Investigación en genes Conocer el genóma de los organismos Modificar la dotación génica natural Tecnología a del ADN recombinante
Conocimientos básicos que posibilitaron el desarrollo de la Tecnología a del ADN recombinante I Enzimología de Acidos nucleicos Endonucleasas de restricción (cortan) Ligasas (unen) ADN polimerasas (replican) Transcriptasa inversa (transcriben) II Complementariedad de bases (construcción de nuevas secuencias, amplificar o detectar) III Vectores de ADN Entidades de ADN que pueden transportar ADN foráneo. Plásmidos Virus
I Enzimas de restricción EcoRV (verde) Descubiertas por Arber y H Smith Presentes en bacterias Cortan el ADN extraño Sustrato: Reconocen una secuencia de entre 4-8 bp en una molécula de ADN de doble hebra. Rompe un enlace fosfodiéster en ambas hebras Porción de la doble hebra de ADN cuya secuencia es palindrómica o de simetría rotacional binaria
I Enzimas de restricción tipos de cortes: Cortes escalonados, dejando productos con extremos cohesivos Cortes simétricos, dejando productos con extremos romos
I Ligasas Forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una cadena polinucleotídica y el extremo 3 de otra cadena polinucleotídica.
Enzimología de Acidos nucleicos Producción de moléculas de ADN recombinante I Enzimas de restricción y ligasas Unión entre fragmentos de DNA con extremos cohesivos Adición de secuencias de restricción a fragmentos de ADN ligasas
II Complementariedad de bases Debido a los puentes hidrógenos que se establecen entre las bases, la adenina sólo puede unirse con la timina, y la citosina con la guanina. Por esto solo es necesario conocer la secuencia de una de las cadenas para deducir la secuencia de la cadena complementaria
III Vectores: moléculas de ADN Plásmidos y virus Poseen replicación autónoma Llevan un sitio de origen de la replicación Presenta un sitio de multiclonado Poseen genes marcadores que permitan seleccionar las células huéspedes con la secuencia recombinante
Sal I Sal I Sal I ADN de interés plásmido ligasa ADN recombinante Bacterias muertas (s/plásmido) Bacterias resistentes a los dos antibióticos Bacterias resistentes sólo a la ampicilina
III Vectores: Ej: Bacteriófago λ 48 kb del fago no son esenciales para la infección lítica y pueden ser reemplazadas por ADN foráneo
III Vectores: Ej: Fago λgt- λβ (mutante del fago λ) Posee dos sitios de restricción para EcoRI 10 kb
III Vectores: Ej: Fago M13 Se empaqueta en formas víricas
Vectores artificiales Cósmidos III Vectores: 45 kb BACs Cromosomas artificiales de bacterias 300 kb YACs Cromosomas artificiales de levadura más de 600 kb YACs
Instrumentos básicos de la investigación en genes 1- Análisis de enzimas de restricción 2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN 3- Secuenciación de ADN 4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos 5- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
I Enzimas de restricción 1 Patrón de fragmentos de restricción 3 Patrón de fragmentos de restricción 2 Fragmentos de ADN Virus SV40
2- Técnicas de Transferencia de ADN y ARN Southern Blot o Transferencia de ADN. Permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Se utiliza para separar y caracterizar moléculas de ADN
3- Secuenciación de ADN Método de interrupción controlada de la replicación (de Sanger) 1 hebra de interés de ADN + + + + ADN polimerasa + + + + Cebador + + + + 4 NTPs + + + + 2,3 - didesoxi de ATP + - - - 2,3 - didesoxi de TTP - + - - 2,3 - didesoxi de GTP - - + - 2,3 - didesoxi de CTP - - - +
3- Secuenciación de ADN Electroforesis de ADN 2,3 - dd de ATP 2,3 - dd de CTP 2,3 - dd de TTP 2,3 - dd de GTP 3 GTCGATGATACGACT 5 5 CAGCTACTATGCTGA 3
4- Síntesis en fase sólida de ácidos nucléicos Adición secuencial de monómeros activados a una cadena en crecimiento unida a un soporte sólido.
5- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Mezcla de reacción -hebra de ADN que se quiere amplificar -ADN polimerasa (de organismo termófilo) -Cebador (complementario de secuencias colindantes) -4 NTPs Etapas 1-Separación de las hebras (94ºC) 2- Hibridación de los cebadores (54ºC) 3- Síntesis de ADN (72ºC)
Ventajas de la PCR -Después de n ciclos la secuencia se amplifica 2 n veces -No es necesario conocer la secuencia a amplificar -Se necesita conocer secuencias colindantes -La secuencia a amplificar puede ser mucho mayor que los cebadores PCR Utilidades Diagnóstico clínico Medicina Forense Evolución molecular
Ejemplos de Uso de la Tecnología del ADN recombinante A. Producción de moléculas de ADN recombinante B. Biblioteca Genómica C. Recorrido cromosómico D. Manipulación de genes en eucariotas E. Búsqueda de genes de cadn F. Microarreglos de ADN G. Organismos genéticamente modificados
A- ADN recombinante Mutagénesis dirigida o mutaciones específicas in vitro 1-Deleciones: Cortes en una secuencia con endo/exonucleasas 3- Inserciones 2- Sustituciones Se pretende sustituir el aminoácido serina por cisteína
B- Construcción de una Biblioteca genómica un gen en una biblioteca genómica
C- Recorrido cromosómico
D- Manipulación de los genes eucariotas
E- Búsqueda de clones de cdna
F- Microarreglos de ADN o Chips de genes Soportes de vidrio o siliconas conteniendo miles de moléculas distintas de ADN de hebra simple. Pueden contener : todos los genes de un organismo genes expresados por un tipo celular particular genes seleccionados que uno quiere investigar Sirven para monitorear la expresión de muchos genes simultáneamente
F- Microarreglos de ADN
chip de ADN (microarray) Células hepáticas normales Células hepáticas cirróticas RNA marcado rojo RNA marcado verde Verde: gen expresado sólo en el hígado cirrótico Blanco: gen no expresado en hígado Rojo: gen expresado sólo en hígado normal. Naranja: gen expresado en hígado normal y cirrótico
G- Organismos genéticamente modificados (GMOs) Animales transgénicos -Ratones gigantes -Introducción del gen de la hormona de crecimiento en óvulos fertilizados de ratón -Los ratones que contenían el gen crecían más rápidamente. -Más aún si se les daba de beber agua con cadmio
Inserción de genes en células eucariotas Precipitación de ADN ajeno con Fosfato de Calcio Microinyección Infección con retrovirus
G- Organismos genéticamente modificados (GMOs) ADN recombinante en vegetales Agrobacterium tumefaciens infecta a la planta e introduce en las células su ADN
Las técnicas de la química de ácidos nucléicos y dela química de proteínas se refuerzan mutuamente