Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-ratón Nº de catálogo K4000 15 ml Nº de catálogo K4001 110 ml Indicaciones de uso Para uso diagnóstico in vitro. Estas instrucciones se aplican a Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP). Este producto está indicado para su uso con anticuerpos primarios de ratón suministrados por el usuario para la identificación cualitativa de antígenos por microscopía óptica en tejidos normales y patológicos incluidos en parafina, tejidos de congelación o preparaciones celulares. Pueden utilizarse tejidos procesados en una variedad de fijadores, entre los que se incluyen, etanol, B-5, fijador de Bouin, formol con zinc y formol tamponado neutro. Consulte las Instrucciones generales para tinción inmunohistoquímica o las Instrucciones del sistema de detección de procedimientos de IHQ para: (1) Principio del procedimiento, (2) Materiales necesarios que no se suministran (3) Almacenamiento, (4) Preparación de las muestras, (5) Procedimiento de tinción, (6) Control de calidad, (7) Solución de problemas, (8) Interpretación de la tinción, (9) Limitaciones generales. Resumen y explicación EnVision+ System, HRP, es una técnica de tinción IHQ que consta de dos pasos. Este sistema se basa en un polímero marcado con HRP que está conjugado con anticuerpos secundarios. El polímero marcado no contiene avidina ni biotina. Consecuentemente, la tinción inespecífica resultante de la actividad biotina-avidina endógena en hígado, riñón, tejidos linfoides y cortes de congelación se elimina o reduce bastante. El reactivo en el Dako EnVision+, HRP está listo para usar. Este sistema es un método extremadamente sensible y, como resultado, las diluciones óptimas del anticuerpo primario son 20 veces más altas que las utilizadas con la técnica tradicional PAP, y varias veces mayor que las utilizadas con los métodos tradicionales ABC o LSAB. Este protocolo ofrece un sistema generador de señal aumentado para la detección de los antígenos presentes en bajas concentraciones o para títulos bajos de anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios producidos en ratón reaccionan bien con el polímero marcado. La interpretación de cualquier tinción positiva o la ausencia de tinción debe complementarse con estudios morfológicos e histológicos con controles adecuados. Principios del procedimiento Reactivos suministrados Cualquier actividad peroxidasa endógena se inhibe al incubar la muestra con un reactivo bloqueante de la peroxidasa endógena adecuado. A continuación, la muestra se incuba con anticuerpo primario de ratón correctamente diluido y caracterizado seguido por su incubación con el polímero marcado utilizando dos incubaciones secuenciales de 30 minutos. Debe tenerse en cuenta que para los anticuerpos que requieren digestión enzimática o recuperación de antígeno, puede que sea necesario aumentar entre 5 y 10 minutos el tiempo de incubación del anticuerpo primario y del polímero marcado. La tinción se completa con una incubación de 5 30 minutos con un sustrato-cromógeno adecuado. Nº de catálogo K4000: El siguiente material es suficiente para 150 cortes de tejido, basándose en 100 µl por sección: Cantidad 1x15 ml Descripción Labelled Polymer Polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón en tampón Tris-HCl que contiene proteína estabilizante y un antibiótico. Nº de catálogo K4001: El siguiente material es suficiente para 1100 cortes de tejido, basándose en 100 µl por corte: Cantidad 1x110 ml Descripción Labelled Polymer Polímero marcado con peroxidasa conjugado con inmunoglobulinas de cabra anti-ratón en tampón Tris-HCl que contiene proteína estabilizante y un antibiótico. (107509-004) 302059ES_003 p. 1/6
Materiales necesarios pero que no se suministran Toallas absorbentes Tejido de control, positivo y negativo Contratinción; basado en agua, como Mayer s Hematoxylin o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (nº de catálogo S3309) Cubreobjetos Agua destilada Etanol, puro y al 95% Microscopio óptico (20x 800x) Medio de montaje, como Glycergel Mounting Medium (nº de catálogo C0563) o Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nº de catálogo S3025) o medio de montaje permanente no acuoso, Ultramount (nº de catálogo S1964) Anticuerpos primarios y reactivo de control negativo Portaobjetos, recubiertos con poli-l-lisina o Silanized Slides (nº de catálogo S3003) Baños o recipientes de tinción Cronómetro (capaz de medir intervalos de 3 40 minutos) Botellas de lavado Solución de tampón de lavado Xileno, tolueno o sustitutos del xileno Para K4000 o K4001 EnVision+, Peroxidase, se requieren los siguientes reactivos además de los enumerados anteriormente: Reactivo bloqueante de peroxidasa endógena, como Dual Endogenous Enzyme Block (n.º de catálogo S2003) Solución sustrato-cromógeno, como AEC+ Substrate-Chromogen Ready-to-Use (n.º de catálogo K3469) de 110 ml o Liquid DAB+ (n.º de catálogo S2002) Material opcional no suministrado Hidróxido de amonio, 15 mol/l diluido hasta 0,037 mol/l PAP Pen (nº de catálogo S2002) Precauciones Preparación de los reactivos 1. Para usuarios profesionales. 2. No utilice los reactivos después de su fecha de caducidad para el método de almacenamiento prescrito. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones diferentes a las especificadas en el prospecto del envase, dichas condiciones deben ser validadas por el usuario. 3. No intercambie reactivos de kits de lotes diferentes o de kits de otros fabricantes. 4. Las enzimas y los sustratos-cromógenos pueden verse afectados negativamente si se exponen a niveles excesivos de luz. No almacene los componentes del kit ni realice el procedimiento de tinción en presencia de luz intensa, como la luz directa del sol. 5. Si se utilizan tiempos o temperaturas de incubación diferentes a los especificados, pueden producirse resultados erróneos; dichos cambios deben ser validados por el usuario. 6. Como cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deben utilizarse los procedimientos de manipulación adecuados. 7. Utilice el equipo adecuado para protección personal a fin de evitar el contacto con los ojos y la piel. 8. La solución no utilizada debe desecharse de acuerdo a las normativas locales, provinciales y nacionales. Es conveniente preparar los siguientes reactivos antes de la tinción. Solución de tampón de lavado El tampón de lavado recomendado para la detección IHC automática y manual es TBST, Tris Buffered Saline with Tween 0,05 mol/l (nº de catálogo S3006).También son adecuadas las soluciones de lavado TBS, Tris Buffered Saline 0,05 mol/l (nº de catálogo S1968) y PBS, Phosphate Buffered Saline 0,02 mol/l (nº de catálogo S3024) para la tinción manual. No se recomiendan las soluciones Wash Buffer que contengan azida sódica.la azida sódica inactivará la peroxidasa de rábano (HRP) produciendo tinción negativa. Almacene el tampón no utilizado a 2 8 C. Deseche el tampón si presenta un aspecto turbio. Puede utilizarse agua destilada para lavar el bloqueante de la peroxidasa, el sustrato y la contratinción. Anticuerpo primario Se han optimizado los anticuerpos listos para usar de la serie NP Plus para utilizar con los sistemas de detección de alta sensibilidad Dako Plus y se recomienda el uso de los mismos. Dako también comercializa anticuerpos concentrados. El usuario final requiere la optimización de los anticuerpos concentrados. Las diluciones deben prepararse con Antibody Diluent (nº de catálogo S0809) o un diluyente que contenga tampón Tris-HCl 0,05 mol/l con seroalbúmina bovina al 1% (BSA). Los anticuerpos listos para usar Dako N-Series no están optimizados para usar con los sistemas de detección Dako plus. Para la mayoría de los anticuerpos primarios utilizados con este kit, es suficiente una incubación de 30 minutos. Reactivo de control negativo Cuando se utilizan anticuerpos listos para usar Dako NP-Series Plus, se recomienda el uso de Universal Negative Control+ optimizado para los anticuerpos listos para usar NP-Series Plus (nº de catálogo NP015) como reactivo de control negativo. (107509-004) 302059ES_003 p. 2/6
En una situación ideal, un reactivo de control negativo contiene anticuerpo que no muestra reactividad específica con los tejidos humanos ni con el suero normal/no inmune en la misma matriz/solución que el anticuerpo primario diluido. El reactivo de control negativo debe ser de la misma subclase y especie animal que el anticuerpo primario, estar diluido a la misma concentración de proteína o inmunoglobulina que el anticuerpo primario utilizando el mismo diluyente. El período de incubación del reactivo de control negativo debe corresponder con el del anticuerpo primario. Contratinción El producto final coloreado de la reacción de tinción es soluble en alcohol y debe utilizarse exclusivamente con contratinciones acuosas como Mayer s hematoxylin o Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (nº de catálogo S3309). Después de la contratinción con hematoxilina lave bien con agua destilada y sumerja los portaobjetos de tejido en un baño con agua amoniacal, 0,037 mol/l o un agente similar que tiña de azul. El agua amoniacal (0,037 mol/l) se prepara mezclando 2,5 ml de hidróxido de amoniaco 15 mol/l (concentrado) con 1 litro de agua. El agua amoniacal 0,037 mol/l no utilizada puede almacenarse a temperatura ambiente (20 25 C) en un frasco herméticamente cerrado hasta por 12 meses. Consulte las normas del fabricante para procedimientos alternativos de contratinción. Medio de montaje Se recomienda Gycergel Mounting Medium (nº de catálogo C0563) o Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nº de catálogo S3025) para el montaje acuoso. Glycergel debe calentarse hasta al menos 50 C justo antes de usar. También puede utilizarse el medio de montaje permanente no acuoso Ultramount (nº de catálogo S1964). Almacenamiento EnVision+, HRP debe almacenarse a 2 8 C. No conge lar. No lo utilice después de la fecha de caducidad impresa en los viales de los reactivos y en la etiqueta del kit. La alteración en el aspecto de cualquier reactivo, como precipitados, puede indicar inestabilidad o deterioro. En tales casos, el reactivo o los reactivos no debe(n) utilizarse. No existen signos obvios que indiquen la inestabilidad de estos productos. Por lo tanto, deben analizarse controles positivos y negativos en simultaneidad con las muestras de los pacientes. Si se observan tinciones inesperadas que no puedan atribuirse a las variaciones en los procedimientos de laboratorio y sospecha que existe un problema con el kit, contacte con el servicio de asistencia técnica de Dako. Preparación de las muestras Tejido incluido en parafina Consulte las Instrucciones generales de tinción inmunohistoquímica y/o la Hoja de especificaciones para anticuerpos. Antes de la tinción IHQ, los tejidos deben fijarse y procesarse. La fijación impide la autolisis y la putrefacción de los tejidos extirpados, conserva la antigenidad, estimula el índice de refractariedad de los constituyentes tisulares y aumenta la resistencia de los elementos celulares para el procesamiento del tejido. El procesamiento del tejido incluye la deshidratación, eliminación de los agentes deshidratantes, infiltración del medio de inclusión, inclusión y corte de los tejidos. Los fijadores más comunes para las preparaciones de tejido IHQ se discuten en la sección Instrucciones generales de tinción inmunohistoquímica.. Estas son solamente pautas. El usuario debe determinar y verificar los procedimientos óptimos. (Para obtener información específica relacionada con el procesamiento y la fijación del tejido, vea las referencias 1 y 2). Procedimiento de tinción Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer atentamente estas instrucciones y familiarizarse con los componentes del producto antes de utilizarlos. El reactivo y las instrucciones suministradas fueron diseñados para obtener un rendimiento óptimo. Una dilución mayor de los reactivos o la alteración de los tiempos o temperaturas de incubación pueden producir resultados erróneos. Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C) antes de la inmunotinción. Asimismo, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido secos pueden mostrar un aumento de la tinción inespecífica. Cubra los portaobjetos expuestos a corrientes de aire. Si se utilizan incubaciones prolongadas, coloque los tejidos en un ambiente húmedo. La sensibilidad de EnVision+, HRP puede aumentarse más alargando 5 10 minutos el período de incubación de los pasos 2 y 3. (107509-004) 302059ES_003 p. 3/6
Protocolo de tinción PASO 1. BLOQUEO DE LA PEROXIDASA Elimine el exceso de tampón. Con un tejido sin hilos (como Kimwipe o una gasa), limpie con cuidado alrededor de la muestra para eliminar el líquido sobrante y mantener el reactivo dentro del área indicada. Aplique suficiente Peroxidase Block para cubrir la muestra. Incube durante 5 (±1) minutos. Aclare suavemente con agua destilada o solución tampón de una botella de lavado (no apunte el chorro directamente sobre el tejido) y coloque en un baño con tampón fresco. PASO 2. ANTICUERPO PRIMARIO O REACTIVO DE CONTROL NEGATIVO Elimine el exceso de agua y limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficiente anticuerpo primario óptimamente diluido o reactivo de control negativo para cubrir la muestra. Incube durante 30 (±1) minutos. Aclare suavemente con solución tampón de una botella de lavado (no dirija el chorro directamente sobre el tejido) y coloque en un baño con tampón fresco. Si tiene que suspenderse el procedimiento de tinción, los portaobjetos pueden mantenerse en un baño con tampón tras la incubación del anticuerpo primario (paso 2) durante una hora como máximo a temperatura ambiente (20 25 C) sin afectar la efi cacia de la tinción. PASO 3 POLÍMERO HRP MARCADO CONTRA RATÓN Elimine el exceso de agua y limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficiente Labelled Polymer para cubrir la muestra. Incube durante 30 (±1) minutos. Aclare los portaobjetos como se indicó en el paso 2. PASO 4 SUSTRATO-CROMÓGENO Limpie los portaobjetos como se indicó anteriormente. Aplique suficiente solución sustrato-cromógeno para cubrir la muestra. Incube durante 5-30 minutos. Aclare suavemente con agua destilada de una botella de lavado (no apunte el chorro directamente sobre el tejido). Recoja los desperdicios de sustrato-cromógeno en un recipiente para materiales peligrosos para su correcta eliminación. PASO 5 CONTRATINCIÓN CON HEMATOXILINA (OPCIONAL) Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina acuosa (nº de catálogo S3309). La duración de la incubación depende de la dilución de la hematoxilina utilizada. Aclare suavemente en un baño con agua destilada. Sumerja los portaobjetos 10 veces en un baño de agua amoniacal, 0,037 mol/l o un agente similar que tiña de azul. Aclare los portaobjetos en un baño de agua destilada o desionizada durante 2 5 minutos. PASO 6 MONTAJE Las muestras pueden montarse o colocarse en cubreobjetos con medio de montaje acuoso como Glycergel Mounting Medium (nº de catálogo C0563) o Faramount (nº de catálogo S3025) o medio de montaje permanente no acuoso, Ultramount (nº de catálogo S1964). Nota: Los portaobjetos pueden leerse cuando sea necesario. Sin embargo, puede producirse alguna decoloración si los portaobjetos se exponen a luz intensa durante una semana. Para minimizar la decoloración, almacene los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente (20 25 C). Control de calidad Las diferencias en el procesamiento del tejido y en los procedimientos técnicos en el laboratorio del usuario pueden producir una variabilidad importante en los resultados, necesitándose la eficacia regular de los controles de cada laboratorio además de los siguientes procedimientos. Consulte las normas de control de calidad del programa de certificación del Colegio de Patólogos Americanos (CAP) para inmunohistoquímica y las referencias 3 a 5 para obtener información adicional. Consulte la hoja de especificaciones de cada anticuerpo primario utilizado para obtener detalles relacionados con la sensibilidad e inmunorreactividad. Consulte las Instrucciones generales de tinción inmunohistoquímica para obtener información sobre los controles positivos y negativos. Interpretación de la tinción Consulte las Instrucciones generales de tinción inmunohistoquímica para acceder a las pautas de interpretación. (107509-004) 302059ES_003 p. 4/6
Limitaciones Consulte las Instrucciones generales de tinción inmunohistoquímica para acceder a las limitaciones generales. El uso de fijadores viejos o sin tamponar, o la exposición de los tejidos a excesivo calor (más de 60 C) durante su procesamiento puede producir una disminución en la sensibilidad de la tinción. Puede encontrarse actividad seudoperoxidasa o actividad de la peroxidasa endógena en hemoproteínas como hemoglobina, mioglobina, citocromo y catalasa así como en los eosinófilos. 6,7 Esta actividad puede verse inhibida por la incubación de las muestras con Peroxidase Block durante cinco minutos antes de aplicar el anticuerpo primario. Los frotis de médula ósea y la sangre y los tejidos congelados también pueden tratarse con este reactivo. Sin embargo, este procedimiento no anula el pigmento marrón rojizo de las hemoproteínas. De forma alternativa, puede utilizarse una solución de metanol y peróxido de hidrógeno. Algunos antígenos pueden desnaturalizarse con este procedimiento. Los tejidos de personas infectadas con el virus de la hepatitis B y que contienen el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) pueden mostrar tinción inespecífica con la peroxidasa de rábano. 8 Los sueros normales/no inmunes de la misma fuente animal que el antisuero secundario utilizado en los pasos de bloqueo pueden producir resultados falsos negativos o falsos positivos causados por autoanticuerpos o anticuerpos naturales. Los reactivos suministrados en este kit están óptimamente diluidos. Una dilución mayor puede provocar la pérdida de tinción del antígeno. Solución de problemas Problema Causa probable Acción sugerida 1. Los portaobjetos no se tiñen. 1a. Los reactivos no se utilizaron 1a. Revise la aplicación de los en el orden correcto. reactivos. 2. Todos los portaobjetos se tiñen débilmente. 3. Excesiva tinción de fondo en todos los portaobjetos. 1b. Azida sódica. 2a. Las secciones retienen demasiada solución después del baño de lavado. 2b. Los portaobjetos no se incubaron el tiempo suficiente. 3a. Las muestras tienen mucha actividad de la peroxidasa endógena. 3b. No se retiró completamente la parafina. 3c. No se aclararon bien los portaobjetos. 3d. Reacción del sustrato más rápida de lo normal debido, por ejemplo, a temperatura ambiente excesiva. 3e. Los cortes se secaron durante el procedimiento de tinción. 3f. Unión inespecífica de los reactivos al corte de tejido. 3g. Anticuerpo demasiado concentrado. 1b. Utilice tampón fresco, sin azida. 2a. Elimine suavemente el exceso de solución antes de limpiar alrededor del corte. 2b. Revise los tiempos de incubación recomendados. 3a. Utilice un tiempo de incubación mayor para el bloqueante de la peroxidasa. 3b. Utilice baños frescos de xileno o tolueno. Si se tiñen simultáneamente varios portaobjetos, el segundo baño de xileno debe contener xileno fresco. 3c. Utilice soluciones frescas en los baños de tampón y las botellas de lavado. 3d. Utilice un tiempo de incubación menor con la solución de sustrato-cromógeno. 3e. Utilice una cámara húmeda. Limpie solamente 3-4 portaobjetos por vez antes de aplicar el reactivo. 3f. Aplique una solución bloqueante que contenga una proteína irrelevante. 3g. Use una dilución superior del anticuerpo primario. NOTA: Si el problema no puede atribuirse a ninguna de las causas anteriores o si la solución sugerida no resuelve el problema, llame al servicio técnico de Dako para obtener asistencia. Puede encontrarse información adicional sobre técnicas de tinción y preparación de las muestras en el manual Immunochemical Staining Methods 2 (comercializado por Dako), Atlas of Immunohistology 9 and Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis 10 (107509-004) 302059ES_003 p. 5/6
Referencias Referencias adicionales 1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981:81 2. Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous Peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20 25 Edition 11/12 (107509-004) 302059ES_003 p. 6/6