INSTRUCCIONES PARA AISLAMIENTO DE LEUCOCITOS A PARTIR DE SANGRE TOTAL EL PRIMER PASO, ES LEER PRIMERO Y LUEGO SEGUIR TODAS LAS INSTRUCCIONES!!!!! ALFREDO URIBE ARDILA M.SC.
REACTIVOS SOLUCION DEXTRAN-HEPARINA En un balón volumétrico aforado de 25 ml medir: 15 ml de agua destilada-desionizada. 1,25 g de Dextran * (Sigma No. D-5251). 0.175 g de Cloruro de Sodio. Adicionar el volumen correspondiente a 6000 UI de Heparina (Roche Liquemine *). Llevar a volumen final con agua destilada-desionizada. Almacenar a 4ºC. ** * Puede utilizarse otra marca, pero se deben respetar las cantidades. ** El reactivo es estable seis meses a esta temperatura.
1 A un tubo que contenga 2 ml de Dextran-Heparina, se le agregan 10 ml de sangre total recién extraída por punción venosa. Se mezcla suavemente hasta homogenizar la sangre con el reactivo y se deja en una gradilla, para que se produzca la sedimentación gradual de los glóbulos rojos. Si la temperatura del lugar supera los 12 grados centígrados se sugiere que la sedimentación se haga bajo refrigeración con un gel refrigerante bajo la gradilla o dentro de una nevera en el área de refrigeración. Retirar la tapa del tubo durante el proceso.
2 Por efecto del Dextran-Heparina se genera una sedimentación diferencial de los glóbulos rojos, con respecto a los Leucocitos. Los Glóbulos Rojos sedimentan a mayor velocidad dejando en el sobrenadante los Leucocitos. Este proceso se lleva a cabo en los primeros 45 minutos. Observaciones: 15 minutos 30 minutos 45 minutos NO dejar pasar mas del tiempo indicado. No acelerar el proceso con Centrifugación. Evitar al máximo contaminar la muestra con Glóbulos rojos Muestra en proceso de sedimentación
3 Una vez se cumplen los 45 minutos de sedimentación se extrae con la ayuda de una pipeta plástica o pipeta automática el sobrenadante. La pipeta no debe tocar el fondo, que contiene los glóbulos rojos, esto debe evitarse en los posible; sin embargo debe extraerse la mayor cantidad posible del sobrenadante.
4 El sobrenadante que se extrae debe repartirse los mas equitativo posible, en dos tubos que deben ser nuevos y totalmente limpios. El sobrenadante debe extraerse al máximo posible dado que los glóbulos blancos se encuentran suspendidos en esta parte de la muestra. Al final se tiene por cada paciente dos muestras, que constituyen el especímen y un duplicado para confirmación de resultados.
5 Una vez se extrae totalmente el sobrenadante, se deben sellar los tubos con tapas de caucho, que entren forzadas, para evitar fugas. Estas muestras bajo refrigeración son estables alrededor de 24 horas. NO CONGELAR BAJO NINGUNA CIRCUNSTANCIA. Esta muestra tiene la ventaja de ser mas estable que la sangre total, dado que el aislamiento de leucocitos de sangre completa, no pueden hacerse en forma optima después de tres horas de haberse tomado la muestra.
5 Es muy conveniente impregnar una tarjeta, con la muestra, para tener células y papel filtro de cada paciente, sin embargo se debe impregnar la tarjeta con sangre tomada directamente de la jeringa después de la punción. NO IMPREGNE CON LOS ERITROCITOS SOBRANTES DE LA SEDIMENTACION, ESTA MUESTRA ESTA PRACTICAMENTE SIN CELULAS BLANCAS Y NO ES DE UTILIDAD PARA EL ANALISIS DE ENZIMAS LISOSOMALES.
Algunos comentarios.. Si tiene la muestra aislada y va a viajar inmediatamente, colóquela en una caja de Icopor con un Gel refrigerante. La estabilidad es de 24 horas. Si va a enviar la muestra colóquela en la caja de Icopor, teniendo la precaución de fijarla con cinta de enmascarar a la pared de la caja, limite el movimiento del Gel de la misma manera y selle muy bien la caja. Si son varias muestras rotúlelas con nombres y apellidos completos del paciente, edad y sexo. Asegúrese con el servicio de Aeromensajería, que la muestra sea traída en un termino no superior a 20 horas al Laboratorio.
GRACIAS POR SEGUIR LAS INSTRUCCIONES!!!!! BIBLIOGRAFIA. KAMPINE JP, BRADY R. JKAUFER JN. FELD M. SHAPIRA D. Diagnosis of Gaucher's disease and Nieman-Pick's disease with small samples of venous blood. Science 1966.155.86. SHAPIRA E, Blitzer MG Miller JB, Africk DK. Biochemical Genetics. A laboratory manual. Oxford University Press. New York, 1989.