UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA

UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA EL ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL INMUNOENSAYO EN EL DIAGNÓSTICO DE INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA-1 TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS MÉDICAS PRESENTA RODOLFO JOSÉ OCHOA JIMÉNEZ ASESORES BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ SERGIO ADRIAN MONTERO CRUZ COLIMA, COLIMA, MÉXICO. JULIO DEL 2009

CARTA DE TERMINACIÓN DE TESIS Colima, Colima, México. Miércoles, 29 de julio del 2009 A QUIEN CORRESPONDA: Por este medio SE HACE CONSTAR que el alumno RODOLFO JOSÉ OCHOA JIMÉNEZ, quien cursa el último semestre de la MAESTRÍA EN CIENCIAS MÉDICAS en esta UNIVERSIDAD DE COLIMA, ha terminado satisfactoriamente el proyecto y manuscrito de TESIS requeridos para acreditar dicho posgrado. Sin otro asunto que tratar, quedamos a sus órdenes para cualquier aclaración. BENJAMÍN TRUJILLO HERNÁNDEZ ASESOR DE TESIS SERGIO ADRIAN MONTERO CRUZ ASESOR DE TESIS

AGRADECIMIENTOS y juro que consideraré a mis maestros como a mis padres y a sus hijos como a mis hermanos Hipócrates de Cos Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Becario con número de registro 218491)

DEDICATORIA A mis hijos Por soportar mi ausencia y festejar mi presencia. Ustedes son la cura para mis momentos de frustración. A mi esposa Por tu motivación constante y por las lecciones de excelencia se hace bien o no se hace. A mi madre Por las lecciones de amor.

ÍNDICE GENERAL RESUMEN... 7 ABSTRACT:... 8 INTRODUCCIÓN...9 MARCO TEÓRICO... 10 JUSTIFICACIÓN... 23 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 24 HIPÓTESIS 24 OBJETIVOS..25 MATERIAL Y MÉTODOS... 26 ASPECTOS ÉTICOS.32 RESULTADOS... 33 DISCUSIÓN... 39 CONCLUSIONES... 42 RECOMENDACIONES O PERSPECTIVAS... 43 ANEXOS... 45 ANEXO 1. FORMATO DE CAPTURA DE DATOS.45 ANEXO 2. APROBACIÓN POR COMITÉ DE INVESTIGACIÓN... 46 ANEXO 3. PRUEBAS DE LABORATORIO... 47 BIBLIOGRAFÍA... 50

ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS FIGURA 1. PREVALENCIA MUNDIAL DE LA INFECCIÓN POR VIH... 10 FIGURA 2. PRINCIPIO BÁSICO DE LOS INMUNOENSAYOS... 16 CUADRO 1. ANTÍGENOS DE INMUNOENSAYOS PARA VIH... 18 CUADRO 2. CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS... 18 CUADRO 3. CRITERIOS DE POSITIVIDAD DEL WESTERN-BLOT.... 19 FIGURA 3. ALGORITMO DIAGNÓSTICO ACTUAL DE LA INFECCIÓN POR VIH.... 20 FIGURA 4. FLUJOGRAMA DE LOS PACIENTES DEL ESTUDIO... 34 CUADRO 4. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE LOS PACIENTES EN ESTUDIO... 35 FIGURA 5. DISTRIBUCIÓN DEL ÍNDICE DE REACTIVIDAD EN LA POBLACIÓN ESTUDIADA... 36 FIGURA 6. CURVA DE CARACTERÍSTICAS OPERATIVAS DEL RECEPTOR... 37 CUADRO 6. COMPARACIÓN DE DIFERENTES PUNTOS DE CORTE... 38 FIGURA 7. ALGORITMO DIAGNÓSTICO PROPUESTO, QUE INTEGRA EL ÍNDICE DE REACTIVIDAD DEL INMUNOENSAYO PARA VIH... 44

RESUMEN INTRODUCCIÓN: El diagnóstico de la infección por VIH inicia en laboratorio con la detección de anticuerpos al VIH mediante inmunoensayos (IE). Los IE para VIH se interpretan usualmente en forma cualitativa (positivo o negativo), pero se genera un resultado cuantitativo: El S/CO o índice de reactividad de cada muestra. Se recomiendan pruebas confirmatorias en pacientes con IE a VIH positivo. OBJETIVO: Determinar si el S/CO predice resultado verdadero positivo y evita pruebas confirmatorias. MÉTODOS: En diseño de prueba diagnóstica, se analizaron pacientes con resultados positivos IE para VIH, de tercera generación, realizado en el Laboratorio Estatal de Salud Pública de Colima. Se realizó análisis de Características Operativas del Receptor. El estándar de oro fue western blot positivo y/o prueba de ácidos nucleicos con resultado 2000 UI/mL. RESULTADOS: Se incluyeron 393 pacientes. Se determinó resultado verdadero positivo en 378/393 muestras (96.2%), mientras que 15/393 (3.8 %) son falsos positivos. CONCLUSIONES: Un índice S/CO 11.6 posee valor predictivo positivo de 100% para infección por VIH-1. - 7 -

ABSTRACT BACKGROUND: HIV infection is currently a pandemic disease. Laboratory diagnosis starts with HIV antibodies test by immunoassays (IA). Despite qualitative interpretation of IA (e.g. positive or negative), a quantitative result is generated: The S/CO ratio or reactivity index of each individual sample. Standard practice is performing supplemental testing in every positive HIV IA. OBJECTIVE: To assess if the S/CO ratio can predict true positive HIV result. METHODS: In a diagnostic test design, clinical and laboratory records from all patients with positive HIV third generation IA, performed in Public Health Laboratory of Colima, were reviewed. Receiver Operative Characteristic analysis was carried out. Gold Standard was positive WB and/or nucleic acid test with result 2000 IU/Ml. RESULTS: 389 patients were included, and true positive result was determined in 378/393 (96.2%) patients, whereas 15/393 (3.8 %) results were false positive. CONCLUSIONS: An S/CO ratio 11.6 is associated with positive predictive value of 100% for HIV infection. - 8 -

INTRODUCCIÓN La infección por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) afecta aproximadamente a 34 millones de personas en el mundo (1). El diagnóstico por laboratorio se inicia mediante inmunoensayos (IE) diseñados para la detección de anticuerpos sanguíneos dirigidos al VIH (2-4). Aunque habitualmente los IE para VIH se interpretan en forma cualitativa (reactivo-positivo o no reactivo-negativo), en el proceso de laboratorio se genera un resultado cuantitativo: el índice de reactividad (IR) de cada prueba individual, llamado en inglés signal to cutoff (S/CO) ratio. El IR es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos detectados. Todas las pruebas con IR 1 se consideran reactivas (positivas) y se recomienda la realización de pruebas confirmatorias (5). Usualmente, el resultado cualitativo del IE se interpreta sin tomar en cuenta el cuadro clínico, el IR y otros factores que afectan la probabilidad de infección por VIH. En México, se recomienda confirmación por Western Blot en todas las muestras reactivas en el IE para VIH (6). Este es el paradigma de diagnóstico y tal enfoque incrementa el costo y el tiempo necesarios para confirmar la infección por VIH. La carga impuesta por la infección por VIH a los países y a los sistemas de salud es enorme y puede incrementarse aún más. Algunas organizaciones, como el Colegio Americano de Médicos han empezado a recomendar que el escrutinio de la infección por VIH sea rutinario, incluso en poblaciones de bajo riesgo (7). Esto genera un aumento del empleo de recursos destinados al diagnóstico de la infección por VIH. La optimización del diagnóstico de infección por VIH (mayor rapidez y menor costo) es necesaria por los beneficios derivados del uso razonado de las pruebas de laboratorio. Por ejemplo, la sobrevida y la vida libre de secuelas dependen del diagnóstico temprano y tratamiento oportuno de los pacientes con infección por VIH (2,4,8). Se ha reportado que el IR del IE para VIH puede ser útil en la decisión de realizar pruebas confirmatorias (9-12). Si este enfoque se confirma, los IE a VIH podrían ser empleados como prueba única para la confirmación diagnóstica, al menos en los pacientes con probabilidad pre-prueba elevada. - 9 -

MARCO TEÓRICO El primer caso de infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se reportó en 1981; desde entonces la infección por VIH ha adquirido proporciones epidémicas (2). Según los datos de ONUSIDA, en diciembre de 2006, vivían en el mundo cerca de 34 millones de personas infectadas por VIH. La prevalencia mundial se duplicó en tan solo 10 años (19.9 millones en 1995). En el año 2006 la mortalidad acumulada se estimó en 2.9 millones. Se reportan casos de infección por VIH en todos los países del mundo (figura 1) y afecta principalmente a personas económicamente activas (2-4); Por su diseminación mundial, la falta de tratamientos curativos hasta la actualidad, el curso crónico y su considerable morbilidad y mortalidad, la infección por VIH es la más devastadora de las pandemias actuales. Figura 1. Prevalencia de la Infección por VIH en el Mundo. (Tomado de UNAIDS, en www.who.org). - 10 -

En México, hasta noviembre del 2008 se habían notificado poco más de 150,000 personas con infección por VIH. La prevalencia en adultos mexicanos es de 0.1-0.3% (13-15). De hecho, el grupo etáreo más afectado por frecuencia y por mortalidad, es el de 15-45 años (16). La distribución de la prevalencia en los distintos grupos de la población refleja los mecanismos de transmisión; Las vías de transmisión de la infección por VIH son (2-4, 16): 1. Sexual. Es la vía más común de infección, en el mundo; en México este modo de contagio es responsable del 90% de los casos acumulados y dos terceras partes de todos los casos se atribuyen al contacto sexual entre hombres homosexuales. 2. Sanguínea. Aporta 4-5% de los casos en México; específicamente se asocia a uso compartido de agujas para drogas intravenosas; en menor porcentaje, se reportan casos por contagio ocupacional, transfusión y trasplante de órganos. 3. Perinatal. En México, constituye la principal vía de contagio en menores de 15 años. PATOGENIA Los agentes causales son miembros de la familia retroviridae (Retrovirus). Todos los retrovirus se caracterizan por poseer enzimas que posibilitan el proceso de retro-trascripción, es decir, la generación de ADN a partir de ARN (2). La retro-trascripción es el mecanismo fundamental para la replicación y patogenia de los retrovirus. Se conocen 4 retrovirus que causan enfermedad en el ser humano: Los virus linfotrópico T humano I y II (HTLV I y II) que son llamados virus transformantes y, el VIH-1 y VIH-2, que son virus citopáticos (3,17). El VIH 1 y 2 se han identificado como causantes de inmunodeficiencia en el humano. En México, la principal causa de enfermedad por VIH es el VIH 1; en nuestro país, la infección por VIH-2 es rara (18). El VIH-1 es una partícula esférica, de 80 a 100 nm, con una estructura de 3 capas: La interna o nucleoide, un nucleocápside icosaédrico y una envoltura derivada de la célula hospedera. El genoma viral es ARN de cadena única, polaridad positiva y aproximadamente 9.6 kilobases (2). El genoma del VIH-1 incluye 3 genes principales y 6 genes adicionales. Los genes principales se denominan gag (Del inglés group antigen), pol (Polimerasa) y env (Envoltura); - 11 -

Los genes gag y env codifican las glucoproteínas y proteínas de la nucleocápside y membrana viral; el gen pol codifica la transcriptasa reversa y otras enzimas. Los genes adicionales se denominan vif, vpu, vpr, tat, rev y nef; Sus funciones son diversas y algunas aún no determinadas (3). Una de las glucoproteínas codificada por el gen env, la gp120 es requerida para el ingreso del VIH-1 a las células humanas; la gp120 se une a los receptores CD4 en las membranas celulares del hospedero. El receptor CD4 es una glucoproteína monomérica de 58 kda que se encuentra en la superficie celular del 60% de los linfocitos T, en los precursores de células T de la médula ósea y timo, en los monocitos, macrófagos, eosinófilos, células dendríticas y microglia. Una porción extracelular del receptor CD4 se une a la gp120 del VIH- 1 y posibilita la entrada de los viriones a las células humanas (7-9). Una vez que el virión entra a una célula se libera de su envoltura y ocurre la retro-transcripción, la cual genera nuevos viriones empleando las enzimas celulares; Se calcula que se producen al día hasta 10 9 viriones por paciente (19). Por otra parte, la activación del receptor CD4 por la gp 120 induce apoptosis (4). Debido a esto, un acontecimiento central en la patogenia de la infección por VIH-1 es la disminución progresiva del conteo sanguíneo de linfocitos T CD4+. La reducción del conteo sanguíneo de células CD4+ se asocia con inmunodeficiencia, tiene utilidad clínica y se acompaña de incremento de la replicación de VIH-1 (2,19). MANIFESTACIONES CLÍNICAS En la infección por VIH se pueden distinguir cuatro estadios clínicos: 1. Transmisión viral. Ocurre cuando los viriones presentes en el fluido corporal (Por ejemplo: Sangre o semen) de una persona infectada con el VIH, son inoculados en el tejido corporal de otra persona previamente sana. Los factores que influyen en el establecimiento de la infección por VIH son la cantidad de viriones inoculados, la presencia de células con receptores de membrana CD4 y la exposición de tejido subcutáneo o submucoso (2,3). 2. Infección primaria o aguda por VIH (o síndrome retroviral agudo): Se manifiesta 1-4 semanas después de la transmisión viral, como una enfermedad febril aguda, autolimitada y con datos clínicos de afección linfática. Suele presentarse un nivel elevado - 12 -

de RNA viral en sangre mientras que los anticuerpos sanguíneos al VIH pueden ser indetectables o encontrarse a baja concentración; los anticuerpos aumentan cuando la viremia desciende. El 60-90% de los pacientes presentan estas manifestaciones clínicas (20). 3. Latencia clínica: Periodo asintomático durante el cual los individuos generalmente no muestran síntomas ni signos, excepto por linfadenopatía en algunos casos. A pesar de la ausencia de datos clínicos, la replicación viral se mantiene estable y origina la destrucción progresiva de linfocitos T con marcadores de membrana CD4 (CD4+) (4). 4. Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA): Es un estado de inmunosupresión originado por el VIH y puede demostrarse en forma clínica y para-clínica. Generalmente se presentan enfermedades oportunistas y se reduce el conteo sanguíneo de CD4+ por debajo de 200/µL (2-4,18). El Centro para el control de Enfermedades en los Estados Unidos de Norteamérica (CDC) propuso en 1993 una clasificación con base en las manifestaciones clínicas y en el conteo sanguíneo de CD4+ (2-4,21): Categoría clínica A. Se clasifica así a los pacientes asintomáticos o con infección aguda por VIH y/o con una entidad clínica denominada linfadenopatía persistente generalizada. Categoría clínica B. En general, condiciones clínicas que reflejan inmunodeficiencia leve, por ejemplo, candidosis vulvo-vaginal persistente, recurrente o con pobre respuesta al tratamiento, diarrea crónica o recurrente, herpes zóster al menos en dos ocasiones y trombopenia primaria. Categoría clínica C. Se aplica en pacientes con evidencia clínica de inmunodeficiencia grave; algunos ejemplos son candidosis esofágica, diarrea crónica por criptosporidiasis, sarcoma de Kaposi, tuberculosis activa, neumonía por P. jirovecii, toxoplasmosis cerebral y neumonía recurrente. - 13 -

Además de clasificar a los pacientes con base en las manifestaciones clínicas, se agrega un número, el cual expresa el conteo de CD4+ más bajo que se ha medido en un paciente dado. Categoría inmunitaria 1: CD4 > 500/µL. Categoría inmunitaria 2: CD4 entre 499 y 200/µL Categoría inmunitaria 3: < 200/µL. La clasificación del CDC es la más aceptada en el mundo. Se diagnostica SIDA en cualquier paciente con categoría clínica C y/o categoría inmunitaria 3. Una vez que un paciente alcanza una categoría de mayor inmunodeficiencia, no se modifica la categoría clínica hacia la mejoría; por ejemplo, un paciente que se presenta con neumonía por P. jirovecii y se le ha determinado un conteo CD4 nadir de 50/µL, será clasificado siempre como C3, aunque se logre mejoría clínica e incremento del conteo CD4, mediante el tratamiento apropiado (3,21). DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR VIH - INMUNOENSAYOS El diagnóstico de la infección por VIH, mediante pruebas de laboratorio inicia con la determinación de inmunoglobulinas dirigidas al VIH, presentes en una muestra sanguínea (2-4). Estos anticuerpos a VIH se detectan por IE, los cuales emplean complejos anticuerpoantígeno (inmuno-complejos) para medir la presencia de un analito específico en una muestra; los analitos buscados pueden ser fármacos, antígenos y, en el caso de la infección por VIH, anticuerpos dirigidos contra antígenos virales. Los IE se caracterizan por su amplia disponibilidad y bajo costo (22). La clasificación de los IE es diversa; por ejemplo, pueden ser realizados en forma manual, semi-automatizada o completamente automatizada. También se categorizan en homogéneos y heterogéneos; A las técnicas de IE que requieren la separación del complejo antígeno-anticuerpo, se les conoce como IE heterogéneos; las que no requieren separación se denominan IE homogéneos. Otra clasificación los divide en formato competitivo y no competitivo; en los IE competitivos, el analito sin marcar (generalmente antígeno) en la muestra se detecta por su capacidad para competir con un antígeno marcado en el IE con un - 14 -

anticuerpo fijado en fase sólida; el analito bloquea la capacidad del antígeno marcado de unirse (por competencia); En los IE no competitivos, el analito (por ejemplo, los anticuerpos a VIH) reacciona con antígenos fijados en una fase sólida y posteriormente, sin separarse, reacciona con anticuerpos marcados; los IE no competitivos proporcionan sensibilidad y especificidad altas; por esto, actualmente su uso está generalizado y también se denominan en sándwich, ya que el analito está unido entre dos reactivos específicos. En los IE competitivos, la concentración del analito detectado es inversamente proporcional a la concentración de la señal producida en la prueba, mientras que en los IE no competitivos, la concentración del analito es directamente proporcional al resultado de la prueba (22,23). Adicionalmente, se denominan de dos pasos, aquellos IE, en los que se incluyen fases de lavado, para eliminar los reactivos no unidos, lo cual elimina interferencia en la detección de los analitos. Los IE, también se clasifican según la señal, marca o método de detección empleado, por ejemplo: Enzimas, compuestos radioactivos o sustancias cromógenas. A continuación se describen los cinco tipos de IE conocidos, de acuerdo al método usado para la detección de la señal (22-24): - Radioinmunoensayo: El anticuerpo o el antígeno se marcan con radioactividad y la detección ocurre por detección cuantitativa de la radioactividad presente. Estos IE se emplean cada vez menos debido a la complejidad en el manejo de los reactivos. - Inmunoensayo por Polarización de Fluorescencia: Se marca el antígeno del reactivo con una sustancia fluorescente y compite con el antígeno de la muestra (no marcado). La rotación relativamente lenta de las moléculas grandes, como también la capacidad de las partículas de movimientos lentos de polarizar la luz, se utilizan para obtener una medición del número de partículas grandes de anticuerpo-antígeno-fluoresceína en la solución. Su uso es cada vez menor. - Enzimoinmunoensayo (EIA o ELISA): Se emplean enzimas como método de detección; las más utilizadas son fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y galactosidasa B. En la última fase de estas técnicas, se agrega un sustrato que reacciona con la enzima del reactivo para producir una señal detectable; se requiere un equipo específico para detecta la señal, la cual puede ser un cambio de color o emisión de luz; la intensidad de la señal indica la concentración de enzimas presentes, e indirectamente del analito detectado. - 15 -

Desde su introducción, este método se encuentra muy difundido en la práctica diaria (Petricciani, 1985). Inmunoensayo por Micropartículas: Es semejante a EIA, pero en este formato, se cubre una micropartícula de fase sólida con anticuerpos en contra de un antígeno de interés, y se usa para capturar el analito. -Inmunoensayo por Quimioluminiscencia: Una marca quimioluminiscente se conjuga con el anticuerpo o antígeno, y produce luz cuando se lo combina con su sustrato. Esta técnica es muy similar a MEIA, aunque la reacción quimioluminiscente ofrece alta sensibilidad y facilidad para la medición. Figura 2. Esquema de un Inmunoensayo Enzimático, no Competitivo, Diseñado para la Detección de Anticuerpos a VIH. *Se ilustra la presencia de anticuerpos al VVZ, que podrían ocasionar un resultado falso positivo con reacción detectable de menor intensidad. Abreviaturas: Ag, antígenos; FS, fase sólida; Ac, anticuerpos; VIH, Virus de Inmunodeficiencia Humana; VVZ, Virus Varicela-Zóster; E, enzima; S, sustrato. - 16 -

La mayoría de los IE diseñados para detección de anticuerpos a VIH que se emplean actualmente, corresponden a IE homogéneos, no competitivos y de dos pasos. La figura 2 esquematiza las reacciones que ocurren en un IE para VIH, con marca enzimática. Los antígenos fijados en fase sólida son proporcionados por el fabricante y al agregar la muestra de un paciente (con anticuerpos a VIH), los antígenos se combinan con los anticuerpos de la muestra; posteriormente, se agrega un anticuerpo marcado con enzimas y dirigido a los anticuerpos humanos (un auto-anticuerpo, proporcionado también por el fabricante), el cual se combina y forma un complejo en sándwich ; finalmente, la adición de un sustrato permite la formación de color, detectable por el equipo de diagnóstico; Las fases de lavado eliminan las sustancias no combinadas; Debe enfatizarse que, si no existen anticuerpos en el paciente, que reaccionen con los antígenos, los lavados eliminan todos los componentes no fijados y no se produce reacción detectable. Los resultados falsos positivos se producen cuando otros anticuerpos presentes en la muestra (por ejemplo, dirigidos contra el Virus Varicela-Zóster) generan una reacción detectable; esta reacción suele ser de intensidad baja debido a una menor afinidad antígeno-anticuerpo (22-24) GENERACIONES DE INMUNOENSAYOS Desde su diseño inicial, los IE han experimentado un considerable desarrollo técnico. La sensibilidad y especificidad de las técnicas de detección del anticuerpo a VIH se incrementaron, debido al perfeccionamiento de los reactivos, específicamente de los antígenos empleados (Cuadro 1) (25). La evolución de los antígenos incluidos en los IE para VIH ha permitido incrementar la sensibilidad y ha hecho posible la detección de anticuerpos frente a tipos y subtipos del VIH, no detectados mediante las primeras técnicas empleadas (25). Los IE de 4ª generación no han sido completamente validados para su uso en la práctica clínica; actualmente se emplean en bancos de sangre para la detección de personas con infección por VIH, antes de la sero-conversión (26). - 17 -

Cuadro 1. Antígenos Empleados en los IE para Detección de Anticuerpos a VIH. Técnica Reactivos 1ª generación Lisado viral VIH-1 2ª generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 3ª generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2 y antígeno VIH-1 del grupo O 4ª generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1, VIH-2, VIH-1 O y anticuerpos para detectar el antígeno p24 El perfeccionamiento de los IE a VIH ha reducido la proporción de resultados falsos positivos y falsos negativos; en algunas poblaciones (Por ejemplo, donadores de sangre) la frecuencia de resultados falsos positivos aún se reporta hasta en 70% (12,27,28). En el cuadro 2 se resumen las causas conocidas de resultados falsos positivos. Los resultados falsos negativos en los IE VIH actuales, de 3ª y 4ª generación son excepcionales (3,23,24). Cuadro 2. Causas de resultado falso positivo en el inmunoensayo para VIH. Relativas a la técnica Congelamiento repetido Almacenamiento inadecuado Suero lipémico o turbio Contaminación microbiana Aplicación de calor (> 60º C) a la muestra Error de extracción o identificación Relativas al paciente Anticuerpos anti-hla-dr4, DQw3 Enfermedades reumáticas Trasfusión o trasplante Multíparas Hemodiálisis, falla renal crónica Síndrome de Stevens-Johnson Administración previa de inmunoglobulinas Vacunas (influenza, hepatitis B) Infecciones agudas por otros virus Hepatopatía alcohólica - 18 -

PRUEBAS PARA CONFIRMACIÓN DIAGNÓSTICA La trascendencia de la infección por VIH hace necesaria la confirmación de los resultados positivos del IE a VIH. Existen diferentes pruebas de confirmación, como western blot (WB), inmunofluorescencia indirecta (IFI), radioinmunoprecipitación (RIPA) e immunoblot con antígenos recombinantes (LIA) (23,34). La técnica más ampliamente utilizada es el WB. Las técnicas de IFI y RIPA se emplean cada vez menos, de tal forma que los resultados del WB son considerados la prueba de oro, para confirmar la presencia de anticuerpos al VIH (2-4,23-29). El WB se basa en electroforesis que separa los antígenos del VIH cuando se aplica un potencial eléctrico y por la diferencia en peso molecular; esto permite la identificación de cada anticuerpo específico. El WB contiene antígenos del VIH, algunas de sus proteínas precursoras y antígenos de origen celular. Existen sistemas que incorporan en un extremo diferenciado de la tira un péptido sintético específico del VIH-2 (gp36), que facilita la sospecha de la infección por el VIH-2 (29). Existen distintos criterios de positividad propuestos para la interpretación del WB a VIH (29-31). Cuadro 3. Criterios de positividad de la prueba western-blot. Criterio Reactividad frente a: OMS Cruz Roja Americana FDA CRSS CDC/ASTPHLD Dos glucoproteínas cualquiera de: gp160, gp120, gp41 Una proteína de cada gen estructural (env, pol y gag) p24 + p32 + (gp41 o gp120 o gp160) p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o p32 + (gp41 o gp120 o gp160) p24 + (gp41 o gp120 o gp160) o gp41 + (gp120 o gp160) Abreviaturas: FDA, Food and Drug Administration; CRSS, Consortium for Retrovirus Serology and Standardization; CDC/ASTPHLD: Centers for Disease Control/Association of State and Territorial Public Health Laboratory Directors. - 19 -

Una muestra sanguínea se considera positiva por WB cuando cumple el criterio de positividad adoptado, negativa cuando no se observa ninguna banda de reactividad e indeterminada cuando se observa reactividad distinta a la del criterio de positividad (31). Desde hace una década, se reconoce cada vez más que las pruebas de detección de ácidos nucleicos (PAN) para VIH también permiten confirmar los resultados reactivos al IE VIH; aunque no hay consenso mundial, el CDC estableció desde 1999, que un resultado de PAN VIH positivo puede emplearse como prueba confirmatoria (4,6,21). La figura 3 muestra el algoritmo empleado en la actualidad para el diagnóstico de la infección por VIH. Figura 3. Algoritmo Diagnóstico Actual de la Infección Por VIH. a Positivo por duplicado; b Prueba de western blot o prueba de ácidos nucleicos; c Requiere pruebas adicionales para determinar el sero-status. Abreviaturas: IE, inmunoensayo. - 20 -

EL ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL INMUNOENSAYO A VIH Las pruebas más difundidas actualmente para la detección de anticuerpos a VIH, son IEs (enzimáticos, micropartículas y quimioluminiscencia) no competitivos, de tercera generación; Tradicionalmente, el resultado de estas pruebas se interpreta en forma cualitativa (es decir, positivo o negativo); no obstante, la intensidad de la reacción positiva se mide en una escala de valores continuos (cuantitativo), mediante el IR. Este índice se obtiene al dividir la señal de la muestra probada entre el punto de corte de un control negativo y se calcula automáticamente por el equipo electrónico en laboratorio. Las muestras con IR <1 se interpretan y se reportan como no reactivas (negativas), mientras que los resultados con índice 1 se interpretan como reactivos (positivos). En los IE a VIH no competitivos, que son los más utilizados actualmente, el IR es directamente proporcional a la concentración de los anticuerpos a VIH (5,22). Como en otras pruebas diagnósticas, la sensibilidad y especificidad del IE a VIH varían según el valor de corte elegido para definir el resultado positivo (32-34); Cuando se elige el IR 1 para definir el resultado positivo, como se hace habitualmente, la sensibilidad de los IE de tercera generación para VIH es de 99-100% (3,5), es decir, la probabilidad de resultados falsos negativos es remota. En contraste, si se elige un IR más alto, como punto de corte para definir la positividad, se observa disminución de la sensibilidad y aumento en la especificidad. Los valores predictivos positivo y negativo del IE VIH también varían según el punto de corte elegido, pero como en todas las pruebas diagnósticas, dependen de la prevalencia de infección por VIH en la población estudiada. A mayor prevalencia, mayor proporción de resultados verdaderos positivos, mientras que en poblaciones de baja prevalencia la proporción de resultados verdaderos positivos puede ser baja (32). Por ejemplo, en donadores de sangre, el 40-70% de los resultados positivos de un IE de tercera generación, son negativos por WB (9,28). Esto refleja la influencia de la probabilidad pre-prueba en la probabilidad post-prueba (valor predictivo positivo), de los IE disponibles para la infección por VIH. Existen reportes de la utilidad del IR del IE para distinguir entre resultados verdaderos y falsos positivos, en poblaciones con prevalencia de VIH mayor al 1% y en poblaciones mixtas (9-11). No obstante, los estudios previos combinaron 2 o más IE, lo cual resta utilidad - 21 -

a los hallazgos, dado que el IR entre dos IE no es equivalente. Otra limitante en estudios previos, ha sido la elección arbitraria de los valores de corte. Se reporta que el análisis cuantitativo del IE incrementa la eficiencia del diagnóstico en otras enfermedades cuyo diagnóstico depende de la confirmación de la presencia de anticuerpos, como en la hepatitis C (33,34). En el caso de la infección por VIH, los escasos reportes en la literatura previos sugieren que es posible evitar hasta el 90% de pruebas confirmatorias para VIH, en poblaciones con prevalencia alta de infección por VIH (9-11). Este enfoque puede ser útil en la decisión de emplear pruebas confirmatorias y puede reducir el tiempo necesario para confirmar el diagnóstico; Dado que el inicio temprano del tratamiento farmacológico incrementa la sobrevida de los pacientes con inmunodeficiencia (8,18), el análisis cuantitativo del IE puede mejorar la calidad de la atención en las personas que viven con VIH. - 22 -

JUSTIFICACIÓN Magnitud: Se estima que uno de cada 400 adultos mexicanos padece infección por VIH (4-7). La práctica habitual en nuestro medio (estatal y nacional) y de acuerdo con la legislación nacional (2-6), es corroborar con WB para VIH los resultados positivos por duplicado en el IE a VIH. Este enfoque incrementa el costo y el tiempo requeridos para establecer el diagnóstico de infección por VIH. Actualmente, el costo de las pruebas confirmatorias de VIH oscila entre $600 y $2800 (observación personal). Trascendencia: Es posible que esta línea de investigación conduzca eventualmente a la modificación del paradigma vigente, acerca de que se requiere confirmación por WB en todas las muestras sanguíneas con resultado positivo del IE a VIH. Vulnerabilidad/Factibilidad: Se trata de un estudio basado en registros de laboratorio y expedientes clínicos; Se cuenta con conocimiento teórico, habilidades prácticas y recursos económicos suficientes. Se cumplen los criterios para factibilidad, es decir, número suficiente de sujetos, experiencia técnica y profesional apropiada, concebible en los aspectos temporal y económico y, pertinente en nuestra población (35). - 23 -

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN El Índice de Reactividad del Inmunoensayo para VIH permite distinguir los resultados verdaderos positivos de los falsos positivos? HIPÓTESIS El Índice de Reactividad del Inmunoensayo para VIH permite distinguir los resultados verdaderos positivos de los falsos positivos. - 24 -

OBJETIVO GENERAL Determinar si el Índice de Reactividad del Inmunoensayo para VIH permite distinguir los resultados verdaderos positivos y evitar la necesidad de pruebas confirmatorias. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Conocer los factores de riesgo, cuadro clínico, comórbidos y características inmunitarias y virológicas de los pacientes con infección por VIH recién diagnosticadas en el estado de Colima. Realizar análisis de Características Operativas del Receptor del Índice de Reactividad del Inmunoensayo para VIH y determinar el punto de corte óptimo para la discriminación de resultados verdaderos positivos. Realizar análisis de prueba diagnóstica del Índice de Reactividad óptimo del Inmunoensayo para VIH. - 25 -

MATERIAL Y MÉTODOS Descripción general del estudio Entre Diciembre del 2007 y Mayo del 2009, se revisaron todos los reportes positivos de IE a VIH, disponibles en el Laboratorio Estatal de Salud Pública; se diseñó un formato para recolección de datos (Anexo 1). Se incluyeron todos los reportes de IE a VIH que cumplieron con los criterios de selección, en forma consecutiva. Posteriormente, se tomaron los datos clínicos de los expedientes médicos respectivos en las siguientes unidades médicas: -Centros de Salud de Colima, Tecomán y Manzanillo -Hospitales de la Secretaría de Salud de Colima, Tecomán y Manzanillo -Hospital de Zona 1, IMSS Colima. Universo de estudio Todos las personas de edad mayor a 13 años (25), atendidos como pacientes con resultado positivo del anticuerpo a VIH, mediante IE de tercera generación, realizado en el Laboratorio Estatal de Salud Publica de Colima. Tipo de estudio Se trata de un estudio con diseño de prueba diagnóstica y con recolección retrolectiva y prolectiva de la mayoría de los datos (36). El estándar de oro es WB positivo de acuerdo con los criterios de la OMS (cuadro 3) o PAN VIH positiva > 2000 UI/ml; este nivel en las pruebas de detección de ARN viral se basa en la observación de que los resultados falsos positivos de la PAN, se han presentado por debajo de este nivel de corte (3). - 26 -

CRITERIOS DE SELECCIÓN Criterios de inclusión Edad 13 años. Dos IE para VIH reactivos. Al menos un IE para VIH con índice de reactividad 1 (resultado reactivo o positivo). Al menos un IE para VIH realizado por EIA de tercera generación. Criterios de exclusión IE VIH solicitado por escrutinio en donación de sangre. Hipogamaglobulinemia. Uso de fármacos inmuno-supresores. Criterios de eliminación Embarazo. Falta de datos (Género, edad, o índice S/CO). Reporte inadecuado del índice de reactividad del IE a VIH. Ausencia de pruebas confirmatorias. Tratamiento anti-retroviral antes del IE a VIH. - 27 -

VARIABLES METODOLÓGICAS Y DEFINICIONES Variables metodológicas Variable independiente (explicativa): Índice de reactividad del IE para VIH. Variable dependiente (de resultado): Resultado verdadero positivo (infección por VIH confirmada) o falso positivo (infección por VIH descartada o indeterminada) del IE a VIH. Definiciones Heterosexual promiscuo: Se denominó así cuando se encontró el antecedente de 2 o más parejas sexuales del género contrario, sin uso de condón masculino ni femenino. Contacto de persona con VIH: Se definió así cuando el paciente reportó ser padre, madre o pareja sexual de una persona con infección por VIH. Encarcelamiento: Estancia por más de una semana en un reclusorio. Cuadro clínico: Se refiere a los síntomas y signos que presentaba el paciente cuando se solicitó la detección de anticuerpos a VIH; generalmente motiva la solicitud del IE. En la población estudiada los cuadros clínicos encontrados fueron: inmunodeficiencia, asintomático, otros o no disponible. Se consideró inmunodeficiencia a la presencia de uno más de los siguientes. o Diarrea crónica (3 semanas o más) o recurrente (3 o más eventos por mes). o Fiebre (temperatura corporal axilar mayor de 37.7 C, de causa no determinada, cualquier duración e intensidad) (Harrison referencia fiebre). o Candidosis bucal: El hallazgo por inspección de placas blancas en la mucosa de mejillas o paladar, las cuales se desprendían al frote con un objeto romo. o Pérdida ponderal: reducción del peso 10% en 6 meses. o Una condición C de la clasificación del CDC. Para cada una de las enfermedades oportunistas, se consideró definida de acuerdo al diagnóstico clínico, sin necesidad de confirmación histológica o microbiológica. Serología para hepatitis B: Prueba para detección del antígeno de superficie de hepatitis B, en cualquier momento. Serología para hepatitis C: Prueba para detección del anticuerpo a hepatitis C, en cualquier momento. - 28 -

Sífilis: La primera prueba VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) o prueba de plasmática de reaginas realizada después del IE a VIH. Anticuerpo a VIH REACTIVO (POSITIVO): IE VIH reactivo por duplicado. Cuando se encontraron pacientes a quienes se les realizó IE a VIH, se incluyeron como un elemento muestral diferente, siempre y cuando se empleó una muestra sanguínea nueva. CD4: El primer conteo de linfocitos T CD4+, con diferencia no mayor a 12 meses de la fecha del IE. Se reporta en células/µl de sangre total y en porcentaje con respecto al total de linfocitos T. Carga viral: La primera determinación de PAN, con diferencia no mayor a 12 meses de la fecha del IE. Se reporta en copias/ml de plasma; la versión ultrasensible de Amplicor tiene límites de detección entre 50 y 100,000 copias/ml; cuando se reportó el resultado máximo, se capturó en la base de datos como 100,001 copias/ml. Tiempo necesario para el diagnóstico: Días transcurridos entre la fecha de reporte del resultado del IE a VIH y la fecha de reporte del resultado de la primera prueba confirmatoria. Se calculó solamente para los pacientes con IE a VIH verdadero positivo. Prueba confirmatoria positiva: (1) Prueba de Western Blot para VIH POSITIVA según los criterios de la OMS. (2) Prueba de ácidos nucleicos de VIH (ARN VIH) > 2000 UI/ml. Anticuerpo a VIH VERDADERO POSITIVO: IE VIH reactivo por duplicado y al menos una prueba confirmatoria positiva. Anticuerpo a VIH FALSO POSITIVO: IE VIH reactivo por duplicado y al menos una prueba confirmatoria NEGATIVA; o IE a VIH reactivo por duplicado y WB indeterminado sin seguimiento diagnóstico. - 29 -

TAMAÑO DE LA MUESTRA En estudios de prueba diagnóstica, el cálculo del tamaño muestral se realiza con las variables especificidad o sensibilidad como variables dicotómicas. En este caso, el tamaño de la muestra se calculó tomando en cuenta las siguientes consideraciones (37,38): n: Número de sujetos a estudiar. Zα: Es la desviación normal estandarizada para el nivel de significado establecido, en este caso 1.96, que corresponde con α 0.05 y poder estadístico de 97.5%. p: Proporción esperada (Sensibilidad esperada, en este caso maximizada a 0.5. O con el cálculo de especificidad de 0.9). q: 1-p IC 2 : Amplitud máxima permitida del intervalo de confianza, en este caso 0.1 (5% a cada lado n= 4(Zα) 2 (pq) IC 2 Con base en la sensibilidad, se requieren 385 elementos muestrales. Con base en la especificidad, se requieren 152 elementos muestrales. Se eligió el mayor tamaño muestral para incrementar el poder del estudio. TIPO DE MUESTREO El muestreo fue no probabilístico. Se incluyeron todos los pacientes elegibles, en forma consecutiva hasta completar el tamaño muestral (39). - 30 -

ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó mediante los programas Excell 2003 y SPSS 16.0. Se aplicó estadística descriptiva, de la siguiente forma: Frecuencias y porcentajes para las variables nominales y ordinales; medias y desviación estándar para las variables cuantitativas. Se realizó análisis de características operativas del receptor (COR o ROC, por sus siglas en inglés) y se eligió el valor del índice S/CO asociado con sensibilidad y especificidad máximas. Se determinaron sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo, valor predictivo positivo, precisión e índices de verosimilitud (likelihood ratio). Se calcularon intervalos de confianza del 95% para las características de prueba diagnóstica. En una sub-muestra de pacientes se estimó la variabilidad intra-ensayo (repetición de la prueba en una misma muestra sérica) mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Previamente, se realizó prueba de Kolmogorov Smirnov para comprobar la distribución normal del índice S/CO (39). Para fines del análisis, los WB indeterminados sin seguimiento diagnóstico se consideraron falsos positivos; esto se basa en que se reporta en la literatura que la mayoría de los WB indeterminados representan falsa reactividad; por ejemplo, Beck et al, reportó que solamente 3 de 43 resultados indeterminados en WB se comprobaron como verdaderos positivos (9). En los sujetos con resultado indeterminado en el WB, en quienes se completó el seguimiento diagnóstico (Nuevo IE VIH y/o WB VIH y/o PCR VIH 6 meses después), se determinó el status de acuerdo a las nuevas pruebas confirmatorias. - 31 -

ASPECTOS ÉTICOS A) De acuerdo con el Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud (40), este estudio se clasifica como Investigación sin riesgo, ya que no se realizó ninguna intervención en los individuos que participen en el estudio. B) El estudio fue aprobado por la comisión de Ética e Investigación de la Secretaría de Salud y Bienestar Social del Estado de Colima (Anexo 2). C) No fue necesario el consentimiento por escrito de los individuos. D) Se respetó la confidencialidad de los sujetos de investigación. E) Se otorgará el crédito adecuado a los asesores, co-autores y al personal técnico que participe en la investigación. F) Se entregará una copia del estudio concluido al nivel administrativo pertinente, de la SSA Colima. G) No existen conflictos de interés. - 32 -

RESULTADOS Entre enero del 2005 y Abril del 2009, en el Laboratorio de Estatal de Salud Pública de Colima se realizaron 6330 pruebas de anticuerpo a VIH, mediante IE enzimático de tercera generación. Se encontraron 493 resultados reactivos por duplicado en el IE a VIH. Esto permite calcular una proporción de IE a VIH reactivo de 7.8% en la población estudiada. Se excluyeron: 16 pacientes en quienes se emplearon IE diferentes al EIA Vironostika de tercera generación; 12 sujetos, en quienes se realizó escrutinio de VIH como donadores de sangre y 4 menores de 13 años. Además, se eliminaron 53 elementos muestrales debido a que no se encontraron pruebas confirmatorias, 10 pacientes por reporte inadecuado del índice de reactividad (medición con espectrofotómetro antiguo), 2 por embarazo, 2 por TAR previo al IE para VIH y uno por falta de todos los datos (edad). Por lo tanto, se incluyeron 393 pacientes con criterios de selección suficientes (Figura 4). Se realizó WB en 355/393 muestras; el resultado fue positivo en 338/355 (95.2%), negativo en 1/355 (0.3%) e indeterminado en 16/355 (4.5%). La PAN se realizó como prueba confirmatoria en 233/393 (59.3%); el resultado fue positivo en 227/233 pacientes (97.4%) y negativo en 6/233 (2.6%). Entre los 16 pacientes con WB indeterminado, se realizó PAN como seguimiento diagnóstico solamente en 6 pacientes y no estuvo disponible ningún seguimiento diagnóstico en 10/16 pacientes; en los 6 casos con PAN de seguimiento, se reportó positivo en 2/6 (33.3%) y negativo en 4/6 (66.6%). El estándar de oro empleado permitió determinar un resultado verdadero positivo en 378/393 (96.2%) muestras, mientras que 15/393 (3.8%) pacientes se consideraron con resultado falso positivo del IE para VIH. Entre los sujetos del estudio, 90 muestras correspondían a mujeres (22.9%) y las 303 restantes procedían de hombres; la media de edad fue 33.9 años (DE 10.4); en los pacientes con infección por VIH confirmada, la carga viral plasmática media fue 133,723 copias/ml (rango 64-1,262,150, DE 198,124), la media del recuento CD4 fue 234 células/µl (rango 2 1074, DE 251), y la media del porcentaje de CD4 fue 13.1 (rango 0.5 39.5, DE 9.3). La media del tiempo necesario para confirmar el diagnóstico fue 44.5 días (rango 0 311, DE 43.8). Las características clínicas de la población estudiada se muestran en el cuadro 5. - 33 -

Figura 4. Flujograma de los Pacientes en el Estudio. a Positivo por duplicado; b IR aplicable solo para el IE Vironostika; c Prueba confirmatoria negativa o indeterminada. Abreviaturas: IE, inmunoensayo; IR, índice de reactividad. El grupo de riesgo más frecuente fue el de hombres homosexuales y en una tercera parte de los individuos no estaban disponible los factores de riesgo. Poco más de la mitad de los sujetos se realizaron el IE a VIH por cuadro clínico de inmunodeficiencia; el síntoma más frecuente fue pérdida de peso y no se dispuso de datos acerca de los síntomas en aproximadamente uno de cada 5 pacientes. Se encontró co-infección con hepatitis B en 4.3% de los sujetos, hepatitis C en 3.1% y sífilis en 7.9%. El estadio clínico más frecuente fue C del CDC y en uno de cada 3 sujetos no se dispuso de esta información. - 34 -

Cuadro 4. Características Clínicas de los 393 Sujetos del Estudio. Grupo de riesgo* Característica N (%) Característica n (%) Hombre homosexual Heterosexual promiscuo Encarcelamiento Contacto de persona con VIH Usuario de droga IV Riesgo laboral Ninguno ND Cuadro clínico Inmunodeficiencia Asintomático Otros ND Inmunodeficiencia Candidosis bucal Pérdida ponderal Diarrea crónica/recurrente Fiebre 147 (37.4) 90 (22.9) 78 (19.8) 69 (17.6) 32 (8.1) 10 (2.5) 2 (0.5) 123 (31.3) 203 (51.7) 112 (28.5) 8 (2.0) 70 (17.8) 68 (17.3%) 117 (29.8) 84 (21.4) 97 (24.7) Hepatitis B Positivo Negativo ND Hepatitis C Positivo Negativo ND Sífilis Positivo Negativo ND Estadio clínico del CDC A B C ND 17 (4.3) 107 (27.2) 269 (68.4) 12 (3.1) 117 (29.8) 264 (67.1) 31 (7.9) 116 (29.5) 246 (62.5) 123 (31.3) 15 (3.8) 129 (32.8) 126 (32.1) *Excepto para la preferencia sexual, los grupos de riesgo no son excluyentes; por ejemplo, un paciente puede ser heterosexual promiscuo y usuario de droga IV. IV: Intravenosa, VIH: Virus de Inmunodeficiencia Humana, ND: No disponible. El IR del IE a VIH mostró una distribución normal, con p de 0.782 obtenida por prueba de Kolmogorov-Smirnov. La figura 3 ilustra la distribución de los valores Una vez verificada la distribución normal, se estimó la variabilidad intra-ensayo (repetición de la prueba en una misma muestra sérica) mediante el coeficiente de correlación de Pearson en una sub-muestra de 38 pacientes a quienes se les realizó IE a VIH por Vironostika en dos ocasiones; el coeficiente de correlación de Pearson fue de 0.97. - 35 -

Histogram 40 30 Frequency 20 10 0 0.0000 5.0000 10.0000 15.0000 20.0000 25.0000 30.0000 Mean =14.262092 Std. Dev. =5.1401933 N =393 S/CO Figura 5. Distribución del Índice de reactividad (S/CO) en la Población de Estudio. El análisis ROC mostró un área bajo la curva de 0.974 (IC 95% 0.94-1). La gráfica del área bajo la curva se muestra en la figura 6. Se encontró que un IR 11.6 se asocia con especificidad del 100% y por arriba de ese valor, la especificidad no cambia y la sensibilidad disminuye; por lo tanto, se eligió este valor como el óptimo para predecir resultado verdadero positivo en el resultado del IE Vironostika; las muestras con IR 11.6 se denominaron como alto positivo en el IE a VIH, mientras que por debajo de ese nivel se designaron como bajo positivo. Del total de pacientes incluidos, 274 (69.7%), mostraron IR alto positivo en el IE a VIH; entre éstos, todos se confirmaron como verdadero positivo; entre las 119 (30.3%) muestras con IR bajo positivo (< 11.6) 104/119 (87.4%) se confirmaron como verdadero positivo y 15/119 (12.6%) pacientes se consideraron falso positivo en el IE a VIH (figura 4). - 36 -

ROC Curve 1.0 0.8 Sensitivity 0.6 0.4 0.2 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1 - Specificity Figura 6. Curva de Características Operativas del Receptor del Índice de Reactividad del Inmunoensayo para VIH. La línea diagonal señala la neutralidad estadística. En el cuadro 6, se realiza una comparación entre el IR 11.6 y el valor de 3, reportado previamente por Hou y Gendler (10,11), calculado en nuestra población de estudio para el IE enzimático de tercera generación empleado en este estudio. Como es de esperarse, cuando se eleva el nivel de corte de una prueba, disminuye la sensibilidad y se incrementa la especificidad; también, en nuestra población, un IR alto positivo incrementó el valor predictivo positivo y el índice de verosimilitud de un resultado positivo. - 37 -

Cuadro 6. Comparación de dos Niveles del Índice de Reactividad del IE a VIH. Parámetro Valor del S/CO (IC 95%) > 3.0 11.6 Sensibilidad % 99.7 (98.0-100) 72.5 (69.1-75.9) Especificidad % 46.7 (41.3-49.5) 100.0 (97.2-100) VPP % 97.9 (95.1-99.1) 100.0 (97.9-100) VPN % 87.5 (81.0-93.2) 12.6 (9.8-15.3) +LR 1.9 72.5 -LR 0.06.375 Abreviaturas: VPP, valor predictivo positivo; VPN, valor predictivo negativo; +LR, índice de verosimilitud del resultado positivo; -LR índice de verosimilitud del resultado negativo. - 38 -

DISCUSIÓN Los resultados de este estudio muestran que el IR 11.6 en el IE enzimático de tercera generación para VIH, posee valor predictivo positivo del 100% en pacientes con sospecha de infección por VIH. Este estudio demuestra que el análisis cuantitativo del IE a VIH puede ser empleado para predecir resultado verdadero positivo y las pruebas confirmatorias (como Western-Blot) pueden ser innecesarias en más del 50% de los sujetos con infección por VIH. Un índice de verosimilitud positivo > 10 es reconocido como excelente por que ofrece cambios concluyentes en la posibilidad post-prueba, respecto a la posibilidad pre-prueba (41-42). No existen reportes previos acerca de la variabilidad intra-ensayo del IR, además de la información de los fabricantes. En este estudio, se encontró una correlación intra-ensayo excelente, lo cual seguramente se debe al proceso automatizado (22). Esto permite concluir confiabilidad en la determinación del anticuerpo a VIH por IE enzimático de tercera generación. En el estudio de Hou X et al (11) se reportó valor predictivo del 100% cuando se empleó IR de 3.0, lo cual contrasta con el nivel de 11.6 definido en el presente estudio. La diferencia puede deberse a que se emplearon dos IE combinados. Los IR no son equivalentes entre diferentes IE, ya que la intensidad de señal depende de la técnica de detección de la reacción y de los antígenos empleados (22); otra limitante del estudio de Hou fue la inclusión de población heterogénea (grupos con prevalencias de 0.3 a 32%). Algo similar ocurrió en el estudio de Beck A et al (9); en 298 sujetos (donadores, pacientes con SIDA e individuos sanos) se reportó valor predictivo positivo del 100% asociado a un IR > 2.0. Nuevamente, la detección del anticuerpo a VIH se realizó mediante al menos 4 IE. Un estudio realizado en Argentina en 108 donadores de sangre con resultado positivo por duplicado en el IE A VIH reportó valor predictivo del 100% con el IR de 3.0; la diferencia en este caso puede deberse al pequeño tamaño muestral, a la combinación de diferentes IE, pero principalmente a la población de baja prevalencia, que modifica la probabilidad post-prueba (32). El uso de IEs múltiples en estudios de investigación limita la aplicación de los resultados en el contexto clínico, donde se interpreta un IR del IE a VIH por paciente. De hecho, es posible que este - 39 -