Recuperación e identificación de variedades antiguas prospectadas en viñedos de Navarra

Recuperación e identificación de variedades antiguas prospectadas en viñedos de Navarra J. Urrestarazu*, C. Miranda, L.G. Santesteban y J.B. Royo. Departamento de Producción Agraria, Universidad Pública de Navarra. Campus de Arrosadía, 31006, Pamplona. *E-mail: jorge.urrestarazu@unavarra.es Resumen La reconstitución del viñedo navarro tras la crisis filoxérica fue llevada a cabo casi exclusivamente con la variedad Garnacha y por tanto, en las parcelas más antiguas de esa variedad es donde todavía es posible recuperar otras que se cultivaban hasta el siglo pasado en la región, dado que entonces era habitual mezclar en una pequeña proporción variedades tradicionales de la zona junto con la principal. En el año 2008 se realizó una prospección en la mayor parte de los viñedos navarros de más de 50 años con el objetivo principal de recuperar la diversidad intravarietal de Garnacha que aún existe en la región y, paralelamente, encontrar también cepas de otras variedades diferentes que convivían con ésta en aquella época. En conjunto se han recogido casi 4.000 plantas de las que, al menos 197 muestran un fenotipo diferente al de Garnacha. El objetivo de este estudio fue determinar la identidad varietal de estas 197 plantas. Mediante el uso de 25 microsatélites se detectaron 33 genotipos únicos, y tras comparar sus perfiles alélicos con los incluidos en distintas bases de datos nacionales e internacionales, fueron identificadas 28 variedades. Además, se apreció la existencia de dos tipos de variación intravarietal: i) ligeras variaciones en la longitud de algún alelo entre algunas plantas identificadas como Mazuelo, Rojal o Miguel de Arco ; y ii) aparición de tres alelos en algunas plantas identificadas como Viura, Mandón, Mazuelo, Morate y Castellana Blanca. En conjunto se ha puesto de manifiesto el interés de este tipo de prospecciones de cara a mantener la biodiversidad que todavía se conserva en los viñedos actuales. Palabras clave: identidad, Vitis vinifera L., vid, microsatélites, SSR, mutación somática. INTRODUCCIÓN La reconstitución del viñedo navarro tras la crisis filoxérica fue llevada a cabo casi exclusivamente con la variedad Garnacha. La expansión de dicha variedad en la región ya había comenzado desde mediados del siglo XIX durante la crisis del oídio, ya que dicha variedad mostró ser una de las más resistentes a este patógeno (Huetz de Lemps, 1993). Por ello, los viñedos más antiguos que aún pueden encontrarse en Navarra corresponden a la variedad Garnacha, y es por tanto en estos viñedos donde es más probable encontrar variedades que se cultivaban en la región durante el siglo pasado, ya que la inclusión de plantas de variedades diferentes a la principal era una práctica relativamente frecuente en el pasado. Durante las últimas décadas, en Navarra, al igual que en otras regiones españolas, se están arrancando las plantaciones más antiguas y están siendo reemplazadas por variedades ampliamente conocidas, muchas de ellas de origen foráneo. Como consecuencia de ello, se está produciendo una pérdida importante de variedades tradicionales presentes en los viñedos más viejos. En este contexto, en el año 2008 se realizó una prospección en la mayor parte de los viñedos navarros de más de 50 41

años con el objetivo principal de recuperar la diversidad intravarietal de Garnacha que aún existe en la región y, paralelamente, encontrar también cepas de otras variedades diferentes que convivían con ésta en aquella época. En conjunto se han recogido casi 4.000 plantas de las que, al menos 197 muestran un fenotipo diferente al de Garnacha. El objetivo de este estudio fue conocer la identidad varietal de estas 197 plantas que se cultivaban en los viñedos más antiguos de Navarra junto a Garnacha. MATERIAL Y MÉTODOS Se aisló el ADN de las 197 plantas a partir de hojas jóvenes mediante el kit de extracción Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen) y se analizaron 25 SSR distribuidos en los 19 grupos de ligamiento de la vid (Doligez et al., 2006) a través de tres PCR múltiples siguiendo los protocolos descritos en Ibáñez et al. (2009). La identidad varietal de las plantas prospectadas fue determinada comparando los perfiles de SSR obtenidos con los perfiles únicos incluidos en la base de datos española de variedades de vid (www.sivvem.monbyte.com), en la base de datos europea de vid (www.eu-vitis.de) y el catálogo internacional de variedades de vid (www.vivc.de). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Entre las 197 plantas analizadas se detectaron 33 genotipos únicos, que permitieron identificar 28 variedades (Tabla 1), de las que Viura y Tempranillo, en proporción similar representaban el 35% del material prospectado. La frecuencia del resto de variedades era significativamente menor. En la Memoria del Congreso Nacional de Viticultura celebrado el año 1912, se recoge la ponencia de García de los Salmones (1914) en la que se muestra el abanico varietal propio de cada región en la época prefiloxérica y de acuerdo con dicho autor, las variedades detectadas en nuestro estudio se podrían diferenciar en los siguientes grupos: i) Variedades cultivadas en Navarra: Graciano, Mazuelo, Miguel de Arco, Morate, Rojal, Moscatel de Grano Menudo, Tempranillo y Viura. ii) Variedades cultivadas en regiones limítrofes con Navarra: Alarije, Benedicto, Jaén, Garnacha Tintorera, Garnacho, Moristel, Moscatel Negro, Tinto Velasco y Vidadillo. iii) Variedades cultivadas en zonas alejadas de Navarra: Airén, Castellana Blanca, Mandón, Palomino, Parellada, Tinto de Navalcarnero y Verdejo. iv) Variedades no citadas en la Ponencia: Ambrosina, Chardonnay Muscat of Alexandria y Muscat Hamburg. En prospecciones recientes llevadas a cabo en Aragón (Buhner-Zaharieva et al., 2010; Casanova et al., 2011) se han encontrado una gran parte de las variedades anteriormente mencionadas. Es de destacar, que entre los viñedos más antiguos de Navarra se haya encontrado una planta de la variedad Chardonnay, aunque quizá no sea tan raro si se tiene en cuenta la proximidad y las relaciones históricas entre Navarra y Francia. Finalmente también son de destacar las 21 plantas que se agrupan en cinco genotipos, que no se han podido encontrar en ninguna de las bases de datos consultadas, y que muy probablemente correspondan a variedades muy marginales en riesgo de desaparición. 42

A pesar de que los marcadores SSR del tipo que habitualmente se emplean con fines de identificación varietal no permiten normalmente la detección de variabilidad intravarietal, debido a la escasa cobertura del genoma que ofrecen, en ocasiones han permitido la discriminación de clones de algunas variedades. En este estudio, los perfiles SSR de 14 de las 197 plantas estudiadas podrían sugerir la existencia de dos tipos de variaciones somáticas: denominamos Tipo 1 a diferencias de tamaño de algún alelo en relación a los alelos considerados como referencia para una variedad específica, y Tipo 2 a la aparición de tres alelos en algunos loci. Los análisis moleculares de las plantas que exhibieron perfiles de SSR ligeramente diferentes a lo esperado se repitieron partiendo de nuevas extracciones de ADN, y en todos los casos se confirmaron las variaciones detectadas en los primeros análisis. Las variaciones somáticas de Tipo 1 fueron detectadas para los loci VVMD32 en Miguel de Arco (1 planta) y No identificada 1 (1 planta), VVIp60 en Rojal (1 planta) y Mazuelo (1 planta) y VVIv67 en una segunda planta de Mazuelo. En todos los casos el tamaño de la variante alélica detectada fue de un incremento de 2pb respecto al alelo de referencia más cercano para el locus y variedad considerada. Estas diferencias menores podrían ser atribuibles a la adición de una unidad del motivo de repetición del SSR posiblemente generada por el deslizamiento de la ADN polimerasa durante la replicación (Eisen, 1999; Schlötterer y Tautz, 1992). La primera vez que se describió este fenómeno fue entre dos variedades sinónimas de Corinto negro (Ibáñez et al., 2000). Ligeras diferencias de 2pb han sido descritas posteriormente entre clones de Chardonnay, Greco di Tufo, Muscat d Alsace, Pinot Noir, Pinot Meunier o Primitivo (Riaz et al., 2002; Franks et al., 2002; Crespan, 2004; Moncada et al., 2006). Además, otras nueve plantas presentaron el mismo perfil molecular de plantas identificadas como Viura, Mandón, Morate, Mazuelo y Castellana Blanca para todos los SSR analizados excepto para uno (en una planta para dos SSR), en las que se detectó claramente la presencia de un tercer alelo (variaciones somáticas de Tipo 2 ). Cuatro plantas mostraron idéntico perfil que Viura salvo por la aparición en tres plantas de un mismo tercer alelo en VVMD28, y en la cuarta el alelo adicional se observó en VVIp31. Con respecto a las otras variedades, dos plantas mostraron el mismo perfil de SSR de Castellana Blanca exceptuando la presencia de un tercer alelo en VMC4f3.1, mientras que en una planta de Morate y otra de Mandón el tercer alelo se observó en VVIp31 y VVMD25, respectivamente. Por último, en una planta de Mazuelo se observaron tres alelos claros en los loci VVMD28 y VVIp60. Este fenómeno es relativamente frecuente en vid, y ha sido previamente descrito en algunas variedades, tales como Primitivo (Franks et al., 2002), Cabernet Sauvignon (Moncada et al., 2006), Chardonnay (Bertsch et al., 2005), Merlot (Vélez e Ibáñez, 2012) o Cabernet Franc y Riesling (Pelsy et al., 2010). En la vid, el meristemo apical está formado por dos capas de células (L1 y L2), por lo que la presencia de tres alelos en un mismo locus podría asociarse a la presencia de estructuras quiméricas (Pelsy, 2010). Al extraer ADN, el genotipo resultante es una mezcla de las capas L1 y L2, por lo que la explicación más factible de la aparición de más de dos alelos por locus es que uno de ellos haya mutado en una de las dos capas celulares (Vélez, 2007). CONCLUSIONES En conjunto se ha confirmado que los viñedos más antiguos de la región aún siguen siendo un reservorio importante de diversidad, lo que prueba el interés de este tipo 43

de prospecciones de cara a mantener la riqueza varietal que todavía existe. Por otra parte, se ha puesto de manifiesto que la aparición de ligeras variaciones intravarietales detectadas en los perfiles de SSR ocurre con relativa frecuencia en esta especie, especialmente en el caso de variedades antiguas donde la probabilidad de que las mutaciones somáticas se acumulen y fijen son más altas. Agradecimientos Este trabajo ha sido financiado por el Dpto. Industria del Gobierno de Navarra (proyecto IIM12818.RI.1) y por el Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (proyecto RF2012-00027-C05-02). Los autores desean agradecer su colaboración en las labores de prospección y propagación a Rafael García (Vitis Navarra Selección S.L.), así como a Javier Ibáñez y Silvia Hernáiz (ICVV) la información facilitada sobre las PCR múltiples utilizadas en este estudio. Referencias Bertsch, C., Kieffer, F., Maillot, P., Farine, S., Butterlin, G., Merdinoglu, D., Walter, B. (2005). Genetic chimerism of Vitis vinifera cv. Chardonnay 96 is maintained through organogenesis but not somatic embryogenesis. BMC Plant Biology, 5, 20. Buhner-Zaharieva, T., Moussaoui, S., Lorente, M., Andreu, J., Núñez, R., Ortiz, J.M. and Gogorcena, Y. (2010). Preservation and molecular characterization of ancient varieties in Spanish grapevine germplasm collections. American Journal of Enology and Viticulture, 61, 557-562. Casanova, J., Mozas, P. and Ortiz, J.M. (2011). Ampelography and microsatellite DNA analysis of autochthonous and endangered grapevine cultivars in the province of Huesca (Spain). Spanish Journal of Agricultural Research, 9, 790-800. Crespan, M. (2004). Evidence on the evolution of polymorphism of microsatellite markers in varieties of Vitis vinifera L. Theoretical and Applied Genetics, 108, 231-237. Doligez, A., Adam-Blondon, A.F., Cipriani, G. (2006). An integrated SSR map of grapevine based on five mapping populations. Theoretical and Applied Genetics, 113,369-382. Eisen, J.A. (1999). Mechanistic basis for microsatellite instability. En: Goldstein D.B., Schlötterer C. (eds) Microsatellites: evolution and applications. Oxford University Press, Oxford, pp 34-48. Franks, T., Botta R., Thomas, M.R. (2002). Chimerism in grapevines: implications for cultivar identity, ancestry and genetic improvement. Theoretical and Applied Genetics, 104, 192-199. García de los Salmones, N. (1914). Memoria General del Congreso Nacional de Viticultura de Pamplona. Huetz de Lemps, A. (1993). Vignobles et vins d Espagne. Presses Universitaires de Bordeaux. 44

Ibáñez J, de Andrés M.T., Borrego, J. (2000) Allelic variation observed at one microsatellite locus between the two synonym grape cultivars Black Currant and Mavri Corinthiaki. Vitis, 39, 173-174. Ibáñez, J., Vargas, A.M., Palancar, M., Borrego, J. and de Andrés, M.T. (2009). Genetic relationships among table-grape varieties. American Journal of Enology and Viticulture, 60, 35-42. Moncada, X., Pelsy, F., Merdinoglu, D., Hinrichsen, P. (2006). Genetic diversity and geographical dispersal in grapevine clones revealed by microsatellite markers. Genome, 49, 1459-1472. Pelsy, F. (2010). Molecular and cellular mechanisms of diversity within grapevine varieties. Heredity, 104, 331-340. Pelsy, F., Hocquigny, S., Moncada, X., Barbeau, G., Forget, D., Hinrichsen, P., Merdinoglu, D. (2010). An extensive study of the genetic diversity within seven French wine grape variety collections. Theor Appl Gene Theoretical and Applied Genetics, 120, 1219-1231. Riaz, S., Garrison, K.E., Dangl, G.S., Boursiquot, J.M., Meredith, C.P. (2002). Genetic divergence and chimerism within ancient asexually propagated winegrape cultivars. Journal of the American Society for Horticultural Sciences, 127, 508-514. Schlötterer, C., Tautz, D. (1992). Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Research, 20, 211-215. Vélez, M.D. (2007). Estudio de un sistema de marcadores microsatélites para la protección y defensa legal de variedades de vid (Vitis vinifera L.). Tesis Doctoral, Universidad de Alcalá. Vélez, M.D., Ibáñez, J. (2012). Assessment of the uniformity and stability of grapevine cultivars using a set of microsatellite markers. Euphytica, 186, 419-432. 45

Tabla 1. Lista de genotipos y variedades identificadas. Número de plantas Variedades Nº total Con perfil de SSR normal Con perfil atípico Tipo 1 - Tipo 2 Viura 36 32 4 Tempranillo 34 34 Vidadillo 17 17 No identificada 2 10 10 Alarije 8 8 Mandón 8 7 1 Moscatel de Grano Menudo 8 8 Miguel de Arco 7 6 1 Jaén* 6 6 Mazuelo 6 3 2 1 No identificada 1 6 5 1 Ambrosina 5 5 Morate 5 4 1 Parellada 5 5 Castellana Blanca 4 2 2 Muscat Hamburg 4 4 Moristel 3 3 Rojal 3 2 1 Tinto de Navalcarnero 3 3 Benedicto 2 2 Muscat of Alexandria 2 2 No identificada 3 2 2 No identificada 4 2 2 Tinto Velasco 2 2 Airén 1 1 Chardonnay 1 1 Garnacha Tintorera 1 1 Garnacho** 1 1 Graciano 1 1 Moscatel Negro 1 1 No identificada 5 1 1 Palomino 1 1 Verdejo 1 1 Total 197 183 5 9 En caso de sinonimias, se ha incluido la denominación recogida en la ponencia de García de los Salmones (1914); * Prime name: Cayetana Blanca; ** Prime name: Morrastel-Bouschet. 46