Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Relación entre las concentraciones de hormona antimülleriana y el número de embriones transferibles en hembras bovinas Vales, Carla E.; Recavarren, Mariana I.; Gual, Fernando.; Bianchi, Carolina. Agosto, 2016 Tandil
Relación entre las concentraciones de hormona antimülleriana y el número de embriones transferibles en hembras bovinas Tesina de la Orientación de Sanidad en Grandes Animales presentada como parte de los requisitos para optar el grado de Veterinario de la alumna: Vales, Carla Estefania. Tutores: Recavarren, Mariana I.; Gual, Fernando. Directora: Bianchi, Carolina. Evaluador: Callejas, Santiago.
Agradecimientos Quiero agradecer a mis padres por haberme dado la oportunidad de cumplir el objetivo de ser Veterinaria, en especial a mi mama por su esfuerzo y contención durante los años de carrera. Gracias a mis amigas y amigos por todas las experiencias vividas, sin ellos no hubiera aguantado estar tan lejos de mi lugar. Agradezco a Javier Soto y su familia por haberme dado un lugar en sus vidas haciéndome sentir muy acompañada en los buenos y malos momentos. También quiero agradecer a Nancy y Horacio por abrirme las puertas de su casa en Mar del Plata para poder hacer la residencia en esa ciudad, hermosas personas que siempre voy a recordar. Gracias a mi tutora Mariana Recavarren, a Ivana Viera y José Ignacio Ronchi por transmitirme parte de sus conocimientos y experiencias en tan poco tiempo. A Ricardo Alberio por su generosidad de proporcionar las muestras para poder realizar el experimento. Gracias a mi directora Carollina Bianchi por la paciencia y ayuda brindada. Finalmente gracias a Jarme, mi profesor de Porcinos en la secundaria, por encaminarme y darme ese impulso tan necesario para que fuera a estudiar a Tandil.
Resumen El objetivo del presente trabajo fue relacionar las concentraciones séricas de Hormona antimülleriana (AMH) tomada en el momento de realizar la inseminación con el número de embriones transferibles obtenidos en hembras bovinas sometidas a tratamientos superovulatorios. La concentración de AMH se determinó mediante la prueba de ELISA en sándwich por medio de un kit comercial para dosaje de AMH bovina. Los resultados obtenidos respondieron a una distribución lineal, por lo que se utilizó el valor de correlación. El valor obtenido fue cercano a 0,60, lo que indicó una moderada correlación entre el número de embriones transferibles y la concentración de AMH en suero. Se pudo observar que todos los animales con valores menores a 80 pg/ml tuvieron pocos embriones transferibles; y todos aquellos animales con valores mayores a 450 pg/ml tuvieron muy buena cantidad de embriones transferibles. El número de animales que se ubicaron en estos extremos fue bajo y, la correlación no explicó la totalidad de los datos. Por tanto, es necesario realizar nuevos trabajos con mayor número de animales y con muestras tomadas previas a iniciar el tratamiento superovulatorio para poder llegar a una conclusión definitiva en cuanto al rol de la AMH como predictor del número de embriones transferibles que dará una vaca donante. Palabras claves: Hormona Antimülleriana, ELISA, embriones transferibles.
Índice Introducción 1 Revisión bibliográfica 3 Control neuroendocrino del ciclo estral 3 Ciclo estral bovino 4 Superovulación 8 Técnica de diagnóstico ELISA (Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay) 12 Materiales y Métodos 13 Resultados 14 Discusión 16 Conclusión 19 Referencia bibliográfica 20
Introducción La superovulación y transferencia de embriones (Tecnología MOET) es la tecnología utilizada en la cría de ganado para aumentar el número de crías en hembras genéticamente superiores. Sin embargo, el número de embriones transferibles (embriones de buena calidad) no ha cambiado significativamente en los últimos 20 años y el uso de la tecnología MOET se acerca a una meseta (Rico et al., 2009). La principal limitación para el desarrollo de la tecnología MOET es la gran variabilidad en la respuesta a los tratamientos superovulatorios. En la actualidad, se ha establecido que la principal fuente de variabilidad es el estado de los folículos ováricos en el momento del inicio del tratamiento con FSH. Cuando se aplica un tratamiento de superovulación en vacas con pocos folículos pequeños creciendo se observa una respuesta ovulatoria baja al tratamiento y éstas producen un escaso número de embriones. Las mejoras en los tratamientos y el desarrollo de protocolos de control de las ondas foliculares han mejorado las respuestas pero no han eliminado las grandes diferencias entre los animales. Estudios al respecto han sugerido que diferencias intrínsecas entre animales en el desarrollo folicular causan variaciones marcadas de animal a animal en la magnitud de la respuesta superovulatoria (Monniaux et al., 2010). Una prueba predictiva para la selección de vacas que pueden producir alto número de embriones transferibles u ovocitos fecundables haría representar un gran avance en la tecnología MOET. En la actualidad, el recuento de folículos antrales por ecografía ovárica es la única manera de seleccionar buenas donantes de embriones, pero esta técnica requiere de personal entrenado y de un equipamiento especializado (Monniaux et al. 2010). Los perfiles endocrinos de gonadotrofinas, esteroides u otros compuestos, han demostrado ser de valor limitado en la predicción de la capacidad de las donantes de embriones en el ganado bovino. Recientemente, la atención se ha centrado en la hormona antimülleriana (AMH), brindando nueva información sobre el pool folicular y la respuesta a los tratamientos superovulatorios en bovinos. En esta 1
especie, como en otras, la hormona antimülleriana se expresa específicamente por células de la granulosa de folículos antrales pequeños y disminuye durante el crecimiento folicular terminal y atresia (Monniaux et al. 2010). La determinación de las concentraciones plasmáticas de hormona antimülleriana podría ayudar a predecir las respuestas superovulatorias y optimizar el costo/beneficio. En Argentina, no existen antecedentes sobre la medición de hormona antimülleriana para la selección de vacas donantes de alta producción de embriones transferibles. La presente tesina tiene como objetivo evaluar la relación entre las concentraciones séricas de hormona antimülleriana con el número de embriones transferibles obtenidos en hembras bovinas sometidas a tratamientos superovulatorios. 2
Revisión bibliográfica Control neuroendocrino del ciclo estral: El ciclo estral bovino está regulado por una interacción hormonal comandada por el eje hipotálamo-hipófisis-ovario-útero. Figura 1: Interacciones hormonales del eje Hipotálamo-Hipófisis-Ovario-Útero (Callejas, 2001). Las neuronas del hipotálamo producen la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH). Esta hormona difunde a los capilares del sistema porta hipofisiario y de aquí a las células de la adenohipófisis, lugar en el cual estimula la síntesis y secreción de la hormona folículoestimulante (FSH) y luteinizante (LH). La FSH es la responsable del proceso de estroideogénesis ovárica, crecimiento y maduración folicular y la LH interviene en el proceso de estroideogénesis ovárica, ovulación, formación y mantenimiento del cuerpo lúteo. Estas hormonas son secretadas a la sangre en forma de pulsos y son reguladas por el sistema tónico y el cíclico. El 3
sistema tónico produce el nivel basal circulante de las hormonas hipofisiarias, las que promueven el desarrollo de los elementos germinales y endocrinos de las gónadas. El sistema cíclico actúa por sólo 12 a 24 hs en cada ciclo estral, y tiene por función primaria provocar la ovulación. La neurohipófisis, parte posterior de la hipófisis, produce oxitocina. Esta hormona tiene varias funciones, dentro del ciclo estral y por ejemplo, interviene en el proceso de luteólisis (Callejas, 2001). En los ovarios se produce progesterona, estrógeno e inhibina. Los estrógenos son producidos por el folículo ovárico y tienen acción sobre diferentes órganos como son las trompas de Falopio, útero, vagina, vulva y el sistema nervioso central, en el cual estimulan la conducta del celo y, en el hipotálamo ejercen una retroalimentación negativa en el centro tónico y una retroalimentación positiva en el centro cíclico. La progesterona es producida por el cuerpo lúteo por acción de la hormona luteinizante. Esta hormona prepara el útero para la implantación del embrión y genera el ambiente apropiado para mantener la gestación. En cuanto al control del ciclo estral, la progesterona ejerce una retroalimentación negativa sobre el centro tónico (Callejas, 2001). El útero produce prostaglandina F 2α, hormona que interviene en la regulación del ciclo estral por su efecto luteolítico. A su vez interviene en los mecanismos de la ovulación y el parto (Callejas, 2001). Ciclo estral bovino: Los acontecimientos que comienzan en un celo y finalizan en el siguiente reciben el nombre de ciclo estral. El ciclo estral bovino tiene una duración promedio de 21 días (rango 17-25) y se produce en forma continua a lo largo del año (Callejas, 2001). El ciclo estral se divide en etapas que representan sucesos de comportamiento o gonadales. En términos generales, el ciclo estral bovino se divide en proestro, el cual posee una duración de 3 a 4 días, y es la etapa donde ocurre el desarrollo folicular que acontece después de la regresión del cuerpo lúteo y termina en el estro. Este último, dura de 6 a 24 horas y es el momento de receptividad sexual. 4
Se continúa con el metaestro, el cual es el periodo de desarrollo del cuerpo lúteo y tiene una duración de alrededor de 3 a 4 días, y finalmente el diestro que dura aproximadamente 14 días y es la etapa de maduración del cuerpo lúteo (Ungerfeld, 2002; Davidson y Stabenfeldt, 2009). Ovogénesis y foliculogénesis: La ovogénesis comienza en la vida fetal con la división mitótica de las ovogonias. En determinado momento, estas células se transforman en ovocitos y comienzan el proceso de meiosis, el cual permite obtener un óvulo (Callejas, 2001). Luego de comenzada la meiosis, los ovocitos son rodeados por células foliculares y se produce la detención de la misma en el estadio de diploteno, profase I, ovocito I, denominado estadio dictiático. Cuando se produce el pico preovulatorio de LH, sólo el ovocito contenido en el folículo preovulatorio reinicia su meiosis hasta el estadio de metafase II, ovocito II, estadio en el cual ovula y permanece así, hasta el momento de la fecundación. Se debe tener en cuenta que al momento del nacimiento, todas las hembras mamíferas nacen con una gran reserva de ovocitos los cuales declinan rápidamente a medida que se llega a la pubertad (Callejas, 2001). La foliculogénesis permite obtener un folículo preovulatorio o de DeGraff a partir de folículos primordiales. Este proceso comienza en la vida fetal, en la cual se genera la reserva de folículos primordiales (Callejas, 2001). Dinámica folicular bovina: En los bovinos se producen dos o tres ondas foliculares consecutivas por ciclo estral. En cada ola se produce el reclutamiento de una cohorte de folículos de la reserva ovárica total, y de éstos se selecciona un folículo dominante que continua creciendo y madurando mientras que los demás sufren atresia (Ptaszynska y Molina, 2007). Se pueden distinguir tres fases distintas en el desarrollo folicular: reclutamiento, selección y dominancia. 5
En cada onda folicular se produce el reclutamiento simultáneo de varios folículos (entre tres y seis) que crecen hasta llegar a un diámetro de 4-5 mm. A los pocos días del inicio de la onda folicular surge un folículo dominante, éste crece y se diferencia mientras que los demás folículos reclutados dejan de crecer y se atresian. Normalmente los folículos de las primeras ondas del ciclo regresionan pero, estos folículos podrían ovular si se les brindan las condiciones endocrinas adecuadas (Ptaszynska y Molina, 2007). El reclutamiento de olas de folículos Las ondas foliculares están precedidas de un pequeño pico de FSH. Los folículos que salen de la cohorte de descanso folicular contienen receptores específicos para FSH, y dependen de esta gonadotrofina para crecer (Ptaszynska y Molina, 2007). Selección del folículo dominante Uno de los folículos de la cohorte reclutada es seleccionado, una de las características para dicha selección podría ser su mayor capacidad para la producción de estradiol. El futuro folículo dominante expresa receptores para LH que permite que siga creciendo (Ptaszynska y Molina, 2007). Folículo dominante seleccionado. Tras su selección, el crecimiento, la actividad estrogénica y el plazo de vida de un folículo dominante son controlados por el patrón de pulsos de la LH (Ptaszynska y Molina, 2007). 6
Figura 2: Modelo esquemático de las ondas de crecimiento folicular y desarrollo del cuerpo lúteo en bovino (Rosales Torres, 2012.) Las primeras etapas de desarrollo folicular: activación de los folículos primordiales y crecimiento de los folículos preantrales. El conocimiento de los mecanismos que regulan la activación de folículos primordiales, el crecimiento de los mismos y la diferenciación del folículo preantral son de gran interés ya que permitiría la utilización del pool de folículos primordiales para mejorar la eficiencia reproductiva. El desarrollo folicular se puede dividir en tres etapas: la activación de los folículos primordiales, la transición a folículos secundarios y el desarrollo de los folículos secundarios a la etapa periantral (Fortune, 2003). Luego de estudios in vitro se ha demostrado que la activación de folículos primordiales en el ganado vacuno se produce sin el agregado de factores de crecimiento u hormonas. También se comprobó que existen factores inhibitorios para la salida gradual de folículos del pool de descanso (Fortune, 2003). Los folículos se forman cuando los ovocitos primarios están envueltos por una sola capa de células de la granulosa aplanadas. En el ganado bovino, la formación de 7
los folículos se produce durante la vida fetal, esta formación no se produce de manera sincrónica sino que el ovario fetal contiene folículos preantrales y antrales tempranos. La transición de folículos primordiales a la etapa primaria puede ser muy prolongada. La etapa secundaria comienza con el desarrollo de una segunda capa de células granulosas, progresa a través de la adición de hasta seis o siete capas de células y termina con el desarrollo gradual de una cavidad antral (Fortune, 2003). Numerosos estudios in vitro en diferentes especies han logrado dilucidar que existen diversos moduladores de la activación de folículos primordiales y crecimiento de los folículos preantrales (Fortune, 2003). Superovulación: El objetivo de la transferencia de embriones es obtener a partir de progenitores de alto valor genético el mayor número posible de descendientes utilizando el útero de receptoras de menor valor económico para llevar la gestación a término (Callejas, 2001). Para llegar a producir un número elevado de descendientes con alto valor genético, debe generarse en la hembra donante una estimulación ovárica adecuada mediante la administración de gonadotrofinas (Callejas, 2001). Un alto grado de imprevisibilidad en las respuestas superovulatorias todavía existe después de 35 años, lo cual afecta la eficiencia y rentabilidad de la transferencia comercial de embriones (Bo y Mapletoft, 2014). Se han desarrollado protocolos que controlan la emergencia de la onda folicular logrando obtener mejores resultados. Protocolos de tratamientos de superestimulación actuales La vida media de la FSH en la vaca es de 5 horas o menos, por éste motivo debe ser administrada dos veces al día para inducir superovulación con éxito. El protocolo habitual ha sido la aplicación cada 12 h vía intramuscular de FSH durante 4 o 5 días. Después de 48 a 72 horas de la iniciación del tratamiento se 8
administra PGF 2α para inducir luteólisis. Las ovulaciones comienzan entre 24 y 36 horas más tarde luego del estro (Bo y Mapletoft, 2014). Estudios recientes han indicado que la tasa de ovulación puede mejorarse en algunas donantes si la FSH es administrada durante 6 o 7 días. La mayoría de los protocolos de superestimulación han tenido éxito en la inducción de la superovulación pero, algunos han incorporado un dispositivo de progesterona al protocolo inicial, lo cual asegura que las donantes no entren en celo tempranamente (Bo y Mapletoft, 2014). Con el uso de la ecografía se ha demostrado que 8 a 12 días después del estro es el momento de la emergencia de la segunda onda folicular y una cohorte de folículos en crecimiento está presente en ese momento. Pero se ha observado que el día de la aparición de la segunda onda folicular varía según se traten ciclos estrales con dos o tres ondas (Bo y Mapletoft, 2014). La mayoría de los protocolos de superovulación utilizados en la actualidad implican la iniciación de tratamientos con FSH posteriores al control exógeno de la emergencia de la onda folicular. (Bo y Mapletoft, 2014) Manipulación de la emergencia de la onda folicular - Estradiol y progesterona. El protocolo más común para sincronizar la aparición de una nueva onda folicular para superestimulación consiste en la aplicación de 17β-estradiol o benzoato de estradiol más progesterona en el momento de la inserción del dispositivo intravaginal conteniendo progesterona. El estradiol suprime la liberación de FSH, lo que provoca la atresia del folículo dominante. Luego de que el estradiol es metabolizado sube el nivel de FSH y surge una nueva onda folicular, esto sucede 4 días después del tratamiento. Emerge una nueva cohorte de folículos de un tamaño entre 3 a 5 mm que crecen al mismo tiempo. - Ablación del folículo dominante. La eliminación del folículo dominante mediante ablación guiada por ultrasonido elimina el efecto supresor del 9
mismo provocando la emergencia de una nueva onda folicular. Los tratamientos se inician después de 1 a 2 días luego de la eliminación del folículo dominante. Este método es apropiado para centros de producción de embriones. - GnRH. Luego de la aplicación de GnRH se produce la ovulación y una nueva onda folicular surge. Sin embargo, esta nueva onda folicular surge sólo cuando la GnRH produce la ovulación, por lo tanto en fases aleatorias del ciclo estral los porcentajes de ovulación son muy variables. Se obtuvieron resultados más prometedores colocando un dispositivo de progesterona en las fases aleatorias del ciclo estral y, aplicando GnRH 2 o 3 días más tarde e iniciando los tratamientos de superestimulación luego de 1,5 a 2,5 días. La respuesta ovulatoria mejora debido a que la presencia del dispositivo con progesterona impide la ovulación de folículos maduros aumentando así la eficiencia de la GnRH. Un protocolo de superestimulación recomendado consiste en la administración de PGF 2 α en el momento de la inserción de un dispositivo con progesterona. Siete días más tarde (con el dispositivo en su lugar) se administra GnRH para inducir la ovulación del folículo persistente y la sincronización de la emergencia de la onda folicular. Los tratamientos de FSH se inician 36 horas después de la administración de GnRH (Bo y Mapletoft, 2014). Durante una onda folicular normal los folículos subordinados regresionan debido a la disminución de las concentraciones de FSH circulante causada por las secreciones de estradiol e inhibina por parte de la cohorte y especialmente del folículo dominante. Los folículos pequeños requieren de FSH para continuar su crecimiento, y se ha demostrado que los folículos de 1 mm de diámetro inician el crecimiento bajo la influencia de la FSH. Los tratamientos de superovulación se deben iniciar en presencia de folículos con un diámetro de 3 a 4 mm. Se han realizado estudios en los cuales se administraron dos veces al día durante dos días consecutivos pequeñas dosis de FSH para reclutar más folículos antrales de 10
1 mm de diámetro, con esto se logra llegar a folículos de 3 a 4 mm de diámetro al momento de iniciar el protocolo de superestimulación. Como alternativa, los dos días con FSH pueden ser reemplazados con una sola inyección de ecg. (Bo y Mapletoft, 2014). Número de folículos y la respuesta a la superovulación Se ha sugerido que el número de folículos presentes en el ovario en el momento del tratamiento con gonadotrofinas afecta la respuesta a la superovulación en el ganado. Identificaron dos clases de vacas que respondieron mal al tratamiento de superestimulación. El primer grupo tenía de 50 a 200 folículos en crecimiento por ovario, en comparación con 600 o más folículos en los ovarios de vacas que respondieron bien. El segundo grupo de vacas que no respondieron tenían un gran número de folículos pero muchos de ellos sufrieron atresia en el momento que se iniciaron los tratamientos. La segunda clase de vacas respondieron cuando el tratamiento se inició en el momento de la emergencia de la onda folicular a diferencia del primer grupo de vacas en las cuales la población de folículos no era suficientemente grande; esta condición no está sujeta a mejora (Bo y Mapletoft, 2014). Recientemente, varios estudios han demostrado que el número de folículos en las ondas foliculares son altamente variables entre los animales pero muy repetible dentro de los individuos. Se ha comprobado que el número máximo de folículos ha sido tan bajo como 8 folículos en algún ganado en comparación con ganado que han tenido 56 folículos. Se han informado diferencias en las respuestas de superestimulación entre vacas que tenían más de 30 folículos de 3 a 5 mm de diámetro en comparación con aquellas que tenían menos de 30 folículos. Por lo tanto podría ser posible seleccionar vacas donantes basándose en el número de folículos presentes en el surgimiento de la onda folicular detectado mediante ecografía. Se ha reportado que el número de folículos se asocia con las concentraciones séricas de la hormona antimülleriana (AMH). La hormona Antimülleriana es una glicoproteína que pertenece a la familia del factor de crecimiento β, que se produce en las células de la granulosa de todos los folículos 11
en crecimiento y es mayor la producción en los pequeños folículos antrales, que contribuyen a los niveles endocrinos de AMH. En vacas y cabras los niveles fueron muy variables entre los individuos pero característico de cada animal durante un periodo de tiempo. Por lo tanto, podría ser posible evaluar la reserva de folículos gonadotrofina-sensibles en el ovario. Rico et al., 2009 han demostrado una correlación entre la producción de AMH y la respuesta superovulatoria en vacas donantes, se ha sugerido que serviría para diferenciar entre vacas que producen más o menos de 10 embriones transferibles (Bo y Mapletoft, 2014). Técnica de diagnóstico ELISA (Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay): Una de las técnicas utilizadas para determinar concentraciones de hormonas es la técnica de ELISA. Existen diversas variaciones de la técnica de ELISA, pero la más utilizada es la denominada ELISA en sándwich la cual utiliza dos anticuerpos reactivos con diferentes epitopes del antígeno cuya concentración se desea determinar (Abbas et al., 2012). La técnica de ELISA en sándwich se utiliza para identificar un antígeno específico de la muestra. La superficie de lo pocillos se prepara con una cantidad límite de anticuerpos conocida, para capturar el antígeno. Después de la unión no específica se bloquean los sitios libres de la placa utilizando albúmina de suero bovino. Se agrega la muestra a la placa. A continuación se añade anticuerpo primario específico para el antígeno. Luego se agrega anticuerpo secundario ligado a enzimas, que se unen al anticuerpo primario, conjugados anticuerpoenzima no unido se eliminan mediante un lavado. Se añade el sustrato que es enzimáticamente convertido y genera un color que puede ser cuantificado (Gan y Patel., 2013). 12
Materiales y Métodos El presente trabajo se realizó en noviembre del año 2013, en el Área de Veterinaria del Fares Taie Instituto de análisis, de la ciudad de Mar del Plata. Las muestras de suero fueron obtenidas de 34 vacas de raza Aberdeen Angus luego de ser tratadas con dosis diferentes de hormonas comerciales (Foltropin y Pluset ) con el objetivo de estimular la superovulación, antes de la inseminación de las mismas, pertenecientes a un establecimiento privado de la provincia de La Pampa. La extracción de sangre se realizó el mismo día de la inseminación artificial, las muestras se centrifugaron y el suero fue almacenado a una temperatura de 18 C hasta su análisis. Los datos fueron brindados por el Dr. Ricardo Alberio mediante planillas en las cuales figuraba fecha de extracción de sangre, número de vaca y número de embriones transferibles. La determinación de AMH se realizó por la prueba de ELISA en sándwich por medio de un único kit comercial para dosaje de AMH bovina (Bovine AMH Elisa, AL-114, AnshLbas ); siguiendo el procedimiento indicado por el fabricante. Para la realización de la prueba de ELISA en sándwich se utilizaron los siguientes materiales: - Agua destilada o desionizada. - Pipeta automática 10-100 microlitros. - Tips 10-100 microlitros. - Pipeta automática 100-1000 microlitros. - Tips 100-1000 microlitros. - 7 tubos khan. - Un vortex. - Un shaker. - Lector de densidad óptica (SIRIO plus SEAC). 13
Se siguieron los pasos que se encuentran detallados en el Kit. Luego de realizar la lectura de las muestras se calculó la densidad óptica para el calibrador, control y muestra. Se graficó el logaritmo de la densidad óptica para cada calibrador en el eje y versus el logaritmo de la concentración de AMH (pg/ml) en el eje x utilizando una curva cúbica de regresión. Se determinó la concentración de AMH de las muestras mediante la curva de calibración. Todas las muestras se determinaron en un único ensayo y el coeficiente de variación intraensayo fue menor a 11% para muestras con concentraciones comprendidas entre 27 y 765 pg/ml. Se utilizó el proc.reg del paquete estadístico SAS para determinar el grado de relación entre el número de embriones transferibles y las concentraciones de AMH determinadas. 14
Resultados Los resultados obtenidos en este trabajo respondieron a una distribución lineal de datos, por lo cual se utilizó el valor de correlación. En este estudio los valores de correlación fueron cercanos a 0,6 lo que indicó una moderada correlación entre el número de embriones transferibles y la concentración de la AMH. Debe tenerse en cuenta que la mayoría de los datos se ubican en la zona difusa en donde la correlación no explica la totalidad de los datos. En la presente Tesina se trabajó con el dato de embriones transferibles debido a que es lo que resulta de importancia en los sistemas productivos. En la siguiente tabla se muestra que los animales utilizados brindaron entre 0 a 37 embriones con posibilidades de ser transferidos. Tabla 1. Producción de embriones transferibles y concentración de AMH (pg/ml) obtenidos de hembras bovinas superovuladas. N de orden N pocillo Caravana Embriones transferibles pg/ml de AMH 1 21 1266 0 380,4 2 28 295 0 209,6 3 2 1 1 123,2 4 30 2 1 233,5 5 1 435 2 34,0 6 6 2622 2 180,4 7 11 1654 2 201,1 8 17 2658 2 178,7 9 24 1650 2 208,5 10 4 6 3 71,1 11 23 434 3 33,7 12 32 2402 3 74,4 13 9 1784 4 198,7 14 19 2988 4 45,0 15 3 3130 5 167,5 16 10 921 5 434,5 17 25 192 5 60,3 18 26 981 5 136,4 19 18 2626 6 168,1 20 7 2642 7 91,2 21 20 1264 7 239,0 22 22 1493 7 195,1 23 14 2624 8 233,5 15
24 33 1019 8 268,9 25 27 228 9 83,6 26 5 1055 11 308,5 27 16 2872 11 244,5 28 34 1396 11 140,2 29 15 X230 12 200,0 30 12 42 13 241,7 31 8 2226 16 241,5 32 13 6X 18 737,1 33 29 856 23 291,1 34 31 2610 37 603,5 Grafico 1. Relación entre las concentraciones de AMH y el número de embriones transferibles obtenidos de hembras bovinas superovuladas. 16
Discusión Los resultados de este trabajo brindan evidencia de que existe una correlación positiva media entre la concentración sérica de AMH y la producción de embriones transferibles por parte de vacas donantes sometidas a tratamientos superovulatorios. Si bien las concentraciones séricas de AMH no siempre estuvieron en relación con el número de embriones transferibles, se puede observar que los valores menores a 80 pg/ml se correlacionaron con animales que dieron menos de 5 embriones transferibles. Sin embargo, hubo animales que dieron pocos embriones transferibles y tuvieron concentraciones séricas superiores a ese valor. También es importante destacar que los animales con valores superiores a 450 pg/ml tuvieron una elevada producción de embriones transferibles, por encima de 18, aunque los que se ubican en este extremo son muy pocos. Estos resultados coinciden parcialmente con los obtenidos en el trabajo experimental realizado por Danielle Monniaux et al. (2010), en el cual se asignaron las vacas donantes a grupos distintos en función de la concentración de AMH determinada por el Active MIS/AMH ELISA Kit en una sola muestra, obtenida independientemente de la fase del ciclo estral de las vacas donantes. Estos autores observaron que había una correlación positiva entre la concentración de AMH de las vacas donantes y el número de embriones obtenidos por vaca. La asignación de las vacas donantes a diferentes grupos según la concentración de AMH puso en evidencia que las vacas con concentraciones plasmáticas de AMH entre 100 200 pg/ml y mayores a 200 pg/ml produjeron mayor cantidad de embriones transferibles que las vacas con valores menores a 100 pg/ml de AMH. Por su parte, Rico et al. (2009) investigaron las relaciones entre las concentraciones de AMH en plasma, las poblaciones foliculares y las respuestas a los tratamientos superovulatorios. Las concentraciones de AMH medidas en plasma en T0 (antes de la aplicación del tratamiento superovulatorio) fueron altamente correlacionadas con los números de folículos pequeños y medianos 17
detectados por ecografía en T0 y el número de folículos grandes en TE (tiempo del estro). También encontraron correlaciones significativas en los números de cuerpos lúteos en TL (fase luteal). Estos investigadores concluyeron en la existencia de una fuerte relación entre las concentraciones endocrinas de AMH y el número de folículos sensibles a gonadotrofinas en los ovarios de las vacas; en nuestro trabajo se obtuvo una correlación moderada entre la concentración de AMH y el número de embriones transferibles obtenidos. Si bien, según lo observado en la bibliografía, hay una correlación positiva entre el nivel de AMH entre las distintas fases del ciclo estral; los mismos varían en las distintas fases. Por lo tanto, para una correcta interpretación de los resultados de las concentraciones de AMH, se sugiere extraer sangre antes de la aplicación del tratamiento superovulatorio. En este punto, la obtención de las muestras en nuestro trabajo se realizó luego de aplicar el tratamiento superovulatorio, por lo que es necesario realizar nuevos ensayos con el fin de lograr una correcta interpretación de los resultados tomando las muestras antes de aplicar el tratamiento superovulatorio. 18
Conclusión Como conclusión, según los datos que se obtuvieron en este trabajo, la concentración sérica de Hormona Antimúlleriana, al momento de la inseminación artificial, tiene una correlación moderada con el número de embriones transferibles que se obtienen en hembras bovinas sometidas a tratamientos superovulatorios. Es necesario realizar nuevos trabajos con muestras tomadas en otros momentos y con un número mayor de animales estudiados para poder llegar a una conclusión definitiva en cuanto al rol de la AMH como predictor del número de embriones transferibles que dará una vaca donante. 19
Referencia bibliográfica - Bó, G. A., Mapletoft, R. J. (2014). Historical perspectives and recent research on superovulation in cattle Theriogenology 81, 38-48. - Callejas, S. (2001). Fisiología del ciclo estral bovino, pp 37 60. Palma, G.A. (eds) Biotecnología de la Reproducción. - Davidson, A.P.; Stabenfeldt, G.H. (2009). Reproducción y lactación,pp 465-525. In: J.G. Cunningham; B.G. Klein (Eds). Fisiología Veterinaria. 4ta edición. Elsevier Saunders. Amsterdam. - Fortune, J. E. (2003). The early stages of follicular development: Activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal ReproductionScience78, 135-163. - Monniaux, D., Barbey, S., Rico, C., Fabre, S., Gallard, Y., Larroque, H. (2010). Anti-Müllerian hormone: a predictive marker of embryo production in cattle? Reproduction, Fertility and Development, 22 (7), 1083-1091. - Ptaszynska, M., Molina, J.J. (2007). Compendium de reproducción animal. Intervet. - Rico, Ch. (2009). Anti- Müllerian Hormone is an Endocrine Marker of Ovarian Gonadotropin- Responsive Follicles and Can Help to Predict Superovulatori Responses in the Cow. Biology of reproduction 80, 50-59. - Rosales Torres, A.M, Guzmán Sánchez, A. (2012). Role of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptors during the ovarian cycle. Review. Rev. Mex. de Ciencias Pecuarias, 89-111. - Ungerfeld, R. (2002). Control endocrino del ciclo estral, pp 41-55. In: R. Ungerfeld (Ed.) Reproducción en los animales domésticos. Tomo I. Melibea ediciones. Montevideo, Uruguay. 20
- Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. (2012). Técnicas de laboratorio usadas con frecuencia en inmunología, pp 513-514. Inmunologia celular y molecular. 7 ma Edición. - Gan, S. D.; Patel K. R. (2013). Enzyme Immunoassay and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Journal of Investigative Dermatology 133. 21