LICENCIATURA EN FARMACIA ÁREA: MICROBIOLOGÍA ASIGNATURA: LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA FARMACÉUTICA CÓDIGO: FARM-018 L

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1 BENÉMERITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA VICERRECTORÍA DE DOCENCIA DIRECCIÓN GENERALDE EDUCACIÓN SUPERIOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN FARMACIA ÁREA: MICROBIOLOGÍA ASIGNATURA: LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA FARMACÉUTICA ELABORADO POR: CÓDIGO: FARM-018 L M.S.P. Carlos Cabrera Maldonado M. C. Gloria León Tello M.S.P. Jesús Luzuriaga Galicia. M.C. Nidia Gary, Pazos Salazar M.C. Ana Berta Escobedo López. M.S.P. María de la Cruz Meneses Sánchez Dr. Juan Manuel Álvarez López FEBRERO 2009

2 ÍNDICE NÚMERO DE LA PRÁCTICA PRACTICA N 1 PRACTICA N 2 PRACTICA N 3 PRACTICA N 4 PRACTICA N 5 PRACTICA N 6 TITULO DE LA PRÁCTICA SEGURIDAD EN EL LABORATORIO PÁGINA TOMA DE MUESTRAS 7 DILUCIONES OBSERVACION DE LEUCOCITOS DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO 11 SEMINARIO: HERENCIA DE LOS GRUPOS SANGUÍNEOS PRACTICA N 7 PRACTICA N 8 PRACTICA N 9 PRACTICA N 10 PRACTICA N 11 PRACTICA N 12 PRACTICA N 13 DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO PRUEBAS CRUZADAS REACCIONES FEBRILES SEMINARIO: DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIONES MICROBIANAS FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS O (ASO) SEMINARIO: INMUNIZACIÓN PRACTICA N 14 PRACTICA N 15 PRACTICA N 16 DETERMINACIÓN DE LA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA SEMINARIO: DETECCIÓN DE ANTICUERPOS CONTRA EL VIH (ELISA/WESTERN BLOT) SEMINARIO: INMUNOELECTROFORESIS 23

3 INTRODUCCIÓN Desde el descubrimiento de la alta especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac), muchos investigadores han buscado su aplicación con propósitos de diagnóstico (inmunodiagnóstico). Inicialmente los investigadores se dedicaron a la detección de anticuerpos en el suero del paciente como un signo de infección y así a la identificación serológica del microorganismo. Sin embargo, hoy en día la sensibilidad y especificidad de los inmunoensayos permiten no solo la detección de anticuerpos contra una amplia variedad de organismos infecciosos incluyendo bacterias, parásitos, hongos y virus sino a la identificación del propio microorganismo. Aún más, proporcionan un medio para la detección y cuantificación de antígenos no infecciosos y anticuerpos de importancia clínica tales como la determinación del grupo sanguíneo, el VDRL, la determinación de la proteína C-reactiva, una prueba que señala un proceso inflamatorio agudo, la detección de antígenos asociados a tumores y la demostración de la hormona gonadotropina coriónica, una prueba diagnóstica del embarazo. Independientemente de la variedad de reacciones Ag-Ac usadas in vitro con propósito diagnóstico, hay dos principios que deben ser establecidos: un anticuerpo con especificidad conocida sirve como reactivo para la identificación del antígeno correspondiente y de igual manera un antígeno conocido sirve como reactivo para la identificación del anticuerpo correspondiente. Se ha desarrollado una gran variedad de métodos para demostrar y medir las reacciones antígeno-anticuerpo in vitro. Sin embargo de manera general las técnicas de inmunoensayo pueden dividirse en dos grupos: las que se ven afectadas por la concentración de Ag y Ac en la reacción y las que no se afectan por la concentración. Dentro del primer grupo se encuentran las reacciones de aglutinación y de precipitación. En el segundo se incluyen los ensayos que emplean al complemento, las pruebas de neutralización en las cuales se inhibe alguna propiedad del antígeno o del anticuerpo y especialmente los ensayos que dependen de antígenos o anticuerpos marcados con radioisótopos, con colorantes fluorescentes o con enzimas. Aunque existen técnicas modernas más sensibles las pruebas de aglutinación son muy usadas en muchas disciplinas del laboratorio clínico. La aglutinación es una manifestación secundaria de la reacción antígeno-anticuerpo. En la aglutinación el antígeno y el anticuerpo se unen para formar un agregado macroscópico fácilmente visible. La principal diferencia entre una prueba de precipitación y una de aglutinación es que en precipitación el antígeno es soluble (molecular) mientras que la aglutinación es agregación de partículas o una células. Por esta razón se necesita mucho menos antígeno para obtener una reacción de aglutinación visible que en la precipitación. La aglutinación se puede observar

4 sobre un portaobjetos a simple vista o con el microscopio, otro método es en un tubo de ensaye se puede detectar por la formación de grumos en la suspensión o viendo el patrón de sedimentación en el fondo del tubo. La reacción de aglutinación ocurre en dos etapas, combinación y agregación. La combinación o unión es extremadamente rápida, mientras que la agregación es mucho más lenta, sin embargo la velocidad puede incrementarse por incubación en baño serológico. También es la razón por la cual muchos ensayos incluyen instrucciones de agitar, centrifugar o mezclar frecuentemente. Como se comentó al inicio, el exceso de antígeno o anticuerpo pueden afectar las reacciones de aglutinación al inhibir la formación del agregado, esto se conoce como fenómeno de zona. La formación del agregado es máxima a una concentración óptima de antígenos y anticuerpos, mientras que un exceso de anticuerpos (prozona) o un exceso de antígenos (postzona) pueden causar la inhibición del agregado y por los tanto dar un resultado falsamente negativo a la prueba.

5 PRACTICA N 1 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO El conocimiento de las propiedades fisicoquímicas y de la infecto-contagiosidad de los viriones, permite definir las normas que en materia de seguridad, son necesarias para no correr ningún riesgo de adquirir aún en forma accidental, una infección por este tipo de partículas. Con base en lo anterior, se enlistan a continuación los reglamentos y normas que habrán de seguirse en el Laboratorio de Virología, con la finalidad de asegurar la integridad física de los alumnos, así como para mantener una organización adecuada para el desarrollo de las prácticas correspondientes. La hora de entrada tiene 10 minutos de tolerancia, pasado este tiempo, no se permitirá el acceso al laboratorio. Entrar al laboratorio con la bata puesta y abotonada. Colocar todo los artículos personales en la zona lateral o en los cajones de las mesa de trabajo. Al iniciar y finalizar las prácticas, lavarse las manos con agua y jabón desinfectante. Queda estrictamente prohibido comer, beber o fumar en el laboratorio, así como introducir algún objeto en la boca. La puerta del laboratorio debe mantenerse cerrada. Limpiar y desinfectar el área de trabajo antes y después de utilizarla. Permanecer en la zona de trabajo asignada para cada equipo. Comunicarse con sus compañeros solo en la medida indispensable. Antes de iniciar la práctica, leer y recordar la metodología a seguir de acuerdo con las indicaciones del profesor. Si se tienen dudas, es el momento para aclararlas. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra (rotura de material, derramamiento de suspensiones virales, etc.). Todo el material que se va a incubar o desechar, deberá colocarse en el sitio indicado por el profesor. Sea cuidadoso con el material y equipo que se le proporciona; el material de desecho no contaminado deberá depositarse en los contenedores correspondientes. En forma previa a su lavado, siempre se deberá desinfectar el material que se le proporcione en el laboratorio. Rotule todo el material que se va a incubar, con los siguientes datos: grupo, sección, equipo, nombre del alumno, así como fecha de entrada y salida. En general, las disposiciones anteriores tienden al cumplimiento de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, en la cual se establecen los requisitos para la separación, envasado, almacenamiento, recolección, transporte, tratamiento y disposición final de los Residuos Peligrosos biológico-infecciosos que se generan en establecimientos e instituciones relacionadas con el sector salud. En la NOM referida, se establecen además definiciones de interés para los laboratorios y áreas de microbiología, tales como:

6 Desinfección: Destrucción de microorganismos patógenos en todos los ambientes, materias o partes que pueden ser nocivos, por los distintos medios mecánicos, físicos o químicos contrarios a su vida o desarrollo, con el fin de reducir el riesgo de transmisión de enfermedades. Residuo peligroso biológico-infeccioso: El que contiene bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infección o que contiene o puede contener toxinas producidas por microorganismos que causan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente, que se generan en hospitales y establecimientos de atención médica. En adición, se consideran residuos peligrosos biológico-infecciosos los siguientes: La sangre Los cultivos y cepas almacenadas de agentes infecciosos Los cultivos generados en los procedimientos de diagnóstico e investigación, así como los generados en la producción de biológicos Los instrumentos y aparatos para transferir, inocular y mezclar cultivos Las muestras biológicas para análisis químico, microbiológico, citológico e histológico Los residuos anatómicos derivados de la atención a pacientes de los laboratorios Los equipos y dispositivos desechables utilizados para la exploración y toma de muestras Los objetos punzo cortantes usados o sin usar Los que han estado en contacto con pacientes o sus muestras clínicas durante el diagnóstico y tratamiento, incluyendo navajas, lancetas, jeringas, pipetas Pasteur, agujas hipodérmicas, de acupuntura y para tatuaje, bisturíes, cajas de Petri, cristalería entera o rota, porta y cubreobjetos, tubos de ensayo y similares. Con base en lo anterior, los residuos peligrosos infecto-contagiosos, deberán ser tratados por métodos físicos o químicos, los cuales: Deberán garantizar la eliminación de microorganismos patógenos Deberán volver irreconocibles a los residuos peligrosos biológico-infecciosos Deberán ser cremados, si se trata de residuos patológicos. El cumplimiento de las consideraciones señaladas con anterioridad, garantiza la seguridad que deberá observarse tanto para alcanzar los objetivos de las prácticas, como para su desarrollo en condiciones asépticas. Finalmente y dada la especificidad de especie que presentan los virus, en esta primera sesión de laboratorio se hará énfasis en que a través de las diferentes prácticas, se utilizarán únicamente suspensiones virales de tipo vacunal destinadas para uso veterinario, con la finalidad de evitar el más mínimo riesgo de infección hacia los estudiantes. CUESTIONARIO 1. Con ayuda de un esquema especifique, cuál sería el manejo que se la daría a materiales como jeringas, portaobjetos, pipetas, tubos y material con residuos de tejidos, desde que han sido utilizados para el análisis de la sangre hasta su destino final.

7 PRACTICA N 2 TOMA DE MUESTRA Obtención de Muestra de Sangre. Para efectuar análisis serológicos, las muestras de sangre pueden ser de sangre capilar o periférica y de sangre venosa. Sangre capilar o periférica. La sangre capilar o periférica es la que fluye después de aplicar una punción superficial cutánea. Se puede obtener de la yema del dedo. Algunas pruebas pueden realizarse con sangre capilar o periférica y se aconseja cuando no es posible obtener una muestra de sangre venosa o no se desea puncionar la vena. Sangre venosa. Esta muestra se obtiene por punción de una de las tres venas del pliegue del codo: la basílica, la cefálica o la mediana cubital. Se emplean jeringas desechables con agujas de tipo 21x32, 20x32 o el sistema para la extracción de sangre intravenosa al vacío Vacuntainer. Previamente se realiza la limpieza del área elegida con torunda y alcohol. Antes de puncionar se coloca el torniquete aproximadamente a 8 cm de distancia arriba del pliegue del codo. No debe olvidar soltarlo tan pronto empiece a obtenerse la muestra. La cantidad máxima de sangre a extraer será estrictamente la necesaria para las pruebas. Anticoagulantes. Los anticoagulantes más usados son el citrato de sodio, oxalato de sodio y EDTA. El citrato de sodio se emplea al 3.8% y el oxalato de sodio al 1.4%. Se usan en relación de una parte de anticoagulante por cada nueve partes de sangre, habitualmente se usan 0.25ml de la solución para completar a 2.5ml de volumen total con la muestra de sangre. El EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético) se utiliza al 10% y es uno de los anticoagulantes de elección para el trabajo de rutina. Manejo y conservación de la muestra. La muestra debe rotularse correctamente y separase según el caso en plasma o suero, y dependiendo del tipo de análisis debe analizarse inmediatamente o puede conservarse adecuadamente refrigerada entre 4 y 8ºC para el análisis posterior.

8 PRACTICA N 3 DILUCIONES Se les llama diluciones a las soluciones con concentración menor obtenidas al agregar volúmenes conocidos de diluyente a una solución de concentración conocida. Las diluciones se expresan en forma de una proporción, por ejemplo 1/10 (1:10) donde la primera cifra o numerador (1) corresponde al volumen de lo que se está diluyendo y la segunda cifra o denominador (10) al volumen total en que se encuentra. Así, una dilución 1/10 indica que se tiene un volumen de la solución original contenido o diluido en 10 volúmenes totales, de los cuales 9 corresponden al diluyente. Dado que en una dilución lo que se indica es la relación entre el volumen de la solución original y el volumen total en que se encuentra, una dilución 1/10 puede prepararse de diferentes maneras: Por ejemplo: 1 ml de muestra en 9 ml de diluyente 0.1 ml de muestra en 0.9 ml de diluyente 0.5 ml de muestra en 4.5 ml de diluyente En la práctica el cálculo de las diluciones se puede efectuar de dos maneras diferentes que cumplen ciertas expectativas, la dilución directa y la dilución en serie. Dilución directa. Para realizar una dilución directa se puede hacer uso de la siguiente expresión: 1/d=Vm/Vt donde 1/d= dilución Vm= volumen de muestra Vt= volumen total (volumen de diluyente + volumen de muestra) Ejemplo N 1 Lleve 5 ml de muestra a una dilución 1/10. Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/10 Vm=5 ml Vt=? Así: 1/10=5 ml/vt despejando Vt tenemos que Vt=10 x 5/1=50 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de muestra = 50-5 = 45 ml Ejemplo N 2 Prepare exactamente 200 ml de una dilución 1/50.

9 Sustituyendo los valores conocidos tenemos: 1/d=1/50 Vm=? Vt= 200 ml Así: 1/50=Vm/200 despejando Vm tenemos que Vm=200 x 1/50=4 ml volumen de diluyente = volumen total-volumen de muestra volumen de diluyente = 200-4=196 ml Sin embargo, las diluciones directas tienen el inconveniente de que cuando es necesario hacer una dilución alta por ejemplo 1/ , se desperdicia mucho reactivo o se incurre en un error de medición. Así, una dilución 1/ se prepararía con 1 ml de muestra y ml de diluyente o bien ml de diluyente y ml de muestra. Dilución seriada Este tipo de dilución soluciona los inconvenientes que presenta el calculo directo de las diluciones altas. Además, en microbiología permite el calculo de la población microbiana en la muestra de estudio, de la cual se toma una alícuota que se diluye en varios tubos y se siembra por vertido en placa. La diferencia entre la dilución de dos tubos consecutivo se conoce como factor de dilución, siendo 2, 4 y 10 los más usados. En el ejemplo de la dilución 1/ , la muestra se puede diluir 1/ 100 ( Vm= 0.1 ml + Vt= 10 ml) en un primer tubo y colocar 0.1 ml de esta dilución en un segundo tubo con 9.9 de diluyente. El segundo tubo tendrá una dilución 1/ 100, sin embargo como la muestra ya se encuentra diluída previamente 1/ 100, multiplicando sus denominadores tenemos: 1/ 100 x 1/ 100= 1/ En este caso el factor de dilución es de 100. Debe insistirse en que solo el primer tubo lleva la alícuota de la muestra sin diluir, los demás tubos toman la alícuota ya diluida del tubo previo. El número de tubos y las diluciones intermedias se plantean considerando el volumen de los tubos así como el volumen mínimo que se puede medir fácil y exactamente con las pipetas disponibles. Cómo lograr exactamente 30 ml de una dilución 1:2000?

10 PRACTICA N 4 OBSERVACION DE LEUCOCITOS (CUENTA DIFERENCIAL) Los cinco principales tipos de leucocitos son los neutrófilos (50-70%), los eosinófilos (1-5%), basófilos ( %), linfocitos (20-30%), y monocitos (2 6%). Por cuenta diferencial se entiende la determinación del porcentaje relativo de cada tipo de leucocito en una muestra de sangre. Se realiza en extendidos (frotis) preparados cuidadosamente y teñidos con colorantes tales como Wright, el cual tiñe el núcleo de los leucocitos de un color púrpura que facilita la diferenciación. MATERIAL Y EQUIPO Portaobjetos Lancetas desechables Algodón Colorante de Wright Solución reguladora ph 6.4 Microscopio PROCEDIMIENTO 1. A partir de la muestra de sangre preparar 2 extendidos (frotis) siguiendo las indicaciones del instructor. 2. Dejar secar completamente los frotis, colocar en un puente de tinción y cubrirlos (contar el número de gotas) con colorante de Wright. Dejar el colorante 1 minuto y añadir el mismo número de gotas de solución reguladora ph 6.4 durante 8 minutos. 3. Lavar suavemente la preparación por 30 segundos y secar el exceso de agua. 4. Cuando la preparación esté completamente seca, colocar una gota de aceite de inmersión y observar al microscopio. 5. Para facilitar la identificación consultar las láminas a color que ilustran los diferentes leucocitos.

11 PRACTICA N 5 DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO Alrededor de 1900 Karl Landsteiner descubrió que en el humano existen cuatro tipos de sangres con respecto a la presencia o ausencia de dos antígenos específicos denominados A y B. Estos cuatro grupos se conocen actualmente como tipos A, B, AB y O. Este último se caracteriza por la ausencia de los antígenos A y B. En 1940 Landsteiner y Wiener reportaron que el suero de conejo producido contra eritrocitos de mono Rhesus podía aglutinar los eritrocitos del 85% de una población caucásica. Este antígeno se designó inicialmente como factor Rh, posteriormente se encontró que existe como seis antígenos a los cuales Fisher y Race designaron con letras C, D, E, c, d, e. Uno de estos antígenos, el D es responsable de la condición Rh positivo. La tipificación de eritrocitos en el laboratorio se realiza con antisueros específicos contra los antígenos A, B y D, y puede realizarse por métodos en tubo o en portaobjetos. OBJETIVO Demostrar por medio de una reacción de aglutinación la presencia de los Ag eritrocitarios A, B y D. MATERIALES Y EQUIPO 1. Muestras de sangre con anticoagulante 2. Pipetas graduadas de 1 y 5 ml 3. Tubos de ensayo de 10 X 75 mm 4. Solución salina isotónica 5. Lancetas desechable 6. Aplicadores de madera o palillos 7. Sueros tipificadores anti-a anti-b anti-d (Rh) 8. Placa oscilatoria PROCEDIMIENTO Método en tubo 1. Se obtiene aproximadamente 5 ml de sangre venosa y se colocan en un tubo con EDTA (0.1 ml de EDTA al 1% por cada ml de sangre). Se centrífuga por 2 min. a 2000 r.p.m. para separar el plasma del paquete celular. 2. Se toman 0.1 ml del paquete celular y se resuspenden en 1.9 ml de solución salina para una suspensión aproximada del 5%. 3. Se marcan tres tubos de la siguiente manera: anti-a, anti-b y anti-d, y se agrega una gota del suero tipificador según corresponda. 4. Se agregan 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y se agitan suavemente. 5. Los tubos se centrifugan 1 min a 2000 r.p.m.

12 6. Se busca la presencia de aglutinación agitando suavemente los tubos. La aglutinación se reconoce por la formación de grumos. 7. Si la prueba en el tubo anti-d es negativa se realiza el siguiente procedimiento. 8. Se incuba a 37 C por 30 minutos, se centrífuga y se busca la aglutinación. 9. Si persiste la negatividad se lavan los eritrocitos 3 veces con 0.5 ml de solución salina y se elimina perfectamente el sobrenadante. 10. Se agrega una gota del suero de Coombs y se agita suavemente, se centrífuga y se busca la aglutinación Interpretación: Si aglutina en el paso 6 es Rh positivo Si aglutina en el paso 10 es D u Si persiste la negatividad es Rh negativo. Método en portaobjetos 1. Depositar 2 gotas de sangre en tres diferentes divisiones de un portaobjetos. 2. Agregar de izquierda a derecha una gota del antisuero anti-a, una gota de anti-b y una gota de anti-d respectivamente. 3. Mezclar los reactivos con un aplicador de madera diferente para cada gota. 4. Agitar suavemente en la placa oscilatoria. 5. Buscar la presencia de aglutinación. CUESTIONARIO 1. Cuál es la estructura química de los Ag A y B? 2. Elabore una tabla que muestre los Ag, Ac, fenotipo y genotipo de los grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh. 3. Puede una persona de grupo A y una B tener como descendencia a un hijo de grupo O? Explique

13 PRACTICA N 7 DETERMINACIÓN DEL TITULO DE ANTICUERPOS ABO DEL SUERO. El sistema de grupo sanguíneo ABO posee una característica única; la presencia de anticuerpos fuertemente reactivos en el suero de los que carecen de los antígenos correspondientes. Estos anticuerpos pertenecen a la clase IgM y son producidos en respuesta a una inmunización. Se dice que estos anticuerpos se producen de manera natural en base a que los inmunógenos son probablemente de origen bacteriano, dado que algunas bacterias presentan sustancias similares a los antígenos A o B. El título es una medida relativa de anticuerpos o antígenos en una reacción serológica. Se determina realizando a partir del suero problema diluciones seriadas. El título del anticuerpos A o B del suero se reporta como el recíproco de la máxima dilución en la cual es posible observar eritrocitos aglutinados. OBJETIVO Establecer a través de diluciones seriadas el concepto de título aplicado en las reacciones serológicas MATERIAL Suspensión de eritrocitos de grupo A o B al 5 % en SSI Suero (plasma) de grupo O Pipetas graduadas de 1 y 5 ml Tubos de ensayo de 10 X 75 mm Solución salina isotónica Lancetas desechable Aplicadores de madera o palillos Sueros tipificadores anti-a anti-b PROCEDIMIENTO 1. Colocar en una gradilla una serie de 6 tubos rotulados del 1 al 6 y se agregar 0.1 ml de solución salina cada uno de ellos. 2. Agregar 0.1 ml del suero problema al tubo n 1, mezclar bien y transferir 0.1 ml al tubo n 2 y así sucesivamente hasta el tubo n 6 del cual se desechan 0.1 ml. 3. Agregar 4 gotas de la suspensión de eritrocitos a cada tubo y mezclar. 4. Incubar a 37 C por 15 minutos, mezclan suavemente y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 1 minuto. 5. Desprender el botón suavemente y buscar la presencia de aglutinación.

14 INTERPRETACIÓN 1. El título de anticuerpos en el suero problema se determina como el recíproco de la dilución máxima en la que se observa aglutinación. 2. Además de la aglutinación se puede observar hemólisis, por lo que se debe comprobar la presencia de hemoglobina libre CUESTIONARIO 1. Cuál es la dilución en cada uno de los tubos? 2. Explique porqué puede variar el título de Ac. en la muestra para cada equipo 3. Existen los Ac anti-o naturales

15 PRACTICA N 8 PRUEBAS CRUZADAS El objetivo de una transfusión es el proporcionar al paciente (receptor) el tipo preciso de sangre. Por supuesto este objetivo es difícil de lograr, pero es posible aproximarse mucho si se realizan las pruebas correctas de hemaglutinación. En primer lugar, deben determinarse con exactitud los anfígenos de los grupos sanguíneos principales: el grupo ABO y el Rh del paciente, sobre la base de estos grupos se selecciona la unidad de sangre de grupo ABO y Rh compatible y se procede a efectuar las denominadas pruebas cruzadas mayor y menor. La prueba cruzada mayor, denominada prueba de compatibilidad, se realiza mezclando el suero del receptor con los eritrocitos del donador. Si se produce hemaglutinación, esta sangre no puede darse al receptor porque tiene anticuerpos capaces de reaccionar y destruir la sangre administrada. En la prueba cruzada menor, los eritrocitos del receptor son incubados con suero del donador y se observa si hay aglutinación. Si se produce hemaglutinación, la sangre del donador no debe administrase. En ambas pruebas una suspensión de los eritrocitos respectivos se mezclan con el suero y la mezcla se incuba a 37 C durante unos minutos. Después del periodo de incubación los eritrocitos se lavan para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos, y se añade el reactivo de Coombs (anti-globulina). MATERIAL Y EQUIPO Muestras de sangre con y sin anticoagulante Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 8 tubos de ensaye de 10 X 75 mm solución salina isotónica. Baño serológico Centrífuga Solución de albúmina bovina al 10% PROCEDIMIENTO 1. Se obtiene una muestra de sangre del donador y receptor y se procede igual a lo descrito en los incisos 1 y 2 de la práctica anterior. 2. Se disponen 4 tubos etiquetados como sigue: PM/S =Prueba Mayor en solución salina pm/s =Prueba Menor en solución salina PM/A =Prueba Mayor en albúmina pm/a =Prueba Menor en albúmina 3. Se agregan a cada tubo los siguientes reactivos en el orden indicado: PM/S. pm/s. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del donador 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de eritrocitos (al 5%) del receptor

16 PM/A. 2 gotas del suero del receptor + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del donador pm/a. 2 gotas del suero del donador + 4 gotas de albúmina + 1 gota de eritrocitos (al 5%) del receptor 4. Se mezclan bien y se incuban a 37 C por 30 minutos. 5. Se centrifugan 1 minuto a 2000 r.p.m. y se busca la presencia de aglutinación. 6. En caso de que no se presente la aglutinación, los tubos se centrifugan nuevamente y se descarta el sobrenadante. Se lava el paquete celular de cada tubo con 1 ml de solución salina y se centrifuga nuevamente descartando el sobrenadante. Repetir el lavado 2 veces. 7. Al paquete celular se le agrega un agota del suero de Coombs y se busca la presencia de hemaglutinación. Interpretación: Si hay aglutinación en cualquiera de los tubos, será indicativo de que hay incompatibilidad entre el posible donador y el receptor (paciente). Si no la hay, las sangres son compatibles. CUESTIONARIO. 1.- Qué significa una prueba cruzada positiva y una negativa? 2.- Qué nos indica la prueba mayor y menor? 3.- Qué factores pueden interferir en los resultados de una prueba cruzada? 4.- Qué características debe tener un donador sanguíneo ideal?

17 PRACTICA N 9 REACCIONES FEBRILES (DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO DE INFECCIÓNES BACTERIANAS) La aglutinación de células bacterianas con antisueros es una de las pruebas serológicas mas antiguas de la inmunología práctica. Se inició como un método para el diagnóstico de la infecciones bacterianas y fue propuesta por Widal en La pruebas de aglutinación bacteriana tienen dos aplicaciones principales en el diagnóstico ; las células bacterianas desconocidas pueden identificarse por medio de anticuerpos conocidos, o bien utilizando bacterias conocidas pueden identificarse los anticuerpos en el suero del paciente. La identificación bacteriológica completa del agente patógeno es un proceso que lleva tiempo (3 o más días), mientras se intenta el reconocimiento del agente es posible la identificación serológica. En la aglutinación de los antígenos bacterianos con sus anticuerpos portaobjetos produce un agregado macroscópico. MATERIAL Y EQUIPO 1. Muestras de sueros 2. Placa de vidrio marcada en 6 cuadros 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml 4. Pipeta Pasteur 5. Placa oscilatoria 6. Equipo con antígenos: O de Salmonella typhi H de Salmonella typhi H de Salmonella enteritidis paratyphi A H de Salmonella enteritidis paratyphi B Brucella abortus Proteus OX-19 PROCEDIMIENTO 1. En una placa de vidrio perfectamente limpia se depositan 0.08 ml del suero problema en cada una de las seis divisiones. 2. Se agrega una gota de cada antígeno comenzando por la izquierda arriba, respetando el orden establecido. 3. Se mezclan las gotas con palillos diferentes y se agita suavemente en la placa de rotación durante dos minutos. 4. La lectura se hace observando la aglutinación macroscópica. 5. Si aparece aglutinación con alguno de los antígenos, continuar con el siguiente paso. 6. Se toma otra placa y se depositan 0.08, 0.04, 0.02, 0.01, y ml del suero problema. 7. Se agrega una gota del antígeno seleccionado, se mezclan con un palillo y se revisa la presencia de aglutinación.

18 INTERPRETACIÓN: 1. Los volúmenes de suero empleados corresponden respectivamente a diluciones 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 y 1/ El titulo de anticuerpos del suero problema se reporta como el recíproco de la máxima dilución que muestra aglutinación. 3. La mayoría de los títulos mayores de 160 son presuntivos de infección. 4. La mejor indicación de una infección activa es un aumento en el título de dos determinaciones sucesivas con una diferencia de 5-7 días concomitantes a la infección. CUESTIONARIO 1. Qué enfermedades producen los agentes microbianos revisados? 2. Qué significado tiene el demostrar la presencia de Ac en el suero del paciente 3. Cuál es la razón de utilizar una suspensión de Proteus OX-19 para el diagnóstico de tifo?

19 PRACTICA N 11 FACTOR REUMATOIDE Y PROTEINA C REACTIVA Los factores reumatoides son anticuerpos dirigidos contra los determinantes antigénicos de la región Fc de las IgG. En personas sanas, estos anticuerpos pueden hallarse en baja concentración, sin embargo se encuentra aumentado en la mayoría de los pacientes con artritis reumatoide. La determinación del factor reumatoide se lleva a cabo con partículas de latex cubiertas de IgG. La Proteína C Reactiva forma parte de las proteínas de fase aguda, un conjunto de proteínas del suero cuya concentración aumenta de manera drástica durante el daño tisular, la infección o el estrés. No es específica de una enfermedad sino que es un indicador del proceso inflamatorio. MATERIAL Y EQUIPO 1. Muestras de sueros 2. Placa de vidrio oscuro marcada 3. Pipetas graduadas de 1 y 0.2 ml 4. Aplicadores de madera o palillos 5. Pipeta Pasteur 6. Reactivo de latex-fr 7. Reactivo de latex- Proteína C Reactiva 8. Solución amortiguadora de glicina-cloruro de sodio ph Solución salina isotónica 10. Placa rotatoria PROCEDIMIENTO Factor Reumatoiden (FR). Por el método de aglutinación en latex en placa, utiliza una suspensión estabilizada de partículas de latex sensibilizadas con IgG humana. 1. El suero se inactiva previamente calentando en baño serológico a 56 C por 15 min o 60 C por 1 min. Ya inactivado se diluye 1:20 con amortiguador de glicina-cloruro de sodio colocando 0.1 ml de suero y 1.9 ml del amortiguador. 2. Se coloca una gota de la dilución en la placa de vidrio oscura y se añade una gota del reactivo latex-fr. 3. Se mezcla y se agita suavemente en la placa rotatoria durante dos minutos. 4. Se busca la aglutinación macroscópica. 5. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640, las cuales se preparan con 0.5 ml de la dilución 1/20 en 0.5 ml del amortiguador para una dilución 1/40 y así consecutivamente. Proteína C Reactiva (PCR). Por el método de aglutinación en latex en placa. Utiliza una suspensión acuosa de partículas de latex recubiertas de anticuerpos específicos anti- Proteína C Reactiva.

20 1. El suero problema se diluye 1/5, 1/40 con solución salina isotónica y se coloca una gota de la dilución en una placa de vidrio oscuro. 2. Se añade una gota del reactivo latex-pcr se mezcla bien y se agita suavemente en la placa rotatoria por 3 min. 3. Se busca la aglutinación macroscópica. 4. La prueba semicuantitativa utiliza diluciones del suero a partir de 1/80. CUESTIONARIO 1. Por qué se inactiva el suero? 2. Explique el fundamento de cada una de las pruebas 3. Explique el significado clínico de una prueba FR positiva y el de una PCR positiva

21 PRACTICA N 12 DETERMINACIÓN DE ANTIESTREPTOLISINAS O (ASO) Las estreptolisinas son enzimas hemolíticas producidas por la mayoría de los estreptococos del grupo A, destruyen la membrana de los eritrocitos ocasionando la hemólisis. Este producto bacteriano es una de las muchas toxinas extracelulares y enzimas producidas por los estreptococos. En particular, la estreptolisina O recibe este nombre debido a que sensible al oxígeno, solo posee actividad en estado reducido, razón por la cual se le incorpora un reductor (el hidrosulfito de sodio) inmediatamente antes de usarla. En el laboratorio las ASO pueden determinarse por una reacción serológica de neutralización, en la cual si el suero del paciente contiene anticuerpos contra la enzima (antiestreptolisinas) neutralizarán su capacidad hemolítica y ocurrirá inhibición de la hemólisis. MATERIAL Y EQUIPO Muestras de suero Suspensión de eritrocitos al 5% Amortiguador para ASO (fosfatos ph 6.5) Estreptolisina O Baño serológico Centrífuga Pipetas graduadas de 1 ml y 5 ml 15 tubos de ensaye de 10 X 75 mm PROCEDIMIENTO 1. Preparar a partir del suero problema las siguientes diluciones iniciales: a) 1:10 con 0.2 ml del suero problema ml de solución amortiguadora b) 1:100 con 0.3 ml de la dilución 1: ml de solución amortiguadora c) 1:500 con 0.6 ml de la dilución 1: ml de solución amortiguadora 2. Rotular los tubos de ensaye con números del 1 al 12 y dos más como control (+) y control (-). 3. Preparar diluciones secundarias añadiendo primero el volumen de solución amortiguadora y posteriormente el volumen del suero diluido según se indica a continuación: Tubos N (+) (-) ml amortiguador Dilución 1:10 1:100 1:500 ml suero diluido Unidades Todd

22 4. Mezclar suavemente y añadir a cada tubo 0.25 ml de estreptolisina, EXCEPTO al tubo control (-). 5. Mezclar por agitación e incubar a 37 C por 15 min. 6. Añadir a cada tubo 0.25 ml de una suspensión de eritrocitos al 5%., mezclar e incubar a 37 C por 30 min. 7. Centrifugar los tubos a 2500 rpm por 2 min. 8. Comprobar la presencia de hemólisis completa en el tubo control (+) y la ausencia de hemólisis en el tubo control (-) 9. Determinar el título de antiestreptolisinas (unidades Todd) como el de la máxima dilución que no presenta hemólisis.

23 PRACTICA N 14 DETERMINACIÓN DE LA GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA Las pruebas de laboratorio para el diagnóstico del embarazo se basan en la determinación de la gonadotropina coriónica humana (hgc), hormona producida por la placenta y que puede detectarse tanto en el suero como en la orina. La excreción de hgc alcanza su máximo durante la duodécima a decimocuarta semana de gestación y a partir de entonces desciende de nivel. Hasta los años 60, las pruebas de embarazo eran bioensayos en los cuales la presencia de la hgc en el suero o en la orina se demostraba por su efecto en animales. Las primeras pruebas utilizaban ratones y conejos, las pruebas ulteriores ratas hembra o ranas. Actualmente estas pruebas han sido sustituidas por pruebas inmunológicas. Las pruebas inmunológicas dependen del anticuerpo anti-hgc. La presencia de hgc en el suero u orina se demuestra por un sistema indicador. Los ensayo de aglutinación denominadas de inhibición de la aglutinación consisten de eritrocitos de conejo o partículas de látex recubiertas con hgc. Cuando se realiza la prueba, el suero u orina de la paciente se incuban con el anticuerpo. Si existe hgc en la muestra, el anticuerpo es inactivado y los eritrocitos o partículas de látex no aglutinan. Si la muestra no contiene hgc, el anticuerpo permanece activo y se produce la aglutinación. Además de la aglutinación, existen otras técnicas inmunológicas para la determinación de la hgc, tales como los inmunoensayos enzimáticos (ELISA) y el radioinmunoanálisis (RIA), el cual requiere de equipo especial para su realización. Esta técnicas varían en su sensibilidad, esto es las pruebas inmunológicas son, más sensibles al detectar concentraciones menores de hgc, por ejemplo las pruebas con eritrocitos tienden a ser más sensibles que la que emplean partículas de látex. MATERIAL Orina del Paciente (10 ml) Solución salina isotónica (SSI) Equipo de diagnostico de hgc Pipetas serológicas de 1 ml PROCEDIMIENTO 1. Se filtran unos 5 ml de orina o se centrifuga a 3000 r.p.m. 5 minutos para precipitar el material insoluble. Se usa el filtrado o el liquido sobrenadante 2. Se diluye un volumen de orina en dos volúmenes de solución salina, por ejemplo 0.5 ml de orina y 1.0 ml de solución salina. 3. Se colocan en el tubo apropiado 0.25 ml de antisuero anti-hgc, se agregan 0.25 ml de la orina diluida y se agita suavemente. 4. Se agrega una gota de la suspensión de eritrocitos sensibilizados y se agita suavemente hasta lograr una suspensión homogénea.

24 5. Se coloca en una superficie libre de vibraciones o del calor. De preferencia en una gradilla con el espejo adecuado. 6. Efectuar la lectura 2 horas después. RECOMENDACIONES 1. Los residuos de orinas anteriores falsearan la prueba. 2. Tubos diferentes a los apropiados distorsionan la lectura 3. No deben mezclarse los goteros o tocar con ellos los tubos de ensayo. 4. Los reactivos deben agregarse en el orden establecido. INTERPRETACION Para la lectura se interpretan los esquemas celulares en el fondo del tubo de ensayo Prueba positiva = un botón claramente definido Prueba negativa = un tapiz difuso de células PRUEBA NEGATIVA PRUEBA POSITIVA

25 BIBLIOGRAFÍA 1. REGUEIRO JOSE R. Y LOPEZ LARREA CARLOS INMUNOLOGIA BIOLOGÍA Y PATOLOGÍA DEL SISTEMA INMUNE. 2ª EDICIÓN. EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA. 2. JANEWAY, CHARLES A. Y TRAVERS PAUL IMMUNOBIOLOGY THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE. 2ª EDICIÓN. CURRENT BIOLOGY-GARLAND. 3. ROITT, IVAN ESSENTIAL IMMUNOLOGY. 8ª EDICIÓN. BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS. 4. ROITT, IVAN IMUNOLOGIA FUNDAMENTOS. 9ª EDICIÓN. PANAMERICANA. 5. ROITT, IVAN. BROSTOFF JONATHAN Y MALE DAVID IMMUNOLOGY 4ª EDICIÓN. MOSBY. 6. ROITT, IVAN. BROSTOFF JONATHAN Y MALE DAVID INMUNOLOGIA 5ª EDICIÓN. EDICIONES HARCOURT. ESPAÑA 7. ABBAS, A. K. LICHTMAN A. H. Y POBER J. S INMUNOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR. 3ª EDICIÓN. INTERAMERICANA- McGRAW- HILL.