UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA CENTRO UNIVERSITARIO METROPOLITANO FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS UNIDAD DIDACTICA DE INMUNOLOGÍA Y MICROBIOLOGÍA MÉDICA TERCER AÑO ACTIVIDAD PRÁCTICA No. 6 REACCIONES DE HIPERSENSIBILIDAD REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO Dr. Mario Roberto Pinto Dra. Rosa Elena Solís Los anticuerpos son glicoproteínas producidas por los plasmocitos en respuesta a la presencia de antígenos (virus, bacterias, hongos, alérgenos). Los anticuerpos se pueden encontrar en forma soluble en el torrente sanguíneo y en fluidos corporales o bien formando parte integral en las membranas celulares de los linfocitos B. Los anticuerpos también llamados inmunoglobulinas se clasifican en diferentes grupos como son: IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, algunos de estos se clasifican en subgrupos como, la IgG y la IgA. Las características más importantes de los anticuerpos están relacionadas con: a) Especificidad: En general los anticuerpos (Ac) tienen gran especificidad de reacción con determinado antígeno (Ag). Variaciones mínimas en la constitución del Ag van a inducir Ac diferentes. La especificidad de un antisuero es igual a la suma de los efectos de cada uno de los Ac que contiene dicho antisuero. Durante el proceso de respuesta inmune la especificidad de los Ac por el Ag va aumentando gradualmente. En un inicio un Ag desencadena la producción de IgM, que puede tener una afinidad incompleta por el Ag, pero a medida que progresa la reacción inmune, se inicia la síntesis de IgG por el cambio de cadena pesada y luego la hipermutación somática generalmente mejora la especificidad de Ac por el Ag. b) Afinidad del Ac por el Ag: es la fuerza del enlace entre el Ag y Ac, es reversible pues no son covalentes. Los Ac tienen dos sitios de unión con el Ag, los Ac pueden reaccionar con los Ag en forma polivalente (microorganismos) o monovalentes (haptenos). La fuerza con la que un Ag polivalente se le denomina avidez. La afinidad se refiere a la unión entre un sólo determinante antigénico y un único punto de unión. La avidez de un Ac con respecto a un Ag, depende de la afinidad de cada uno de los puntos de unión por determinado Ag. La avidez tiene más importancia que la afinidad ya que los Ag son generalmente polivalente.
c) Diversidad: En una reacción Ag-Ac puede producirse una diversidad de Ac dirigidas contra diversos epítopes del Ag. Una de las ramas de la Inmunología es la inmunohematología y uno de sus aspectos más importantes es el estudio y cuantificación de los grupos sanguíneos eritrocitarios, que son componentes antigénicos presentes en la superficie de su membrana. Conocimiento indispensable en el tratamiento de transfusiones sanguíneas y evitar accidentes hemolíticos. Landstainer, descubrió a principios del siglo pasado que los hematíes de individuos normales podían aglutinar en presencia de suero de otros individuos normales y descubrió el sistema ABO, que permitió el uso de transfusiones sanguíneas seguras. Los grupos sanguíneos A, B y AB son antígenos en la superficie de los hematíes. Su estructura química consiste en carbohidratos de proteínas y glicolípidos. El sistema ABO se identificó en el brazo largo del cromosoma 9. Los genes A y B codifican a las glicotransferasas, que transfieren N-acetil-galactosa y galactosa, respectivamente al mismo sustrato, el antígeno H. El grupo O no está codificado y no expresan transferencia de carbohidratos, ni modificación en el antígeno H, que es la base común donde se encuentran unidos los carbohidratos. l sistema Rh se identificó por primera vez en 1943, también por Landstainer, produciendo suero anti Rh, inyectando hematíes de Macacus Rhesus a conejos y cobayos y cuyo suero aglutina al ponerlo en contacto con hematíes humanos en un 85%, por lo tanto los humanos en sus hematíes en esa proporción tienen el antígeno D(Rh). Fundamento de la Determinación de grupo Sanguíneo. La reacción Ag-Ac permite identificar la especificidad, variabilidad y diversidad de la respuesta inmune humoral. Esta práctica demuestra la presencia de la interacción Ag-Ac, que es necesario para evaluar el tipo de sangre, mediante el uso de anticuerpos específicos en el sistema ABO e identificar el Rh en diferentes personas para evaluar la compatibilidad sanguínea.
El sistema Rh se identificó por primera vez en 1943, también por Landstainer, produciendo suero anti Rh, inyectando hematíes de Macacus Rhesus a conejos y cobayos y cuyo suero aglutina al ponerlo en contacto con hematíes humanos en un 85%, por lo tanto los humanos en sus hematíes en esa proporción tienen el antígeno D(Rh). Fundamento de la Determinación de grupo Sanguíneo. La reacción Ag-Ac permite identificar la especificidad, variabilidad y diversidad de la respuesta inmune humoral. Esta práctica demuestra la presencia de la interacción Ag-Ac, que es necesario para evaluar el tipo de sangre, mediante el uso de anticuerpos específicos en el sistema ABO e identificar el Rh en diferentes personas para evaluar la compatibilidad sanguínea. Objetivos de la Práctica 1. El alumno observará la reacción Ag-Ac mediante aglutinación eritrocitaria en respuesta a Ac contra grupos sanguíneos y Rh. 2. El alumno determinará por medio de pruebas cruzadas mayor y menor, la compatibilidad o la incompatibilidad sanguínea mediante la reacción de aglutinación. Normas de Bioseguridad 1. Usar bata blanca 2. Utilizar guantes para la obtención de muestras sanguíneas Material y Procedimientos Material que proporciona el laboratorio. Reactivos Material - Suero antigrupo sanguíneo A, - Tubos de ensayo
Antigrupo B y anti Rh - Pipetas de Pasteur - Solución salina fisiológica - Algodón y alcohol - Suero de Coombs - Palillos - Lancetas Material que debe traer el alumno Material Biológico: - Sangre periférica extraída de alumnos voluntarios. Otro: - Jeringa descartable de 5ml Métodos y Procedimientos para determinar grupo Sanguíneo Los principales grupos sanguíneos son A,B, AB y O Un individuo tiene en sus eritrocitos un antígeno (aglutinógeno) y en su plasma anticuerpos (aglutininas) contra otro grupo sanguíneo que no es el propio. Grupo Antígeno en Eritrocito Anticuerpos en Plasma A A Anti B B B Anti A O No tiene Anti A y Anti B AB A y B No tiene Rh positivo y Rh negativo 1. Limpie con un algodón el pulpejo del dedo medio de la mano. 2. Pinche con una lanceta y extraiga 3 gotas de sangre capilar. 3. Coloque las 3 gotas sobre un portaobjetos separadas. A cada gota de sangre agréguele una gota de anti A, al otro una gota anti B y al siguiente una gota de suero anti Rh, mezcle con palillos diferentes y observe la aglutinación con pequeños movimientos de rotación. Fundamento de la Compatibilidad Sanguínea Las pruebas de compatibilidad son fundamentales para garantizar la ausencia de anticuerpos en pacientes capaces de reaccionar con los antígenos de los glóbulos rojos transfundidos.
La prueba cruzada consiste en los procedimientos que se efectúan antes de la transfusión para determinar la selección apropiada de la sangre de un paciente. Para determinar la compatibilidad sanguínea, existen 2 pruebas: a) la prueba mayor, la cual involucra eritrocitos del donador con el suero del receptor y b) la prueba menor involucra los eritrocitos del receptor con el suero del donador. Para efectuar estas pruebas, se utiliza la prueba de antiglobulina indirecta llamada prueba de Coombs, es un método de aglutinación en tubo en el cual el suero antiglobulínico demuestra la combinación de los anticuerpos con los eritrocitos. Tiene tres pasos: Sensibilización, incubación y lavado y agregar el reactivo antiglobulínico (reactivo de Coombs). En la sensibilización se incuba suero y eritrocitos a 37º C, durante 15 minutos. Es esencial el lavado, porque debe eliminarse todo vestigio de suero de los eritrocitos y el ph de la solución salina debe ser de 6.5-7.5, en caso contrario, el lavado puede remover los anticuerpos fijados a los eritrocitos. Los reactivos antiglobulínicos, deben usarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La prueba de antiglobulina directa se realiza para saber si los eritrocitos del paciente se recubren de anticuerpos in vivo. Este fenómeno sólo se observa en la anemia hemolítica autoinmune, las reacciones en transfusiones hemolíticas y en la enfermedad hemolítica del recién nacido. En la prueba de estas enfermedades los eritrocitos no se incuban con suero, sino sólo se lavan y se mezclan con reactivos antiglobulínicos se evalúan en forma directa. Procedimiento para compatibilidad sanguínea Prueba cruzada mayor: 1. Depositar en un tubo una gota de eritrocitos del donador, diluidos al 5% en solución salina normal. 2. Depositar en el mismo tubo, 2 gotas de suero del receptor. 3. Agitar cuidadosamente. 4. Observar si hay aglutinación. 5. Aplicar 2 gotas de suero de Coombs. 6. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente. 7. Centrifugar y leer (si existe aglutinación, es incompatible).
Prueba cruzada menor: 1. Depositar en un tubo una gota de eritrocitos del receptor, diluida al 5% en solución salina normal. 2. Depositar en el mismo tubo 2 gotas del suero del donador 3. Agitar cuidadosamente. 4. Observar si hay aglutinación. 5. Aplicar 2 gotas de suero de Coombs. 6. Incubar 15 minutos a temperatura ambiente. 7. Centrifugar y leer (si existe aglutinación, es incompatible). RESULTADOS. CONCLUSIONES BIBLIOGRAFÍA 1. Alvarado A. et al. Manual de Prácticas de Laboratorio. Laboratorio de Inmunología. Universidad de Guadalajara, 2007. 2. Amich, s. Salve ML, Prieta S. Laboratorio Clínico e Inmunología, 1994. Ed. Interamericana Mc. Graw- Hill. 3. Campos A, Muñoz C, Rubio G. Manual de Prácticas de Inmunología, fagocitosis de Candida albicans, 2004. Ed. Masson, S.A. Pág. 67-70 4. Male D, Brostoff J, Roth D, Roitt I. Inmunología. 7a. Ed. 2007. Edit. Elsevier. España, S.A. 2007. 5. Parslow T, Suites D, Terr A, Imboden Inmunología Básica y Clínica 2001. Ed. Moderno. Pág. 289-299. 6. Pérez JR, Fernández J. Manual de Prácticas de Hematología Básica. USAC, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacología, 1998. 7. Pinto MR. Práctica de Laboratorio de Inmunología Inmunidad Innata y Adquirida. Facultad de Ciencias Médicas, USAC, 2003, documento mimeografiado. Págs.10