REV CUBANA MED TROP 1997;49(2):108-12 INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL "PEDRO KOURÍ" ELISA de inhibición. Su utilidad para clasificar un caso de dengue Lic. Susana Vázquez, 1 Dr. José R. Bravo, 2 Dra. Ana Beatriz Pérez 3 y Dra. María Guadalupe Guzmán 4 1. Doctora en Ciencias Médicas. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar. Profesora Titular. 2. Especialista de II Grado en Bioestadística. Investigador Auxiliar. 3. Especialista de I Grado en Inmunología. 4. Doctora en Ciencias Médicas. Investigadora y Profesora Titular. RESUMEN Para la clasificación de casos de dengue la OMS/OPS incluye a la inhibición de la hemaglutinación como una de las técnicas serológicas para esos fines y se acepta también la posibilidad de utilizar el ELISA con un título equivalente al establecido por la IH. En este trabajo se presenta la utilidad del ELISA de inhibición para la clasificación de caso probable, confirmado y tipo de infección (primaria y secundaria) de dengue. DeCS: TEST DE ELISA/métodos; TESTS DE INHIBICION DE HEMAGLUTINACION/métodos; DENGUE/diagnóstico; ANTICUERPOS VIRALES; VIRUS DEL DENGUE/inmunología. El dengue clásico, con sus formas más severas, la fiebre hemorrágica del dengue (FHD) y el síndrome de choque por dengue (SCD), es un problema de salud actual en el mundo tropical y subtropical. 1 Esta enfermedad es producida por cualquiera de los 4 serotipos del virus dengue. En el virión de estos agentes, el ARN está cubierto por la proteína de la cápside, mientras que las otras 2 proteínas, M y E, están ancladas en una bicapa lipídica de origen celular y forman la envoltura. 2 La proteína de la envoltura (E) presenta antígenos específicos de tipo, complejo y grupo, los cuales inducen la formación de anticuerpos de igual especificidad detectados mediante las técnicas de inhibición de la hemaglutinación (IH) y ELISA. 3 La existencia de varios serotipos pueden llevar a la aparición de infecciones de tipo primaria y secundaria, caracterizada esta última por el desarrollo de niveles elevados de inmunoglobulinas totales a este virus, tanto durante la fase aguda como la convaleciente de la enfermedad. 4 En los programas de prevención y control del dengue que actualmente se ejecutan en los países de nuestra región, la vigilancia serológica constituye un pilar fundamental y se basa principalmente en el diagnóstico de casos probables mediante la detección de anticuerpos IgM a dengue por un ELISA de captura. No menor importancia tienen la confirmación serológica de casos sospechosos y la definición del tipo de infección que padecen (primaria o secundaria). 5 Se han establecido diferentes criterios para clasificar un caso clínicamente sospechoso como probable o confirmado de la enfermedad, y si una infección por dengue en un individuo es de tipo primaria o secundaria 5 mediante métodos serológicos como la IH o el ELISA de inmunoglobulinas totales. Teniendo en cuenta que la FHD/SCD se ha observado principalmente en aquellos individuos que sufren una infección de tipo secundaria la cual puede inducir un fenómeno de inmunoamplificación viral, 6 es de gran importancia definir el tipo de infección que padece un paciente.
Nuestro laboratorio ha desarrollado un inmunoensayo enzimático sobre el principio de inhibición, que se denominó método ELISA de inhibición (MEI), 7,8 el cual ha sido ampliamente utilizado en la vigilancia seroepidemiológica que se estableció en nuestro país con posterioridad a la epidemia de FHD de 1981. 9 El propósito del presente estudio es establecer los criterios de caso probable y confirmado, y de tipo de infección (primaria o secundaria), para clasificar un caso clínicamente sospechoso de dengue con el MEI como método serológico. MÉTODOS Muestras. Se emplearon 2 grupos de muestras. El grupo I estuvo constituido por un total de 182 sueros, de ellos 170 (100 monosueros y 35 pares de suero) procedían de pacientes que fueron diagnosticados como clínicamente sospechosos de dengue durante la epidemia de esta enfermedad de Nicaragua en 1985, y 12 eran monosueros del personal del laboratorio en los que se conocían sus antecedentes de haber padecido o no dengue en la epidemia cubana de 1981. Los sueros procedentes de Nicaragua se estudiaron con la finalidad de establecer los criterios por ELISA tanto en pares como en monosueros, y los del personal de laboratorio se utilizaron como criterio de presencia de anticuerpos en infección pasada. El grupo II estaba constituido por 73 monosueros de individuos que enfermaron con un cuadro clínico compatible de dengue durante la epidemia de dengue 3 de Nicaragua en 1994. Inhibición de la hemaglutinación. A cada suero se le determinó el título de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación (Acs IH) mediante la técnica de IH según el método descrito por Clark y Casals adaptado a microtécnica. 10 La cepa Nueva Guinea C del serotipo 2 fue utilizada como antígeno previa extracción con sacarosa acetona e inactivación con beta propiolactona. 10 Todos los sueros fueron trabajados en diluciones al doble desde 1/20 y hasta título final. La mayor dilución del suero donde se observó un patrón de inhibición total de la hemaglutinación fue considerada como su título de Acs IH. Se definió como caso probable de dengue o dengue hemorrágico a aquel paciente en cuyo suero se observaron títulos de Acs IH mayores o iguales que 1 280 (títulos éstos de Acs no observados en los individuos sanos) cuando se trabaja un monosuero. Títulos de Acs IH mayores o iguales a 2 560 son indicativos de una infección de tipo secundaria. En pares de suero una seroconversión o aumento de 4 veces el título del segundo suero con respecto al primero es considerado un caso confirmado. 5 ELISA de inhibición (MEI). Para la determinación del título de inmunoglobulinas totales a dengue se utilizó el método de ELISA de inhibición (MEI). 7,8 Fueron sensibilizadas placas de poliestireno con Igs humanas anti-dengue a una concentración de 10 mg/ml en solución tamponada de carbonato/bicarbonato ph 9,5. Después de 18 h de incubación a 4 C, se bloqueó con albúmina bovina al 1 % durante 1 h, posteriormente se adicionó el antígeno (similar al utilizado en la IH) a una dilución 1/40 en buffer fosfato-salina ph 7,2. Después de una incubación de 1 h los sueros en estudio fueron agregados, en diluciones al doble y se incubaron durante 1 h. Finalmente se añadió el conjugado antidengue-peroxidasa y se desarrolló la reacción con ortofenilendiamina (OPD) y peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ) como sustrato. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico. Las lecturas se realizaron en un lector de ELISA Titertek Multiskan a 492 nm. Entre cada paso se realizaron los lavados correspondientes. Las incubaciones se realizaron a 37 C. En todas las pruebas se incluyeron controles positivos y negativos. Todos los sueros fueron trabajados a título final. Se consideró como el título de anticuerpos de un suero la mayor dilución en la que se observa un porcentaje de inhibición mayor o igual al 50 %, lo cual viene relacionada con la DO de la media de los negativos entre 2. Se consideró como criterio de validez de la prueba una relación ± de los controles mayor o igual a 5. Análisis estadístico. Para el análisis estadístico de los resultados se empleó el coeficiente de correlación de Pearson previa transformación logarítmica de los datos.
RESULTADOS Se determinaron los títulos de Acs a dengue mediante las técnicas IH, y MEI en 182 sueros de individuos con antecedentes de haber sufrido la enfermedad. A los títulos de anticuerpos obtenidos en ambas técnicas, se les realizó una transformación logarítmica y se calculó el coeficiente de correlación, se obtuvieron una r= 0,93 (p < 0,001) y una r 2 = 0,86; lo que indica una buena correlación. Posteriormente se realizó una regresión lineal simple y se determinaron los valores esperados por MEI que corresponden a los diferentes valores por IH, teniendo en cuenta los criterios antes mencionados. Los resultados obtenidos mostraron que para un título por IH de 1 280 el título esperado por MEI es de 5 120 y para un título por IH de 2 560 el título esperado por MEI es de 10 240. Estos resultados permitieron establecer los criterios de caso probable y el tipo de infección secundaria cuando se utilizan monosueros, se definieron como: Caso probable: aquel paciente cuyo suero presente un título de Acs mayor o igual a 5 120. Caso de infección secundaria: aquel paciente cuyo suero presente un título de Acs, mayor o igual a 10 240. El criterio de confirmado es equivalente al ya establecido para la IH en pares de sueros, se definieron como: Caso confirmado: aquel paciente que presente seroconversión o elevación de 4 veces el título de Acs entre los 2 sueros. Caso de infección primaria: aquel paciente cuyo segundo suero presente un título de Acs, menor o igual a 5 120. Aplicando los resultados anteriormente presentados se estudió un grupo de 73 monosueros por MEI. Estos sueros procedían de pacientes de dengue diagnosticados clínicamente como sospechosos de esta entidad durante la epidemia de dengue 3 de Nicaragua en 1994. Todos los sueros fueron titulados y analizados de forma individual, con la aplicación del criterio de caso probable y de infección secundaria para monosueros. Una vez obtenidos estos resultados, los sueros fueron trabajados por IH y fueron comparados los resultados obtenidos en ambas técnicas. En la tabla se muestran los resultados obtenidos. Los sueros fueron clasificados como en positivos o negativos (de acuerdo con la presencia o no de Acs). Los positivos a su vez fueron clasificados como casos probables y casos secundarios de acuerdo con el título de Acs. TABLA. Clasificación de 73 sueros por IH y MEI mediante los criterios previamente establecidos Positivo Negativo Caso probable Caso secundario MEI 59 14 28 23 IH 56 17 27 24 Como se puede observar, 3 casos resultaron positivos por MEI y negativos por IH. En relación con los criterios, sólo 1 caso que se clasificó como probable por MEI no lo fue por IH y 1 caso que era secundario por IH no lo fue por MEI. DISCUSIÓN Se estima que aproximadamente 80 millones de personas de áreas tropicales son afectadas anualmente por el dengue. 1 El dengue hemorrágico, descrito como enfermedad endemoepidémica en el sureste asiático entre los años 1950 y 1960, se ha convertido en un serio problema de salud en las Américas. 11
Teniendo en cuenta esta situación, se hace necesario contar con métodos rápidos y efectivos para el diagnóstico de la enfermedad. Aunque la IH ha sido durante años la prueba convencionalmente utilizada por la Organización Mundial de la Salud para el diagnóstico y clasificación de las respuestas serológicas en las infecciones por dengue, ésta es lenta y engorrosa. En las Guías para la Prevención y Control del Dengue y el Dengue Hemorrágico en las Américas 5 se establece la necesidad de desarrollar sistemas de vigilancia efectivos basados en aspectos clínicos, epidemiológicos, serológicos y entomológicos, entre otros. En este documento, en cuya preparación participaron expertos de nuestros países y del sureste asiático, se establecen los criterios de caso confirmado y caso probable de dengue y dengue hemorrágico, así como de casos de infección primaria o secundaria. Para definir cada uno de estos aspectos es fundamental contar con algún criterio de laboratorio, dentro de los que se destaca la serología por ser el método más utilizado en la vigilancia epidemiológica. El MEI 7,8 ha sido ampliamente utilizado por el Laboratorio de Arbovirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) desde el año 1989 para el diagnóstico serológico del dengue con el uso de pares de sueros. Además, ha sido aplicado en estudios seroepidemiológicos con monosueros para definir la prevalencia de anticuerpos a dengue en una región o país. Los sistemas inmunoenzimáticos han sido ampliamente utilizados en el diagnóstico del dengue tanto para la detección de anticuerpos IgM como inmunoglobulinas totales. 12,13 Chungue y otros 14 demostraron una elevada sensibilidad, especificidad y coincidencia entre el ELISA y la IH, para la detección de anticuerpos a dengue. Aún más, Dittmar y otros 15 observaron una adecuada correlación entre los títulos de anticuerpos a dengue medidos mediante el IH y el ELISA, se demostró que los valores de absorbancia en el ELISA aumentan a medida que aumentan los títulos de anticuerpos IH a dengue. Considerando la utilidad del ELISA para el diagnóstico del dengue unido a las ventajas propias de los sistemas inmunoenzimáticos (rapidez, facilidad de ejecución y la no necesidad de tratamiento de los sueros) decidimos estudiar la utilidad del MEI para la clasificación de casos, ya fuera a través del estudio de monosueros como de sueros pareados. Los coeficientes de correlación obtenidos al comparar los títulos de anticuerpos mediante ambas técnicas así como la elevada coincidencia entre el MEI y la IH al aplicar los criterios previamente definidos en nuestro estudio, demostraron la utilidad de este sistema en la clasificación serológica de los casos. Solamente 3 casos resultaron positivos por MEI y negativos por IH, lo cual pudiera deberse a la sensibilidad del ELISA sobre la IH reportada por otros autores, 14 la discrepancia en cuanto a caso probable y secundario de 2 sueros pudo deberse a pequeñas diferencias entre ambas técnicas. Los resultados permiten recomendar el MEI como otro sistema posible a utilizar en la clasificación serológica de los casos clínicamente sospechosos de dengue. SUMMARY For the classification of dengue cases the WHO/PAHO includes the hemagglutination inhibition test as one of the serological techniques used to this end and it is also accepted the possibility of using the ELISA with a titer equivalent to that established by the IH. In this paper, it is explained the usefulness of the inhibition ELISA for the classification of a probable case, a confirmed case, and type of dengue infection (primary or secondary). Subject headings: ENZYMELINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods; HEMAGGLUTINATION INHIBITION TEST/methods; DENGUE/diagnosis; ANTIBODIES, VIRAL; DENGUE VIRUS/immunology.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Monath TP. Yellow fever and dengue. The interactions of virus, vector and host in the reemergence of epidemic disease. Sem Virol 1994;5:133-45. 2. Monath TP. Flavivirus. En: Fields BN, Knife DM, eds. Virology. New York: Raven, 1990:763-814. 3. Henchal EA, Putnak JR. The dengue viruses. Clin Microbiol Rev 1990;3:376-96. 4. Halstead SB. Pathogenesis of dengue: Challenge to molecular biology. Science 1988;239:476-81. 5. Pan American Health Organization. Dengue and Dengue hemorrhagic fever in the Americas: Guidelines for prevention and control. Washington, 1994:3-217(Scientific Publication, No. 548). 6. Kurane I, Ennis E. Immunity and immunopathology in dengue virus infections. Sem Immunol 1992;4:121-7. 7. Vázquez S, Fernández R. Utilización de un método de inhibición de ELISA en el diagnóstico serológico del dengue: reporte preliminar. Rev Cubana Med Trop 1989;41:18-26. 8. Fernández R, Vázquez S. Serological diagnosis of dengue by an ELISA inhibition Method (EIM). Men Inst Oswaldo Cruz 1990;85:347-51. 9. Kourí G, Guzmán MG, Bravo J. Hemorrhagic dengue in Cuba: history of an epidemic. Bull Pan Am Health Organ 1986;20:24-30. 10. Clarke DH, Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod borne virus. Am J Trop Med Hyg 1958;7:561-73. 11. Gubler D, Trent DW. Emergence of epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health problem in the Americas. Infect Agents Dis 1994;2:383-93. 12. Kuno G, Gomez I, Gubler D. An ELISA procedure for the diagnosis of dengue infections. J Virol Methods 1991;33: 101-13. 13. Innis BL, Nisalak A, Nimmannitya S, Kusalerdchariya S, Chongswasdi V, Suntayakorn S, et al. An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize dengue infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate. Am J Trop Med Hyg 1989;40:418-27. 14. Chungue E, Marché G, Plichart R, Boutin JP, Roux J. Comparison of immunoglobulin G enzymeliked immunosorbent assay (IgG-ELISA) and haemagglutination inhibition (HI) test for the detection of dengue antibodies: prevalence of dengue IgG-ELISA antibodies in Tahití. Trans Royal Soc Med Hyg 1989;83: 708-11. 15. Dittmar D, Clearly TJ, Castro A. Immunoglobulin G and M-specific enzyme-linked immunosorbent assay for detection of dengue antibodies. J Clin Microbiol 1979;9:498-502. Recibido: 18 de septiembre de 1996. Aprobado: 21 de enero de 1997. Lic. Susana Vázquez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.