishmaniasis. AGRADECIMIENTOS. Agradecemos al Dr. Oscar Velasco-Castrejón y a la QBP Beatriz Rivas-Sánchez, Departamento de Parasitología, INDRE, México, D.F., su ayuda inconmensurable en la donación y sugerencias para el cultivo de la cepa de Leishmania que se utilizó en el presente estudio. Este trabajo recibió apoyo financiero de la Dirección General de Investigación Científica y Superación Académica, Secretaría de Educación Pública, No. de registro DGICSA- 911315 y Anexo de ejecución No. 91-01-31-001-842. REFERENCIAS. 1.- Seidelin H. Leishmaniasis and Babesiasis in Yucatan. Ann Trop Med Parasitol 1912; 6:295-298. 2.- Andrade-Narvaez FJ, Simmonds-Diaz E, Rico-Aguilar S, et al. Incidence of localized cutaneous leishmaniasis (chiclero s ulcer) in Mexico. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1990; 84:219-220. 3.- Pérez-Mutul J, Balam-Tzeek L, Canto-Lara S. Identificación de protozoarios del género Leishmania con sondas biotinadas de kdna en la Península de Yucatán, México. Rev Biomed 1994; 5:60-69. 4.- Organización Mundial de la Salud. Lucha contra las leishmaniasis. Serie de Informes Técnicos No. 783. 1990. 5.- Garcia-Miss MR, Andrade-Narvaez FJ, Esquivel-Viñas R, Simmonds-Diaz E, Canto-Lara S, Cruz-Ruiz AL. Localized cutaneous leishmaniasis (chiclero s ulcer) in Mexico: sensitivity and specificity of ELISA for IgG antibodies to Leishmania mexicana mexicana. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1990; 84:356-358. 6.- Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989. Vol. 7/No. 4/Octubre-Diciembre, 1996

204 J Pérez-Mutul, G Braga-Cob, T Sosa-Cabrera, J Zavala-Castro. 7.- Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochem 1976; 72:248-254. 8.- Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:680-684. 9.- Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979; 76:4350-4354. 10.- Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory: 1988. 11.- Etges RJ, Bouvier J, Hoffman R, Bordier C. Evidence that the major surface proteins of three Leishmania species are structurally related. Mol Biochem Parasitol 1985; 14:141-149. 12.- Etges RJ, Bouvier J, Bordier C. The major surface protein of Leishmania promastigotes is a protease. J Biol Chem 1986; 261:9098-9101. 13.- Chaudhuri G, Chaudhuri M, Pan A, Chang KP. Surface acid proteinase (gp63) of Leishmania mexicana. J Biol Chem 1989; 264:7483-7489. 14.- Jaffe CL, Shor R, Trau H, Passwell JH. Parasite antigens recognized by patients with cutaneous leishmaniasis. Clin exp Immunol 1990; 80:77-82. 16.- Reed SG, Badaro R, Lloyd RMC. Identification of specific and cross-reactive antigens of Leishmania donovani chagasi by human infection sera. J Immunol 1987; 138:1596-1601. 17.- Mary C, Lamouroux D, Dunan S, Quilici M. Western blot analysis of antibodies to Leishmania infantum antigens: potential of the 14-kD and 16-kD antigens for diagnosis and epidemiologic purposes. Am J Trop Med Hyg 1992; 47:764-771. 18.- Bogdan C, Stosiek N, Fuchs H, Rollinghoff M, Solbach W. Detection of potentially diagnostic leishmanial antigens by western blot analysis of sera from patients with kalaazar or multilesional cutaneous leishmaniasis. J Infect Dis 1990; 162:1417-1418. 19.- Camargo ME, Rebonato C. Cross-reactivity in fluorescence tests for Trypanosoma and Leishmania antibodies. Am J Trop Med Hyg 1969; 18:500-505. 20.- Barrera-Pérez M, Rodríguez-Félix ME, Guzmán-Marín ES, Zavala-Velázquez JE. Prevalencia de la enfermedad de Chagas en el Estado de Yucatán. Rev Biomed 1992; 3:133-139. 21.- Malchiodi EL, Chiaramonte MG, Taranto NJ, Zwirner NW, Margni RA. Cross-reactivity studies and differential serodiagnosis of human infections caused by Trypanosoma cruzi and Leishmania spp.: the use of immunoblotting and ELISA with a purified antigen (Ag 163B6). Clin Exp Immunol 1994; 97:417-423. 15.- Marty P, Lelievre A, Quaranta JF, et al. Detection by western blot of four antigens characterizing acute clinical leishmaniasis due to Leishmania infantum. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1995; 89:690-691. Revista Biomédica