Bioquímica - Electroforesis 1 Historia El término electroforesis se refiere a una técnica separativa que emplea un campo eléctrico aplicado que actúa sobre partículas cargadas causando su movimiento a través de una matriz. El primer aparato sofisticado de electroforesis fue desarrollado por Tiselius en 1937. Su trabajo le valió el premio Nóbel en 1948. Fue Tiselius quien desarrolló el concepto de frente móvil (moving boundary), que más tarde se conoció como electroforesis de zona y se usó para separar proteínas en solución (1). Entre 1940 y 1960 sobrevino un desarrollo de la electroforesis, aplicándose a diversas moléculas, desde proteínas grandes hasta aminoácidos e iones inorgánicos. A la electroforesis de zona se sumaron además el isoelectroenfoque y la isotacoforesis, basadas en diferentes propiedades físicas. Esto permitió realizar análisis separados en una misma muestra o bien realizar combinaciones de métodos. La distinción entre los tres métodos también se da a nivel de las matrices empleadas en cada una, que brindan ventajas comparativas dependiendo de la técnica y de la muestra a separar. Así, se han usado geles de polímeros, papel y capilares. El papel es fácil de usar dado que no es necesaria una preparación previa, pero con el tiempo se ha privilegiado el uso de matrices tipo gel. Smithies en 1955 introdujo el uso de geles de almidón (2), y dos años más tarde Kohn usó acetato de celulosa (3). En 1959 Ornstein y Davis (4) y Raymond y Weintraub (5) usan un gel de poliacrilamida. Los capilares fueron introducidos por Jorgenson y Lukacs (6,7) a principios de los 80. Las técnicas de detección han evolucionado con los años también. Algunas de estas técnicas incluyen el teñido químico, técnicas inmunoelectroforéticas, análisis bidimensional y varias técnicas de inmovilización en membranas. Hoy la electroforesis se aplica principalmente al análisis de muestras biológicas. Es ampliamente usada en análisis de DNA para química forense y en la investigación biológica. 1. Tiselius, A., A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures, Trans. Faraday. Soc., 33, 524, 1937. 2. Smithies, O., Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal human adults, Biochem. J., 61, 629, 1955. 3. Kohn, J., A cellulose acetate supporting medium for zone electrophoresis, Clin. Chim. Acta, 2, 297, 1957. 4. Ornstein, L. and Davis, B. J., Disc Electrophoresis, Distillation Products Industries (Division of Eastman Kodak Co.), 1959. 5. Raymond, S. and Weintraub, L., Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis, Science, 130, 711, 1959. 6. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D. Anal. Chem., 53, 1928, 1981. 7. Jorgenson, J. W. and Lukacs, K. D., Science, 222, 266, 1983. Principio general La electroforesis separa partículas en base al movimiento inducido por un campo eléctrico. El campo eléctrico resulta en la aplicación de una fuerza sobre las partículas que es proporcional a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las distintas macromoléculas. En otras palabras, si se aplica un campo eléctrico durante un período de tiempo dado a través de una matriz que contiene una mezcla de macromoléculas con diferentes potenciales de superficie, las moléculas estarán en diferentes lugares al detener el campo. El estudio del movimiento electroforético se enfoca en el potencial eléctrico en la superficie de la macromolécula, y la relación de ese potencial con la velocidad del objeto en el campo eléctrico. El potencial de superficie está causado por la interacción de la superficie de la molécula con el medio que la rodea. Una separación de carga entre una capa delgada en la superfice de la partícula y otra capa delgada en el medio alrededor de ella resulta de una interfase entre las dos superficies. Esta separación de carga resulta a su vez en una cierta
Bioquímica - Electroforesis 2 densidad de carga en cada capa y en consecuencia en un potencial eléctrico entre capas. El campo eléctrico aplicado a la matriz actúa sobre esta densidad de carga. Así, las moléculas de la muestra y del solvente se moverán en direcciones opuestas debido a las cargas diferentes. Las macromoléculas pueden separarse también en base a la carga. Esto es posible debido a que cuanto más grande sea una molécula mayor será su superficie y también el potencial de superficie (1,2,3). Ambas capas delgadas, la de la macromolécula y la del solvente, son denominadas en conjunto doble capa eléctrica. Usando esta terminología, al aplicar el campo eléctrico las porciones negativa y positiva de la doble capa de separan. Para poder modelar matemáticamente el fenómeno electroforético, es necesario tratar esta doble capa eléctrica como un capacitor. Así, la ecuación para la diferencia de potencial a través de dos placas o capas puede ser expresada como: ζ = 4πed / D (1) La diferencia de potencial entre dos capas es conocida como potencial zeta, de allí el símbolo. d es la distancia entre las placas en cm, e es la carga por cm 2, D es la constante dieléctrica del medio entre los platos. La ecuación para la velocidad de una partícula en un campo eléctrico toma en cuenta el balance entre las fuerzas aplicadas a una partícula por un campo eléctrico y la fuerza de fricción que se opone al movimiento: V = μ E (2) En esta ecuación V es la velocidad, E es igual al campo eléctrico en volts/cm, y μ se representa por la ecuación (3). μ = [(ε ε 0ζ )/η ] f(κ a) (3) En la ecuación (3) ε es la permitividad relativa, ε 0 ζ es la permitividad del espacio libre (8.854 x 10-14 C/(V cm) y η es la viscosidad en g/(cm s). En la función f(κ a), a es el diámetro de partícula en cm y la recíproca de κ (1/ κ) es el espesor de la doble capa. Con esto en mente, f(κ a) es 1 cuando la partícula tiene un diámetro mucho mayor que la doble capa y 1,5 cuando el diámetro de la partícula es muy reducido en comparación con la doble capa. Cuando los diámetros son casi iguales, el comportamiento es complejo (2). En la electroforesis en capilares deben ser tenidos en cuenta otros fenómenos, en especial el flujo electroosmótico. La electroosmósis se da cuando el fluido migra con respecto a la carga inmovilizada, en tanto que la electroforesis se da cuando la partícula migra con respecto al fluido. El flujo electroosmótico generalmente esta minimizado en una matriz de polímero como un gel, pero es significativa en canales abiertos como los capilares. Uno de los problemas más comunes en la electroforesis es la generación de calor debido a la resistencia eléctrica del medio. Los efectos del calentamiento son un factor limitante en las separaciones electroforéticas. Cuanto mayor sea el campo eléctrico aplicado, mayor la resolución. para poder mantener un elevado campo eléctrico, se usan medios resistivos, lo que resulta en la generación de calor. La fórmula para la generación de calor está dada por la ecuación: W = E x I (4) en la cual W es la fuerza en watts e I es la corriente en amperios. La corriente y el campo eléctrico están relacionados por la conductividad del medio según la ley de Ohm E = I/C (5) En esta ecuación C es la conductividad del medio en (W cm) -1. Es decir, cuanto menos conductividad mayor campo eléctrico es necesario. Esto significa que para tener mejor resolución, que se logra con un campo elevado, se necesita menor conductividad.
Bioquímica - Electroforesis 3 1. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley & Sons, 1994, p. 356. 2. Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company, 1995, p. 1041. 3. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A. Tipos de análisis electroforético. Los diferentes tipos de análisis pueden ser distinguidos por las propiedades físicas de la muestra que se van a emplear para su separación o por el tipo de matriz usada. Los cuatro tipos básicos que se fundamentan en diferentes propiedades físicas son: límite móvil (moving boundary), zona, isoelectroenfoque e isotacoforesis. Límite móvil (Moving Boundary) Fue primeramente propuesta por Picton y Linde en 1892, pero fue completamente desarrollada por Tiselius en 1930 (1). En este método la muestra se coloca en una solución buffer en un tubo con forma de U. Se aplica un campo eléctrico por medio de electrodos sumergidos en cada extremo del tubo. Las partículas de la muestra pueden entonces migrar en relación al campo eléctrico. Este método usa solamente la carga de la partícula y el potencial z resultante cuando la muestra se encuentra en contacto con el buffer. La dirección y velocidad de migración está determinada por la movilidad electroforética de cada componente. Una desventaja de este método es que la mayoría de los componentes no se separan limpiamente sino que se superponen. Sólo los componentes más rápidos y los más lentos pueden ser parcialmente purificados. Otra desventaja es que los llamados límites móviles de los componentes de la mezcla no son visibles al ojo humano y se necesita de un buen equipo óptico para la detección. Por esta razón esta técnica ha caído en desuso. Electroforesis de zona Esta es la forma más practicada de electroforesis. Este método es parecido al de límite de movilidad dado que cada componente migra de acuerdo con su propia movilidad. La gran diferencia es que se realiza sobre un medio soporte para lograr la completa separación de cada componente. Otra de las diferencias es que la muestra es aplicada en una banda angosta o zona. En la electroforesis de límite móvil los componentes tienden a mezclarse debido a convección causada por gradientes de densidad o temperatura o por vibraciones mecánicas. A través del uso de soportes estos problemas son minimizados. Los medios más comunes son geles, papel o capilares. En la electroforesis de zona los componentes son aplicados en una banda angosta rodeada por buffer. Se aplica un campo eléctrico y cada banda migra con una velocidad característica determinada por su movilidad electroforética. Cada componente se separa de su vecino para formar una zona pura. Las zonas puras se estabilizan por medio del soporte, que previene el mezclado debido a corrientes de convección. Es un buen método separativo dado que efectivamente aísla los componentes de la mezcla. Combinado con el uso de estándares puede ser tan valioso como algunos tipos de cromatografía. El uso de un soporte poroso con características de filtro permite la separación debido a otra propiedad física, el tamaño. Los medios pueden estar contenidos dentro de un tubo o entre dos placas de vidrio. Los extremos del tubo o de las placas se sumergen en un buffer apropiado y luego se aplica el campo eléctrico para comenzar el proceso separativo. este método da una rápida idea de la cantidad de componentes que tiene una mezcla biológica. Isoelectroenfoque
Bioquímica - Electroforesis 4 El isoelectroenfoque separa componentes usando un gradiente de ph. El gradiente va desde un ph bajo en el ánodo hasta un ph alto en el cátodo. Cuando se aplica un campo eléctrico la muestra migra según su carga hasta que encuentra un ph igual a su punto isoeléctrico, donde la carga neta es 0 y en consecuencia se detiene. Cuando todos los componentes se detienen se llega a un estado estacionario. Se usan geles como soporte, lo que minimiza la difusión una vez que se llega al estado estacionario y el campo eléctrico es eliminado. La clave del método es lograr un buen gradiente de ph. Se utilizan anfolitos cuyos pi rodean el rango de ph deseado, p. ej. de 5 a 7. Se utilizan moléculas anfotéricas sintéticas en mezclas complejas. Estas moléculas migran al aplicarse un campo eléctrico hasta su pi, creando un gradiente de ph. Los anfolitos pueden ser inmovilizados en el gel dando aún mayor resolución al método. el aparato es el mismo que se describiera para electroforesis de zona. el poder resolutivo del método es muy elevado, permitiendo la separación de sustancias que difieran en su pi en 0,001 unidades de ph. Es un método que lleva bastante tiempo, dado que cuanto más se acercan los componentes a su pi más lentamente migran (poseen menos carga). La aplicación de voltajes elevados durante largo tiempo requiere refrigeración Referencias Alan Townshend, ed., Encyclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company, 1995, p. 1041. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of Chemical Technology, 4th ed., John Wiley & Sons, 1994, p. 356. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A.
Bioquímica - Electroforesis 5 Soportes Agarosa Los geles de agarosa diluidos son bastante rígidos y fáciles de manejar. Su tamaño de malla alto hacen que se empleen para separar macromoléculas grandes como proteínas o DNA. Los geles de poliacrilamida sirven para separar ac. nucleicos de 25 a 2000 bp mientras que los geles de agarosa pueden separar fragmentos hasta 10 veces más grandes. Así, se pueden separar DNAs de tamaño desde 1 Kbp a 20 kbp. El agar se aísla de algas rojas del género Rhodophycae y consiste en dos componentes, agarosa y agaropectina. La agarosa es apropiada para electroforesis porque es prácticamente neutra. La cadena se compone de residuos alternantes de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa, con cadenas laterales de 6-metil-D-galactosa. La agarosa adopta una estructura tridimensional de doble hélice cuya cavidad central es suficientemente grande como para acomodar agua (hasta un 99.5%). Estas cadenas forman un gel estable usado como matriz. Al preparar el gel, la agarosa y el buffer se calientan hasta disolver la agarosa. La solución se vuelca en un contenedor hasta que se enfría y se gelifica. Luego de cargada la muestra el gel entero se sumerge en una solución buffer y se aplica un campo eléctrico para realizar la corrida. enfriado En solución Preformado del gel Agarosa gelificada Generalmente se usa agarosa al 0.5% a 2% (p/v). La agarosa es muy fácil de trabajar porque no necesita de un entrecruzante u otros agregados para formar la matriz y es barata. La electroforesis en agarosa se puede combinar con la transferencia de Southern, PCR, y fluorescencia. La introducción de estándares de peso molecular en calles adjuntas a la muestra permite la estimación del tamaño de los ácidos nucleicos separados.
Bioquímica - Electroforesis 6 Armado del gel de agarosa Volcado de la agarosa fundidad Inserción del peine: formación del pocillo donde se siembra la muestra Gel listo para sembrar y correr Esquema de la separación de una mezcla de ADN en un gel de agarosa + Fotografía de una mezcla de ADN separada en un gel de agarosa. A la derecha el tamaño de los marcadores de masa. Polo negativo (ánodo) ADN grande ADN pequeño Polo positivo (cátodo) -
Bioquímica - Electroforesis 7 Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) Estos geles separan la mayoría de proteínas y oligonucleótidos de peso menor a aprox. 200 kda. Están formados por monómeros de acrilamida (CH 2 =CHCONH 2 ) polimerizados en largas cadenas por un reactivo entrecruzante (crosslinker) que mantiene la estructura estable. El más común es la N,N'-metilenbisacrilamida[(CH 2 CHCONH) 2 CH 2 ]. Otros reactivos útiles a este fin son el etilendiacrilato y N,N'-dialiltartardiamida (DATD). El entrecruzamiento del monómero de acrilamida con el comonómero es lo que determina el tamaño de poro de la matriz, a través del ajuste del porcentaje de éste en el gel. La composición del gel puede ser expresada de dos maneras: %T y %T,%C. %T es el porcentaje en peso de monómero total, acrilamida más el entrecruzante. Un gel al 15% tendrá 15% p/v de acrilamida más bisacrilamida. Cuanto mayor el porcentaje, menor el tamaño de poro. %T,%C es una manera de expresar en porcentaje de entrecruzante en relación con el %T. 15%T, 5%Cbis significa que hay un 15% p/v acrilamida más bisacrilamida, y que la bisacrilamida es el 5% del peso total de acrilamida presente. Hay entonces dos maneras de controlar el tamaño de poro, variando %T o %C. Para cualquier %T, un 5% de entrecruzamiento da el menor tamaño de poro. A diferencia de la agarosa, los geles de poliacrilamida requieren aditivos para ayudar a polimerizar el gel. El persulfato de amonio es un iniciador, y el tetrametilendiamina (TEMED) es el catalizador de la reacción. El TEMED causa que el persulfato de amonio produzca radicales libres que a su vez causan la polimerización. La mezcla debería ser desgaseada dado que el O 2 interfiere con la reacción. Cuanto mayor sea el tamaño de poro, menor resistencia al avance encontrarán las moléculas, para un mismo tamaño de poro, entonces, migrarán más rápido aquellas moléculas más pequeñas y/o las más cargadas. es decir, la velocidad de movimiento depende de la relación carga/masa (q/m). El tipo de gel descripto en las figuras anteriores corresponde al tipo discontinuo, en el que existen dos tipos de geles, el de concentración y el de separación. El gel
Bioquímica - Electroforesis 8 de concentración es un gel de malla abierta, que tiene como finalidad concentrar la muestra en una banda angosta antes de que entre en el gel de separación. Así, el ancho de cada banda se mantiene en un mínimo y se optimiza la separación. Los geles de poliacrilamida pueden realizarse en condiciones tales que se conserve la estructura nativa de las proteínas, denominados geles nativos o no desnaturalizantes; o en condiciones desnaturalizantes. en cuyo caso se conoce como geles con SDS o SDS-PAGE, en alusión al detergente usado como agente desnaturalizante, el dodecil sulfato de sodio. Las diferencias son importantes. En un gel no desnaturalizante se puede observar a una proteína migrando con su forma nativa y es importante cuando luego se van a hacer ensayos de actividad en el mismo gel o luego de eluir a la proteína que se ha purificado del gel. En ocasiones este método puede ser usado con fines preparativos cuando no existen otros recursos para purificar la proteína. también se puede estimar la masa nativa de la proteína, pero es un proceso largo y trabajoso que bien puede ser sustituido por técnicas cromatográficas. Por otra parte, no puede usarse a menos que todos las proteínas posean una relación q/m más o menos parecida. En caso de ser necesario usar PAGE, se debe correr la muestra junto a patrones de masa conocida como referencia y esto debe ser hecho a varias concentraciones de poliacrilamida, lo que implica correr otros tantos geles. Luego se grafica el log de Rf de cada estándar contra el porcentaje del gel obteniendo una pendiente para cada proteína de peso conocido. El Rf, o relación de frente, es la relación entre el camino recorrido por la molécula y el frente de solvente o un soluto (normalmente coloreado para una mejor visualización) de muy bajo peso molecular. El tamaño de la proteína se conoce extrapolando el valor obtenido para la pendiente de la misma en el gráfico B.
Bioquímica - Electroforesis 9 200 22 180 Ferritina (pend = -18.6) A 20 18 B 160 16 14 140 12 Log Rf 120 100 Ovotransferrina (pend = -7.2) -Pendiente 10 8 6 80 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Gel (%) 4 0 100 200 300 400 500 600 Masa molec (kda) La electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE) es una de las técnicas más usadas en el laboratorio moderno. El SDS se une a las proteínas a razón de dos moléculas por aminoácido, desplegando la cadena y confiriéndole una carga negativa que aumenta proporcionalmente al largo (peso molecular) de la cadena polipeptídica. de esta manera, la migración depende ya no de la relación q/m sino sólo de la masa, y esta técnica puede así ser usada ventajosamente para determinar tamaños moleculares de polipéptidos. resulta necesario además reducir los puentes disulfuro de las proteínas a fin de lograr el desplegado toral de la cadena. Nuevamente, una vez corrido y teñido el gel se determina la posición en el gel de cada banda de las proteínas estándar, de la muestra en cuestión y se calcula el Rf. Finalmente, se grafica el log del peso molecular versus el Rf de cada estándar y por extrapolación se obtiene el tamaño de la proteína desconocida. Origen 116 97,4 66 48,5 PM estándar Rf 116 0.34 97.4 0.38 66 0.46 48.5 0.56 29 0.69 89 68 110 100 90 80 70 60 50 40 30 29 Frente Bandas desconocidas a 0.40 b 0.47 20 10 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 Electroforesis en papel El papel fue uno de los primeros soportes usados en electroforesis. En contraste con los geles, el papel (p. ej. Whatman 3MM (0.3mm) y Whatman No. 1 (0.17 mm) no requiere preparación. El papel tampoco tiene cargas que interfieran con la separación de las muestras. La muestra se aplica directamente al papel. En cada extremo hay una solución buffer a la que se aplica el campo eléctrico. Se pueden aplicar además moléculas patrón y pigmentos marcadores para controlar la migración de las muestras. Los mejores resultados se obtienen cuando la dirección de movimiento de las muestras es paralela al eje de las fibras del papel. El voltaje aplicado es mayor que en el caso de los geles de acrilamida dado que la resistencia del papel es mayor. una desventaja es que el tamaño de poro no puede ser fácilmente controlado como en el caso de los geles, y la técnica es poco sensible y difícil de reproducir.
Bioquímica - Electroforesis 10 Electroforesis capilar Se emplean tubos capilares de vidrio rellenos con buffer o gel. Los capilares son un medio apropiado ya que poseen una gran relación de superficie a volumen que permite el uso de elevados voltajes sin tanto calentamiento como en el caso de las matrices de gel. Sin embargo, debido al tamaño de los geles existen problemas con la cantidad de muestra a aplicar y los límites de detección. En un capilar de 1 mm de diámetro interno, la capacidad es de 0.03 ml/cm de largo de capilar, y se carga aproximadamente entre 1/100 a 1/1000 de volumen de muestra. Se han diseñado detectores en línea que detectan cantidades muy pequeñas a medida que la muestra va corriendo en el gel. Estos detectores emplean conductividad, efectos de Doppler basados en láser, o lásers que detectan absorbancia o fluorescencia. La completa eliminación de la muestra luego de la corrida es un problema en esta electroforesis. Algunos capilares están recubiertos en su superficie interna y otros están llenos de gel. Debido a su costo, no son descartables y en consecuencia toda la muestra debe ser eliminada del capilar luego de la corrida. Esto puede ser un problema severo en capilares que a veces miden hasta 100 cm de longitud y en los que a veces la muestra puede resultar adsorbida en la superficie interna. El recubrimiento de las superficie con películas especiales ayuda a resolver este problema al aumentar la velocidad de electroosmosis a lo largo de las paredes con lo que el tubo se limpia más fácilmente. La electroforesis capilar se está volviendo una técnica ampliamente usada. Las separaciones son rápidas, se realizan a alto voltaje y requieren una automatización mínima. Esta matriz es ventajosa además porque evita los efectos de calentamiento que pueden ocurrir en geles y porque los datos están en forma de un registro, un perfil en papel en vez de en un gel teñido. En la figura adjunta se muestra esquemáticamente el diseño básico de la electroforesis capilar. La muestra se aplica en un extremo del tubo y la aplicación de voltaje causa la migración de las moléculas, que al ir pasando por un detector envían una señal que se registra en un trazo luego de ser procesada. Análisis del gel Luego de separar una muestra por electroforesis, los compnentes son usualmente invisibles a simple vista. Se requiere entonces el empleo de técnicas de teñido con colorantes o autoradiografía para cuantificar los componentes. también se puede realizar densitometría o transferencia a una membrana. Teñido La tinción de proteínas puede realizarse con diferentes reactivos: negro amido (Amido Black), azul brillante de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue), rojo Ponceau o teñido con plata. El negro amido y el rojo Ponceau interaccionan con proteínas a las que se pueda acceder fácilmente, como aquellas que han sido transferidas a una membrana de nitrocelulosa. El azul de Coomassie y la tinción con plata son ampliamente usados por su reacción con una amplia gama de proteínas y su alta sensibilidad, mucho mayor que el negro amido (5 veces más para
Bioquímica - Electroforesis 11 Coomassie). La tinción con plata es hasta 100 veces más sensible que la tinción de Coomassie, pero es un método más laborioso, requiere cuidados especiales y se usa sólo cuando se requiere un tratamiento especial o la concentración de proteína es muy baja. Luego del teñido, las bandas pueden ser cuantificadas por densitometría. Se digitaliza la imagen del gel o se fotografía y luego se analiza con un densitómetro y se procesan los datos con programas especiales. La autoradiografía es otra técnica que utiliza la densitometría para cuantificar el contenido de proteína o ác. nucleicos. Las muestras radiactivas son corridas en el gel. Luego el gel es secado y puesto en contacto con una película de rayos X. Las bandas radiactivas velan las porciones de película en contacto con ellas y así el patrón de bandas es visible luego del revelado. Transferencia (Blotting) En las transferencias, las proteínas o ác. nucleicos son transferidos a una membrana. La transferencia puede ser realizada mediante la aplicación de un campo eléctrico o por difusión con un buffer. Western blotting. En el caso de proteínas, se usan membranas de nitrocelulosa (NC) o poliviniliden difluoruro (PVDF). La transferencia se hace poniendo en contacto el gel con la membrana y estableciendo luego un campo eléctrico que haga migrar la proteína hacia la membrana. Las proteínas quedan así expuestas en la superficie de la membrana, a la que se adsorben muy fuertemente. De esta manera se puede hacer uso de moléculas grandes para revelar su presencia, como anticuerpos. La membrana se incuba con los anticuerpos y la presencia de estos en lugares específicos de la membrana se revela por diversas técnicas. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos secundarios, que reaccionan con los primarios, y que llevan unidas enzimas o proteínas que Soporte plástico Estructura básica de una transferencia de Western Panel de fibra Papel de filtro Membrana de nitrocelulosa buffer Papel Soporte plástico de filtro Panel de Gel fibra o esponja rígida Armado del sandwich de transferencia nitrocelulosa fibra soporte plástico se utilizan en la detección final (por quimioluminiscencia, fluorescencia o densitometría). Esta técnica permite detectar proteínas presentes en baja cantidad en una muestra compleja. Puede hacerse cuantitativa y de esa manera permite estimar el nivel de esa proteína in vivo.
Bioquímica - Electroforesis 12 Armado final del equipo de transferencia 7 6 - + 8 1. Soporte plástico 2. Membrana 3. Gel 4. Fibra 5. Cuba 6. Electrodos 7. Sandwich armado en su lugar 8. Alambre de platino del ánodo (existe otro en el lado opuesto, no visible en esta figura)
Bioquímica - Electroforesis 13 Western blotting - Revelado Sustrato incoloro -P -P -P -P -P Producto coloreado insoluble Pi Anticuerpo 2 rio Molécula conjugada Anticuerpo 1 rio Proteína Membrana Anticuerpo primario: generado en conejo (IgG) contra la proteína de interés Anticuerpo secundario: generado en cabra contra IgG de conejo Molécula conjugada: fosfatasa alcalina. En el ejemplo mostrado hidroliza un sustrato incoloro fosforilado, que al defosforilarse produce una molécula insoluble coloreada que precipita sobre la membrana en el lugar en que se encuentra la proteína de interés. Podría ser otra enzima que actúe sobre otro tipo de sustrato o directamente podría llevar la señal sobre sí, por ejemplo un compuesto fluorescente. Western blotting Gel de policrilamida con varias bandas de proteína Membrana con las proteínas electrotransferidas y reveladas con un anticuerpo específico contra una de ellas Southern blotting. En la técnica de Southern, la membrana que contiene un ADN transferido se incuba con RNA o DNA complementario al ADN de interés. La técnica de Northern (Northern blotting) es similar excepto que la molécula transferida es RNA. La transferencia se realiza luego de separar la muestra que contiene el DNA por electroforesis, poniendo luego en contacto el gel con la membrana y estableciendo una corriente de buffer a través del gel y hacia la membrana que arrastra al ac. nucleico y lo deposita sobre la membrana.
Bioquímica - Electroforesis 14 Papel de filtro Membrana Gel Membrana transferida Hibridización Autoradiografía Solución alcalina PAGE La detección se realiza por hibridización con un fragmento de DNA complementario, es decir que contiene la secuencia complementaria que le permite establecer interacciones tipo Watson y Crick. Este fragmento llamado sonda puede ser más corto que el DNA a detectar y puede estra marcado de diversas maneras de forma de facilotar la detección. Puede contener nucleótidos marcados radiactivamente, con lo cual será necesario realizar una autoradiografía (en el caso de la figura que se presenta como ejemplo), o poseer otro tipo de marca, como un fluoróforo (grupo fluorescente) o una enzima.
Bioquímica - Electroforesis 15 Enzima o fluoróforo Sonda marcada Membrana DNA transferido Enzima o fluoróforo Sonda marcada DNA transferido Hibridización Membrana Sustrato Producto Luz SEÑAL Fluorescencia Sonda marcada DNA transferido Revelado Membrana