Fases alternativas al C18 y sus aplicaciones Julián de la Mata Especialista de Columnas 26-27 Septiembre 212 Page 1
Agenda Fases alternativas al C18 y sus aplicaciones Zorbax CN, Stable Bond Aq, Bonus RP Polaris Amide y Ether Zorbax Fenil y Pursuit Difenil y PFP Columnas HILIC Page 2 WIN 21 organization Agilent Restricted July 7th to 9th, 21
C18 es la fase reversa ligada más popular porque... Las columnas C18 proporcionan buena retencion y resolución con muchas muestras diferentes Las columnas C18 tiene una larga duración en muchas fases móviles diferentes (ph 2-8 o e incluso ph 2-9 y hasta 11.5) Las columnas C18 son muy flexibles para el desarrollo de métodos y la optimización, debido a su amplio rango de condiciones de uso. Hay una gran variedad de C18 s para optimizar la selectividad y resolución con diferentes tipos de muestras i.e. diferentes tipos de ligado C18 (monomerico vs. polimerico, monofuncional vs. trifuncional, diferente densidad de ligado, diferentes reactivos de ligado etc.) y diferentes desactivaciones ( endcapping). Confidentiality Label 3 September 27, 212
Química de la fase reversa ligada en HPLC - 95% de la gente usa HPLC de fase reversa La mayoría de las fases C18 son monocapa ligada y desactivadas Superficie de silanoles libres antes del ligado Endcapping group ligado endcapping Superficie de silanoles libre, 5% sin desactivar Confidentiality Label 4 September 27, 212
Ligado Monomérico vs. Polimérico Ligado monomerico Ligado típico Zorbax Eclipse Plus Eclipse XDB StableBond Bonus-RP Agilent HC(2)/TC(2) Altamente reproducible Ligado Polimérico Eclipse PAH Silano Trifuncional Confidentiality Label 5 September 27, 212
Porqué necesitamos alternativas al C18? mau 2 1 Tolueno N,N-Dietil-mtoluamida Fenol Butilparaben Etilparaben Metilparaben Propilparaben Heptilparaben Eclipse Plus PhenylHexyl.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min mau 2 Eclipse Plus C18 1.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min mau 2 Bonus RP 1.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 min Flujo:.5ml/min; Gradiente::25 a 8%ACN en 3min, a 4min 9%ACN,a 4.5min 25%ACN, por 6min25%ACN Tiempo de análisis: 6min; Vol inyección.: 3µl con needle wash (Agua/Methanol=5/5)por 6 s; T: 3 C (storage/run) DAD: 254nm bw 1, ref. 36/1nm, 4nm slit, peak width.1min Page 6
Resolution Impacto en el desarrollo de métodos:resolución Efecto de la Selectividad, Eficiencia, y Retención 7. 6. 5. Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad Lo que más influye en la Resolución es la Selectividad Cambio Fase Estacionaria Cambio Fase Móvil Parámetros Típicos Desarrollo Métodos Temperatura Los Platos es lo más fácil de aumentar 4. 3. Increase N Increase Alpha Increase k' 2. 1.. R s = N ½ /4 ( -1)/ k /(k +1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 Plates: 5 1 15 2 25 Alpha: 1.1 1.35 1.6 1.85 2.1 k : 2. 4.5 7. 9.5 12.
Qué clases de Fármacos son críticos? Ácidos, bases, moleculas polares y compuestos aromáticos/conjugados, 4-Acetamidofenol pka 9.71 Acido acetilsalicílico pka = 3.5 Adenosintrifosfato (ATP) cis-permetrina Clormequat C l N + C l - Page 8
Influencia del valor de ph en diferentes clases de sustancias ph 3 apolar polar ionizable Naftaleno Alcohol Bencílico Acido Benzoico Acenafteno Nitrobenceno Benzanilida 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 ph 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Time (min) Time (min) Time (min) Page 9
Efecto del ph en la Forma de Pico a o cerca del pka de la Muestra Columna: ZORBAX SB-C8 4.6 x 15 mm, 5 mm Flujo: 1. ml/min. Fase Móvil: 4% 5 mm KH 2 PO 4 : 6% ACN Temperatura: RT ph 4.4 Cerca del pka ph 3. Al menos una unidad de ph alejada del pka Tf = 3.9 Tf = 1.8 CH 3 CHCOOH CH 2 CH(CH 3 ) 2 Ibuprofeno pk a = 4.4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 Time (min) Time (min) Cuando se trabaja cerca del pka de un analito se obtienen picos con colas y esto debe evitarse. Page 1
Fases ZORBAX CN y StableBond Aq, ZORBAX Bonus RP, Polaris Amide y Polaris Ether para compuestos polares O StableBond CN O CH3 CH3 Eclipse XDB CN O Aq StableBond Aq (Bonus RP y Polaris tambien para bases fuertes) Page 11
Separación de Acidos/Bases. Fases Stablebond Muestra: 1. Barbital 2. Sulfametoxazol 3. Cafeina StableBond SB-C18 2 StableBond SB-C8 2, 3 StableBond SB-Phenyl 2 StableBond SB-CN 3 2 1 3 1 1 3 1 5 1 Time (min) 5 1 15 Time (min) 5 1 15 2 Time (min) 5 1 Time (min) Columna: 4.6 x 75 mm, 3.5 m Fase Móvil : 8% 25 mm NaH 2 PO 4, ph 3. : 2% MeOH Flujo : 1. ml/min Temperatura: 35 C Detección: UV 254 nm Page 12
Selectividad óptima para separaciones ultrarrápidas RRHT SB-Phenyl: Selectividad más rápida! mau 45 4 35 SB-C18 1.8um Doble de tiempo 3 25 SB-C8 1.8um Co-Elución 2 15 1 5 SB-Phenyl 1.8um SB-CN 1.8um Optima! Tailing Interacciones secundarias Orden de elución: Picos 3,4 & 5 Muestras: 1. Tolmetina 2. Naproxeno 3. Diflusinal 4. Ibuprofeno 5. Diclofenaco para SB-Phenyl 1 2 3 4 5 min Columna: RRHT 4.6 x 5mm, 1.8um Fase Movil: Acetonitrilo (4%):Tampon 6% ph=2.4 25mM NaH 2 PO 4 Flujo: 1.85 ml/min Detección: DAD, 254 nm LC: Agilent 12 RR LC Vol inyección: 1 ul Page 13
ZORBAX: Bonus RP 1 1 1 1 PG PG R R Gel de sílice ultra pura Zorbax RxSil Silanos monofuncionales Grupo amida polar embebido Cadenas laterales voluminosas para estabilidad a bajo ph Triple desactivación para estabilidad a ph medio y buenas formas de pico 1 1 PG R Ventajas: Analisis de compuestos altamente polares en condiciones 1% acuosas. Selectividad ortogonal Rango de ph: 2-9 Límite de temperatura: 6ºC Tamaños de Partícuila: 1.8, 3.5, 5, 7 3m Page 14
Selectividad Ortogonal de la Bonus RP Cefalosporinas Pesticidas mau 12 8 4 mau 8 4 2 4 6 8 Columnas:4.6 x 15 mm, Fase Móvil: 25 mm Citrato Sódico, ph 6/ MeOH, 75/25, Flujo: 1 ml / min., Detección: 254 nm Volumen de inyección: 3 µlmuestra: Cefalosporinas (1 Cefalexin,, 2 Cefaclor, 3 Cefuroxim, 4 Cefoxitin) min 1 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=45,8 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ63.D) 12 DAD1 A, Sig=254,16 Ref=45,8 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ62.D) 3 8 1 DAD1 B Bonus-RP Alkyl-C8 1 2 1 3 2 4 4 mau 8 DAD1 B 4 mau 2 3 4 5 Bonus-RP Alkyl-C8 2 4 4 5 3 6 7 2 4 6 8 Columnas: 4.6 x 15 mm, Fase Móvil: MeOH:.1% TFA (7:3) Flujo: 1 ml/min., Temperatura: RT, Inj.: 2 µl, Detección: 254 nm, Muestra: Triazinas (1. Prometrina 2. Tebuthion, 3. Atrazina, 4. Propazina, 5. Diuron, 6. Propanill, 7. Dacthal 6 7 min Page 15
La mejor resolución con Poroshell 12 Bonus-RP Compuestos básicos- β-bloqueantes mau 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 Poroshell 12 EC-C18-1 2 4 6 8 1 12 min mau 3 2 1 2 1 3 4 5 6 7 Poroshell 12 SB-C18-1 2 4 6 8 1 12 min mau 2 3 2 1 5 1 3 4 Poroshell 12 Phenyl Hexyl 7 6-1 2 4 6 8 1 12 min mau 3 2 1 2 1 5 3 4 7 6 Poroshell 12 Bonus RP -1 2 4 6 8 1 12 min 1. Atenolol, 2. Pindolol, 3. Naldolol, 4. Metoprolol, 5. Acebutolol, 6. Propranolol, 7. Alprenolol 1 mm ph 3.8 NH 4 HCO 2, Metanol; 9 % B a 3 % B durante 12 min,.35 ml/min, todas las columnas 2.1 x 1 mm
Polaris Amide y Polaris Ether. Las fases Polaris C18/C8-A y Ether deslocalizan la densidad de electrones, lo que minimiza las interacciones secundarias con los silanoles libres residuales Optimización de la simetría de pico Tamaños de partícula: 5 und 33m Page 17
Las Fases Polaris optimizan la forma de pico y la retención Optimización de la forma de pico Polaris Polaris C18 C18 Ether Ether 3 3 X X 2. 2. Polaris Polaris C18A C18A 5 5 X X 2. 2. Pursuit Pursuit C18 C18 5 5 X X 2. 2. Mejora la retención
Desarrollo de métodos con fases polares de diferente selectividad ZORBAX Bonus RP Polaris Amide y Ether Fases alquílicas con amida polar embebida e intensa desactivación (endcapping) StableBond-Aq Fase Reversa Polar con cadenas laterales voluminosas =>Para el análisis de compuestos polares => Para trabajar con fases 1% acuosas Para rango de ph medio => Para el análisis de compuestos polares => Para trabajar con fases 1% acuosas Para rango de ph bajo y alta temperatura Page 19
Desarrollo de métodos con fases polares de diferente selectividad Bonus RP StableBond-Aq Columna: 4.6 x 15, 5 um Fase Móvil: (25 mm Kphos, ph7.2)/(meoh: ACN, 5:5), 45:55 Muestra:Supresores del apetito. Aminas 1. Fentermina pk a 1.1 2. Fenfluramina pk a 9.1 Columna: 4.6*15 mm (5µm) Fase Móvil: 99% 2 mm NaHPO 4, ph2, 1% ACN Muestra: Ácidos orgánicos 1. Acido láctico 2. Ácido acético 3. Ácido Cítrico 4. Fumárico 5. Ácido succínico Page 2
Separación de Uracilo y Urea via HILIC con ZORBAX RxSIL mau 16 14 12 1 8 6 4 2 ZORBAX Rx-SIL DAD1 A, Sig=21,16 Ref=45,8 (F:\1\DATA\TRANQ\TRANQ112.D) 1 2 1. Uracilo 2. Urea HPLC System: HP19 Columna:ZORBAX Rx-SIL, 4.6 x 15 mm Part. No.: 883975-91 Fase Móvil: isocrático - 9/1 ACN: K 2 HPO 4, 2 mm ph 7.2 Detección: Flujo: Temperatura: UV 21 nm 1 ml/ min. RT 1 2 3 4 5 min Precaución: Las columnas Rx-SIL se envían en disolvente de fase normal (hexano). Deben acondicionarse previamente para trabajar en HILIC. El procedimiento de lavado está disponible Page 21
HILIC - Hydrophilic Interaction Chromatography Tipos de compuestos: Moléculas altamente polares que no se retienen en fase reversa Fases estacionarias: Silica gel Rx Sil, Amino, Diol, Cyano y las especiales (zwitterionicas) Fase móvil: >5-6 Acetonitrilo mezclado con fase acuosa/polar, ácido fórmico, formiato, acetato (no tampón fosfato) Gradiente: 1% ACN a 5%ACN El agua es el disolvente más fuerte Detección: UV y MS-ESI El alto contenido orgánico ofrece una buena sensibilidad en MS Page 22
Analitos típicos en HILIC 1. Amino acidos (cuando solo unos pocos son de interés) 2. Bases nucleicas (purinas y pirimidinas, uracilo, adenina, guanina, timina, cistosina) 3. Nucleosidos (Adenosina, citosina.) 4. Alcaloides 5. Carbohidratos 6. Acrilamida Citosina Amfetamina CH 2 CHCH 3 Melamina NH 3 + 23 September 27, 212 Confidentiality Label
Mecanismos de interacción HILIC en columnas basadas en sílica H 2 O ACN ACN H 2 O ACN H 2 O ACN 1. ACN CH 2 CHCH 3 O - H 2 O O - 3-2. NH O + ACN ACN H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O CH 2 CHCH 3 ACN + NH 3 O - H 2 O ACN ACN Silica 1. Partición con la capa de agua adsorbida a la sílice 2. Intercambio iónico con los silanoles 24
Secuencia de Elución Secuencia de Elución Elución de los componentes de una muestra NP < k -Valor polar Alcanos Olefinas Aromaticos Etéres Esteres, Aldehidos, cetonas Alcoholes, Aminas Amidas Ácidos carboxílicos RP No polar < k -Valor < k -Valor Alcoholes, Aminas Amidas Ácidos carboxílicos HILIC polar Page 25
Separación HILIC de productos farmacéuticos básicos en suero mediante ZORBAX RxSil Nota de aplicación 5989-3761EN Paroxetina m/z 33-192 Condiciones RP ZORBAX Eclipse XDB C18, 2.1*15 mm 1ppb 5%ACN 9%ACN en 1 min Ranitidina m/z 315-176 Condiciones HILIC ZORBAX Eclipse RxSil, 2.1*15 mm 1ppb 95%ACN 5%ACN en 1 min Paroxetina m/z 33-192 Ranitidina m/z 315-176 Page 26
Ventajas con HILIC Buena retención de compuestos altamente polares que no se conseguiría en el modo de RP. Selectividad diferente a la LC RP y NP. Selectividad ortogonal. Orden de elución inversa a RP Pueden usarse flujos más altos y/o columnas más largas debido a la baja viscosidad de las fases con alto contenido en organico: mayor eficiencia Mejor sensibilidad en en LC/MS Un alto contenido en orgánico lleva a una mejor s/n en ESI-MS La preparación de la muestra es más fácil gracias a la alta concentración de fase orgánica SPE, o extracción líquido/líquido que dejan las muestras en un alto contenido orgánico. Desolvatación y spray más eficaz en electrospray MS Puede facilitar la solubilidad de la muestra Page 27
Consideraciones a tener en cuenta en HILIC El gel de silice necesita una equilibración más lenta Una equilibración intensa es esencial para la obtención de resultados reproducibles Es aconsejable el uso de formiato / acetato + sal (amonio, etc) para aumentar la fuerza iónica, y obtener un mejor control de la forma de pico y de las interacciones. A menudo se logran mejores resultados en modo isocrático. Gradientes restringidos de 1%-5% de ACN Las separaciones son muy sensibles al ph, éste debe ajustarse con mucha precisión. El ph elegido debe permitir la máxima interacción con la gel de slice Picos dobles (peak splitting) Causa: los mecanismos de par iónico se ajustan a través de la fuerza iónica por la concentración de la sal o tampón Page 28
Separación de analitos del Grupo 4 de la EPA 1694: HILIC con ZORBAX HILIC Plus en aguas residuales Ap.Note 5989-3761EN Condiciones HILIC ZORBAX Eclipse HILIC Plus, 2.1*15 mm, 3.5 um 1ppb 98%ACN 7%ACN in 12 min Temperatura: 25C Flujo:.25 ml/min Pos ESI Ionisierung Sensibilidad: por debajo de ppb (.1 ppb) Page 29
.222.671 2.161 3.72 1.885 1.265 Poroshell 12 HILIC -análisis de Catecolaminas mau 25 2 1 2 Poroshell 12 HILIC 2.1x 1mm 1. Dopamina, 2. Epinefrina, 3. Norepinefrina 15 1 5 3. 55 ml/min 1 2 3 4 5 min Las Catecolaminas pueden ser dificiles de separar por fase reversa Este cromatograma muestra un rápido análisis de 3 catecolaminas con la columna Poroshell 12 HILIC A: 9 (Tampón1 mm ph 3) 1 MeCN B: 9 MeCN 1 (Tampón1 mm ph 3) % A % B Inicial 1 5 Min 7.5 92.5 6 min 1 12 min 1
Fases ZORBAX Fenil y Pursuit DiPhenyl. Un amplio rango de selectividades alternativas. Tipo de fase Fenil ligada Desacti vada Tipo de Silica Dimetil Fenilhexil Si B Dimetil Feniletil Columna Agilent Eclipse Plus Phenyl- Hexyl Qué las diferencia? El grupo hexilo más voluminoso añade hidrofobicidad a la fase. Si B Eclipse XDB-Phenyl Primera Fenil Silica Tipo B Diisopropil Feniletil Dimetil Feniletil Diphenyl No B SB-Phenyl Si A ZORBAX Phenyl Si B Pursuit Diphenyl La no desactivación aumenta las interacciónes hidrofílicas y con los silanoles Fenil original Silica tipo A con diferente selectividad Única con funcionalidad Difenilo Group/Presentation Title Agilent Restricted Month ##, 2X
Pursuit Diphenyl- Selectividad Unica Antifungicos en Pursuit XRs DP y C18 Columnas: Mencionadas en los cromatogramas Dimensiones: 15 x 4.6 mm, 5m Fase movil : A: H2O +.1% HCOOH, B: CH3CN +.1% HCOOH A:B - 8:2 Flujo: 1. ml/min Temperatura: Ambiente Detección: 254 nm Muestra: 1. 4-Acido Aminobenzoico 2. Acido Sorbico 3. Acido benzoico 4. Acido salicílico Par Crítico Ácido Benzoico Ácido Sorbico Page 32 WIN 21 organization Agilent Restricted July 7th to 9th, 21
Pursuit PFP (Pentaflurofenil): Analitos polares, Nucleotidos y Nucleosidos Buena alternativa a C18 para compuestos polares en fases 1% acuosas o con alto contenido acuoso, como compuesos aromáticos y nitroaromáticos y sistemas conjugados (esteroides),isomeros posicionales y compuestos halogenados Selectividad basada en interacciones p-p, transferencia de cargas, dipolos, enlaces de hidrógeno e interacciones electrostáticas. Compatible con fase reversa, fase normal e HILIC. A bajo contenido de organico la retencion se basa en fuertes interacciones dipolo-dipolo, y a alto contenido de orgánico en interacciones hidrofóbicas y p-p DISCOVERY TOUR Page 33 26-27 Septiembre 212
Formulas moleculares de hormonas esteroideas Pequeños sistemas conjugados Page 34
Esteroides Fase Fenilo y ACN El ACN facilita la separación según la hidrofobicidad Page 35
Esteroides Fase Fenilo y MeOH El MeOH facilita la separación según la aromaticidad/electrones pi Page 36
Formulas moleculares de hormonas esteroideas : Estrógenos Sistemas aromáticos altamente conjugados App. Note 5989-913EN Page 37
Estrógenos: Diferencias de selectividad ZORBAX Eclipse Plus C18/FenilHexil Alrededor de un 3% más de eficiencia Condicions Isocráticas: Fase Móvil : 6% MeOH/4% Agua, Flujo: 1ml/min, Vol. inyección: 3ul, Temperatura: 25C, Detección: 22nm App. Note 5989-913EN Page 38
La mejor resolución con Poroshell 12 Phenyl-Hexyl Para compuestos esteroideos mau 15 1 5 mau 15 1 5 mau 15 1 5 mau 15 1 5 Poroshell 12 EC-C18 2 4 6 8 1 12 Poroshell 12 SB-C18 2 4 6 8 1 12 Poroshell 12 Phenyl Hexyl 2 4 6 8 1 12 Poroshell 12 Bonus RP 1 1 1 3 1 2 4 6 8 1 12 1.Hydrocortisone, 2.b-Estradiol, 3. Andostadiene 3,17 dione, 4. Testosterone, 5. Ethyestradione, 6. Estrone, 7. Norethindone acetate, 8. Progesterone 3 2,5 6 4 7 Separación de 8 Esteroides : 4-8 % MeOH/14 min,.4 ml/min 25 C 2.1 x 1 mm,.1 % acido fórmico tanto en agua como en MeOH 3 3,2 4 5 2,5,6 2 5 6 6,4 7 8 4 7 8 8 7,8
Estructuras de los colorantes azoicos Structures of Azo Dyes Aniline o-toluidine Methoxyanaline Benzidine Chloroaniline Dimethylbenzidine 3,3 -Dimethoxybenzidine Napthalamine Dichlorbenzidine R-N=N-R Compuestos azo HN=NH Diazeno N=N Grupo Azo Page 4
Colorantes Azo y sus productos de degradación en diferentes fases Zorbax Fenil. Condiciones: Fase Móvil A:1mM Acetato amónico, B: MeOH, Gradiente: 25%B->9%B en 9 min, Flujo: 1ml/min, Vol. Inyección: 2ul, Temperatura: 25C, Detección: 22nm Page 41
Separación de derivados de la degradación de colorantes Azo -N=N- mau DAD1 A, Sig=26,8 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY32.D) 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DAD1 A, Sig=26,8 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY34.D) mau 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DAD1 A, Sig=26,8 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY36.D) mau 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DAD1 A, Sig=26,8 Ref=off (C:\DOCUMEN...INGS\WILLLONG\MY DOCUMENTS\DEC14\DATA\AZO DYES\SURVEY38.D) mau Poroshell 12 EC-C18 Poroshell 12 SB-C18 Poroshell 12 Phenyl Hexyl Poroshell 12 Bonus RP 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min min min min 9 picos 15 to 1 % MeOH over 1 min @.4 ml/min, Solvent A is 1 mm Ammonium Acetate ph 4.8
Eclipse Plus Selectividad en función del grupo funcional Different Bonded Phases Different Selectivity NSAIDS fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) mau 2 15 1 5 mau 4 3 2 1 mau 3 2 1 1 2 Eclipse Plus Phenyl-Hexyl 2 4 6 8 1 1,2 Eclipse Plus C8 2 4 6 8 1 1,2 3 3 4 4 3 α 2,1 =1.11 α 6,5 =1.24 5 α 2,1 = 1 α 5,6 =1.11 Rs 5,6 =2.26 4 6 α 2,1 = 1 α 5,6 =1.8 Rs 5,6 =1.84 6 Eclipse Plus C18 2 4 6 8 1 5 6 5 7 7 7 min min min Mobile Phase 4 % ACN 6 % 25 mm Sodium Phosphate Buffer ph= 2.4 Flow Rate= 1.5 ml/min 4.6 x 5mm UV 21 nm 2µl Elution order for Eclipse Plus Phenyl Hexyl: (1) Piroxicam, (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen, (5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex (equal portions of approximately 1 mg/ml solutions
Eclipse Plus Phenylhexyl La selectividad es independiente del tamaño de partícula fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) mau 2 15 1 RRHT Eclipse Plus Phenyl - Hexyl 4.6 x 5 mm, 1.8um 2 µ l inj 5 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 min mau 2 15 4.6 x 1 mm, 3.5um 1 5 4 µ l inj 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 min mau 2 15 4.6 x 15 mm, 5um 1 5 6 µ l inj 2.5 5 7.5 1 12.5 15 17.5 2 min Fase Móvil 4 % ACN 6 % 25 mm Na Tampon Fosfato ph= 2.4 Flujo= 1.5 ml/min Detección: UV 21 nm 2 Muestra: (1) Piroxicam, (2) Sulindac,(3) Tolmetin, (4) Naproxen, (5) Ibuprofen, (6) Diclofenac, (7) Celebrex 1 mg/ml) Page 44
Columnas Agilent ZORBAX y especiales de HPLC Columnas para Pequeñas Moléculas Fase Reversa Poroshell 12 EC-C18, EC-C8 Eclipse Plus C18, C8, Phenyl-Hexyl, Poroshell Phenyl-Hexyl Eclipse XDB-C18, C8, Phenyl, CN, Poroshell EC-CN StableBond-C18, C8, Phenyl, C3, CN and SB- AQ, Poroshell 12 SB-C18, SB-C8 y SB-Aq Bonus-RP, Polaris C18-A, C18-eter. C8-A y C8-eter, Poroshell 12 Bonus-RP Extend-C18 Pursuit XRs Diphenyl y PFP Rx-C18, Rx-C8 Traditional/Original ZORBAX ODS (C18), C8, Phenyl, CN, TMS Fase Normal Rx-Sil Original ZORBAX CN, NH 2, Sil, Eclipse XDB- CN HILIC ZORBAX HILIC Plus Poroshell 12 HILIC Columnas para BioMoleculas Proteinas y Peptidos Fase Reversa 3StableBond 3Extend-C18 Intercambio iónico Bio SCX Series II para aplicaciones de proteómica 2D y Bio-IEX Poroshell (Fase Reversa) 3SB-C18, C8, C3, 3Extend-C18 Exclusión Molecular GF-25 and GF-45 Bio-SEC Bio Monoliths Protein A Ion-Exchange (DEAE, QA, SCX) Columnas Poliméricas Hi-Plex poliméricas para Carbohidratos y acidos organicos PLRP-S y PL-IEX y PLGel para GPC Confidentiality Label 45 September 27, 212
Entonces, que fase ligada debo elegir?* * Mas del 2% de Organico C18 C8 Fenil CN HILIC ofrece la mayor retención, quizás demasida para algunas muestras y a veces muy poca para otras. retiene menos que C18, pero con similar selectividad en la mayoría de los casos significantemente menos retentiva para compuestos no polares, pero retiene bien compuestos polares, por lo que reduce los tiempos de análisis para las mezclas polar/no polar la menos retentiva, cambios en selectividad, buena para reducir tiempos de analisis para compuestos que eluyen muy tarde y evita las separaciones en gradientes. ofrece buena retención de compuestos muy polares con fases móviles de alto contenido de orgánico
Entonces, que fase ligada debo elegir?* Fases Móviles al t ament e C18 Acuosas* raramente ofrece ventajas en la retención, y la selectividad puede no ser óptima y con poca retención C8 a menudo proporciona un poco más de retención que C18 con una selectividad similar Fenil más retentivo con cambios de selectividad C3 similar a Fenil en retención pero muestra cambios en selectividad comparada con C18, C8 y Fenil CN la menos retentiva, grandes cambios en selectividad, buena resolución. Bonus RP, las mejores columnas en cuanto a retención y selectividad para SB-Aq, fases 1% acousas Polaris,PFP * Por debajo del 2% de Orgánico
Nuestra recomendación es usar Poroshell 12, disponible en EC-C18 EC-C8 SB-C18 SB-C8 EC-CN Fenil-Hexil Bonus RP SB-Aq HILIC.5um 1.7um.5um Y las precolumnas Poroshell 12 para HPLC y UHPLC 9/27/212 48 Agilent Confidential
Nuestra recomendación es usar Poroshell 12, disponible en EC-C18 EC-C8 SB-C18 SB-C8 EC-CN Fenil-Hexil Bonus RP SB-Aq HILIC.5um 1.7um.5um Y las precolumnas Poroshell 12 para HPLC y UHPLC Pida el nuevo catálogo 599-5951EN 9/27/212 49 Agilent Confidential
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