DIAGNOSTICO PRECOZ DE GESTACION EN GANADERIA El plazo que debe transcurrir entre dos partos consecutivps de una misma vaca lechera es de 365 días; este período de tiempo incluye 305 días de lactación y 60 días en los que el animal permanece seco, es decir, sin ser ordeñado, recuperándose del desgaste que ha supuesto para él la lactación pasada y preparando su organismo para la siguiente. Cuando este ritmo reproductivo se altera por defectos de manejo, alteraciones patológicas u otras circunstancias, el período improductivo del animal se prolonga, ocasionando el correspondiente perjuicio económico para el ganadero. Según cálculos de la «Milk Marketing Board» de Gran Bretaña, cada día que se alarga el período interparto en una vaca por encima de los 365 indicados, su propietario pierde 160 pesetas. Consideraciones análogas podrían hacerse en lo que respecta al ritmo reproductivo de otras especies ganaderas, como el ovino o el Centro de Reproducción Animal del CRIDA-06, situado en la zona de Puerta de Hierro, de Madrid. porcino, sin embargo, los datos concretos relativos a vacas de leche expuestos anteriormente, son más que suficientes para poner de manifiesto lo importante que es conseguir que el ritmo reproductivo del ganado sea normal y evitar que dentro del rebaño haya hembras que se encuentran vacías cuando deberían estar en gestación. Para ello, es necesario descubrir lo antes posible la situación de estos animales, es decir, hay que hacer un diagnóstico precoz de gestación en toda hembra al poco tiempo de haber sido cubierta por el macho, y, en los casos en que éste resulte negativo, estudiar, sin pérdidas de tiempo inútiles, las causas que impiden el que se establezca una gestación normal y poner el remedio o tratamiento adecuado para corregirlas. Estado actual del diagnóstico precoz de gestación en España En los últimos años, el Departamento de Reproducción Animal del CRIDA 06, ubicado en Madrid, ha trabajado para poner a punto una tecnología capaz de llevar a cabo el diagnóstico precoz de gestación en diversas especies ganaderas a nivel de aplicación práctica, es decir, de forma que resulte útil para los ganaderos españoles. Los estudios llevados a cabo en este Departamento y la colaboración que ha mantenido con otros centros extranjeros de reproducción animal, especialmente con los dependientes del INRA francés, han hecho posible alcanzar el objetivo propuesto. Con el fin de dar a conocer esta técnica de diagnóstico precoz de gestación y al mismo tiempo informar de los trabajos que el Centro está realizando en este campo para perfeccionar o estudiar las posibilidades que ofrecen otras técnicas distintas de la que ya se aplica en la actualidad, el día 25 de noviembre tuvo lugar una mesa redonda en el mencionado Departamento de Reproducción Animal, a la que asistieron un centenar de técnicos procedentes de toda España, pertenecientes al sector privado, entes territoriales y organismos oficiales. 6
El Jefe del Departamento, doctor Pérez García, inició la exposición de los temas a tratar y describió con detalle los fundamentos del método de diagnóstico precoz de gestación por radio-inmuno-análisis en vacas, ovejas, cerdas y yeguas, y la forma de realizarlo. Diversos colaboradores del doctor Pérez García informaron también en esta mesa redonda sobre los trabajos que llevan a cabo en el Centro, en relación con el diagnóstico precoz de gestación en diversas especies ganaderas. A continuación se hace un resumen de lo tratado en la reunión por considerar que es de interés para muchos técnicos y ganaderos españoles. Diagnóstico precoz de gestación por radio-inmuno-análisis La técnica de diagnóstico puesta a punto por el Departamento del CRIDA-06 es, como se ha dicho anteriormente, la de radio-inmunoanálisis y se basa en determinar la concentración de progesterona que hay en la sangre o en la leche de las hembras cuyo estado trata de conocerse, porque esta concentración varía a lo largo del ciclo estral o cuando éste se interrumpe al producirse una gestación. Para comprender mejor este método de diagnóstico de gestación conviene recordar, aunque sea muy someramente, ciertos aspectos endocrinos relacionados con las funciones de reproducción. El ciclo estral Para que se produzca un nuevo ser es necesario que un óvulo maduro sea fecundado por un espermatozoide. Los óvulos son producidos por los ovarios. El desarrollo de los ovocitos que, al madurar, se transforman en óvulos, tiene lugar en el interior de unas formaciones vesiculares denominadas folículos de Graaf. El desprendimiento de los ovocitos de la superficie del ovario constituye la ovulación. En las hembras de las especies ganaderas poliéstricas o cíclicas, es decir, que producen óvulos durante todo el año o en la mayor parte de él, las ovulaciones se suceden unas a otras de forma rítmica, o sea cada cierto número de días, a no ser que entren en gestación o padezcan determinados procesos patológicos del aparato reproductor. El tiempo que transcurre entre dos ovulaciones consecutivas constituye un ciclo estral y su duración depende de la especie de que se trate; así, por ejemplo, en la vaca y en la cerda es de 21 días, por término medio, mientras que en la oveja es 16,5 y en la yegua, 22. Cualquiera que sea la duración del ciclo estral, cabe distinguir en él varias fases, denominadas proestro, estro, metaestro y diestro. Durante el proestro tiene lugar en el ovario el crecimiento y maduración del folículo. El estro es la fase del ciclo en la que tiene lugar la ovulación, es decir, la rotura del folículo que permite la liberación del ovocito; la hembra exterioriza esta circunstancia mediante el celo, dando lugar a una serie de manifestaciones y actitudes en su comportamiento que favorecen la unión fecundante con el macho. La fase siguiente es el metaestro. En ella tiene lugar la formación del cuerpo lúteo en el ovario como resultado de la evolución del folículo roto. En el caso de que se haya producido la fecundación y se establezca una gestación el cuerpo lúteo o amarillo permanecerá mientras dure ésta. Por el contrario, si la hembra no queda en gestación, el cuerpo lúteo desaparece al cabo de unos días y sobreviene un período de descanso en la función ovárica, denominado diestro. El diestro tiene una duración variable y termina al iniciarse la fase de proestro de un nuevo ciclo. Las hormonas y el ciclo estral Hay una gran correlación entre el desarrollo del ciclo estral y la producción de hormonas en el organismo de las hembras. Por una parte, el lóbulo anterior de la hipófisis, estimulado por el hipotálamo, segrega la hormona folículoestimulante (FSH) y la hormona luteinizante (LH). Estas dos hormonas se conocen también con el nombre de hormonas gonadotropas o estimulantes de los órganos en los que se forman las células sexuales. La FSH estimula el desarrollo y maduración de los folículos en el ovario. La LH determina la ovulación y el establecimiento del cuerpo lúteo. Por otro lado, el propio folículo y el cuerpo lúteo son productores de hormonas sexuales. El folículo segrega estrógenos y el cuerpo Iúteo produce, sobre todo, progesterona, que vierte en la sangre y que, además de encontrarse en este líquido orgánico, pasa también a la leche. La concentración que alcanzan en la sangre todas estas hormonas varía mucho según la 7.,)
n Ovulación ESTRÓGENOS LH PROGESTERONA os n n 11 i i II Niveles de algunas hormonas sexuales en el plasma sanguíneo de la vaca en las distintas fases del ciclo estral. i ji i I \,r 1 n,.. n.. n n., 19 20 21 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Proestro Estro Metoestro Diestro Proestro fase del ciclo estral en que se encuentre el animal. Así, por ejemplo, el estradiol alcanza niveles altos durante el estro, disminuye y sufre diversas fluctuaciones mientras dura la fase de metaestro y vuelve a elevarse en el diestro. En cambio, la progesterona tiene un nivel muy bajo en sangre durante el estro; aumenta su concentración en ella durante el metaestro y vuelve a disminuir al final del ciclo, es decir, en el diestro. Sin embargo, cuando una hembra es cubierta por el macho y queda en gestación el ciclo estral se interrumpe y la concentración de progesterona en la sangre no sufre estas oscilaciones, manteniéndose en los niveles altos alcanzados durante el metaestro e incluso elevándose por encima de ellos a medida que avanza la gestación. Aplicación práctica de estos conocimientos Sabemos ya que el diagnóstico precoz de gestación mediante radio-inmuno-análisis está basado en la concentración de progesterona en la sangre o en la leche de las hembras, y conocemos como evoluciona este nivel a lo largo del ciclo estral o cuando sobreviene una gestación. Veamos ahora los pasos que hay que seguir en la práctica para poder llevar a cabo el diagnóstico haciendo uso de este método. Para realizar el radio-inmuno-análisis son necesarios unos pocos centímetros cúbicos de plasma sanguíneo o de leche, porque esta técnica está basada en reacciones de tipo inmunológico y permite medir concentraciones de progesterona en los líquidos orgánicos citados cuando se encuentra en cantidades tan pequeñas que han de medirse en nanogramos (ng = 10-9 g)* o picogramos (pg = 10-12 g) por mililitro. La obtención de las muestras y el proceso que después deben seguir éstas es el que se indica a continuación por separado, según se trate de sangre o de leche. Determinación de progesterona en sangre Basándose en los estudios realizados, la toma de la muestra de sangre debe hacerse en las vacas el día 22 contado desde la fecha en que los animales tuvieron el último celo. Cuando se trata de ovejas la recogida de la muestra debe hacerse en los días 17 ó 18, y, finalmente, en la yegua la muestra ha de tomarse el día 18 contado desde el día en que el animal no admite al caballo. Es muy importante que las muestras sean recogidas en las fechas indicadas para que el resultado del análisis sea fiable, ya que el contenido de progesterona en la sangre es muy diferente según se encuentre la hembra en gestación o no. Concretamente, en el primer caso, es decir, cuando hay gestación, el nivel de esta hormona en el plasma sanguíneo es I*/ El nanogramo es la mil millonésima parte del gramo.
alto (más de 6,9 ng/ml), mientras que si no la hay la concentración es muy baja (menos de 0,5 ng/m1). En el caso de que las muestras se tomen dos o tres días antes o después de las fechas indicadas, los análisis mostrarán contenidos medios de progesterona, que frecuentemente darán lugar a errores de diagnóstico. La muestra de sangre de cada animal debe recogerse en un tubo heparinizado para evitar que coagule, e inmediatamente se debe centrifugar para separar del plasma los eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Es necesario que la centrifugación se haga lo más rápidamente posible después de recoger la muestra porque los hematíes tienen enzimas que alteran la progesterona. A continuación el plasma se somete a refrigeración para mantenerlo a una temperatura próxima a O C y, de esta forma, se envía al laboratorio para proceder al análisis. La necesidad de refrigerar el plasma hasta alcanzar la temperatura indicada se debe a que a temperatura ambiente se altera también la progesterona. Cuando las muestras de sangre llegan al laboratorio se analizan siguiendo la técnica que se ha indicado anteriormente, es decir, mediante radio-inmuno-análisis. Se trata de una técnica compleja que no vamos a describir, por considerar que no es necesario conocerla con detalle para comprender la utilidad de este procedimiento de diagnóstico. Solamente conviene indicar que está basada en Dosimetría de reactivos para su valoración en el contador de centelleo líquido. una reacción de tipo inmunológico, en la que se utiliza como reactivo en un determinado momento del proceso progesterona marcada con tritio, isótopo radiactivo del hidrógeno, y que requiere el empleo de un contador de centelleo líquido para determinar la radiactividad resultante después de las reacciones inmunológicas a que se somete la muestra. Cuando la radiactividad que detecta el aparato es alta, Progesterona ng/ml El gráfico muestra el contenido de progesterona en el plasma sanguíneo de la vaca al cabo de 22 días del último celo, según se encuentre el animal en gestación o no. La línea horizontal de puntos indica un contenido de progesterona alto y corresponde a un animal que está entonces en gestación, mientras que la línea inferior de trazo continuo en esos mismos días representa un bajo nivel de progesterona propio de un animal que no se encuentra en gestación. 10 Salto Diagnóstico precoz 19 22 7 Días 9
Progesterona 30- Grasa de la leche (ng/10941) ---- Leche (ng/ml) Suero (ng/ml) 25-20- 15-.... /,/ Evolución del contenido de progesterona en la leche de vaca y en la grasa y el suero de este producto a lo largo del ciclo estral. 10- s- 10 1.5 1 20 n' Días es señal de que en la sangre del animal había poca progesterona y, por tanto, el animal no estaba en gestación; y, a la inversa, poca radiactividad indica un alto nivel de progesterona en la muestra de sangre que se analiza y, por consiguiente, que ésta procede de una hembra que se encuentra en gestación, si la muestra fue obtenida el día adecuado. Determinación de la progesterona en leche Ya se ha dicho anteriormente que la progesterona, además de encontrarse en la sangre, se halla también en la leche de las hembras que se encuentran en período de lactación. La determinación de la concentración de progesterona en el plasma sanguíneo para diagnosticar precozmente la gestación es un procedimiento más seguro y sencillo, en lo que se refiere a técnica de laboratorio, que cuando se hace en leche; sin embargo, tiene el inconveniente de que la recogida, preparación y envío de muestras al laboratorio resultan bastante complicadas y difíciles de realizar para un gran número de ganaderos. Las dificultades radican concretamente en que es necesario, en primer lugar, sangrar a los animales, después centrifugar la muestra de sangre, para lo cual es preciso disponer de un aparato que no existe en la mayoría de las explotaciones ganaderas, y por último, hay que refrigerar el plasma hasta O C, aproximadamente, y mantenerlo en estas condiciones hasta que llega al laboratorio donde se hace el análisis. Por todo ello, se ha puesto a punto la técnica para poder efectuar los análisis con muestras de leche, que el ganadero recoge con facilidad y envía al laboratorio sin necesidad de cuidados especiales. Para recoger las muestras de leche deben tenerse en cuenta las siguientes normas. El momento de la recogida ha de ser el mismo que se ha indicado para hacer la toma de las muestras de sangre, es decir, el día 22 a partir del celo en las vacas, el 18 después del cese del celo en las yeguas y el 17 ó 18 en las ovejas. La muestra, formada por 5 a 8 centímetros cúbicos de leche, debe tomarse al comienzo del ordeño, porque el contenido graso de la GAMMA-COUNTER para la determinación de radiaciones gamma en la valoración de hormonas proteicas que inciden en la reproducción. 10
leche recogida entonces es bajo, lo que facilita, posteriormente, el proceso de análisis en el laboratorio. Antes de mandar la muestra al laboratorio se le añade una pastilla de dicromato potásico, que actúa como conservador sin necesidad de proceder a refrigerarla. Después, cuando la muestra llega al laboratorio, se procede a determinar su contenido en progesterona, siguiendo la técnica del radio-inmuno-análisis ya mencionada, aunque adaptada a muestras de leche, para emitir el correspondiente diagnóstico. Resultados obtenidos con este método En el Departamento de Reproducción Animal del CR IDA-06 se han llevado a cabo más de 10.000 análisis siguiendo esta técnica. En más de 7.000 casos el diagnóstico fue positivo, es decir, los análisis indicaron que los animales correspondientes se encontraban en gestación; en el 85 por 100 de ellos se confirmó posteriormente que efectivamente había gestación real. Por otra parte, más de 3.000 muestras dieron resultado negativo al analizarlas y después se comprobó que en el 98,8 por 100 el resultado del análisis era cierto, lo que prueba el alto grado de fiabilidad de esta técnica. El porcentaje de casos positivos confirmados en la realidad que, como se ha dicho, es del 85 por 100, es más bajo que el porcentaje de los casos negativos que está muy próximo al 100 por 100 como hemos visto. Esto no quiere decir que la técnica falle y señale que el contenido de progesterona en sangre o leche es alto, aunque esto no ocurra; ese 15 por 100 de resultados positivos según el análisis, que luego no se corresponden con una gestación real, se debe a que después de realizar el análisis pueden producirse reabsorciones de embriones o a que existen anomalías funcionales del ovario que dan lugar a altas concentraciones de progesterona en los líquidos orgánicos, sin que realmente exista gestación; por ejemplo, cuerpos lúteos persistentes. El diagnóstico precoz de gestación en ganadería en el futuro Lo expuesto anteriormente pone de manifiesto que existe ya una técnica que permite diagnosticar precozmente con bastante fiabilidad el estado de gestación de las hembras del ganado vacuno, equino, ovino y porcino, aunque en esta última especie la experiencia en este aspecto es menor que en las otras tres. Es más, hay que señalar que esta técnica resulta segura, casi al 100 por 100, para descubrir las situaciones en las que no hay gestación, lo cual es mucho más importante desde el punto de vista práctico, porque permite instaurar muy pronto los tratamientos oportunos para corregir las causas que impiden una gestación normal. Sin embargo, las investigaciones en este campo continúan con el fin de lograr alguno de los siguientes objetivos: Sustituir la técnica del radio-inmuno-análisis por la del enzimo-inmuno-análisis, que presenta sobre la anterior estas ventajas: no requiere el empleo de isótopos radiactivos ni el contador de centelleo, ya que el diagnóstico está basado en reacciones colorimétricas; es más económica. Encontrar o poner a punto otras técnicas basadas en la determinación de la concentración en sangre, leche u orina de otros productos hormonales, tales como el sulfato de estrona o ciertos metabolitos de la prostaglandina F2a. A este respecto hay que señalar que en el ganado porcino existe ya una técnica basada en la determinación del nivel de sulfato de estrona en la sangre u orina en los días 22 a 25 después del último celo. Conocer mejor el mecanismo que impide que se produzcan fenómenos de rechazo inmunológico entre el huevo fecundado o el embrión y la madre. Descubrimientos recientes prueban que esto se debe al denominado «fac- Contador de centelleo liquido LKB-Wallac para determinación de radiaciones beta en la valoración de hormonas esteroides para el diagnóstico precoz de gestación. 11
Centrífuga refrigerada RC-3B para la metodología analítica en la determinación de hormonas de la reproducción. tor de gestación precoz» (EPF), sustancia inmuno-supresora que empieza a segregar el huevo fecundado a las pocas horas de producirse la unión del óvulo con el espermatozoide. La presencia de EPF en la sangre es posible detectarla mediante la denominada prueba de inhibición de la roseta o test inmunológico de la roseta. La puesta a punto de una técnica basada en esta prueba permitiría diagnosticar una gestación a los pocos días e incluso horas de haber dado comienzo aquella. También serviría para descubrir las situaciones en las que, aunque se ha realizado la monta, no ha habido fecundación o, si se ha producido ésta, no ha evolucionado normalmente hacia una gestación. Los elementos empleados para llevar a cabo la prueba inmunológica de la roseta son linfocitos ovinos, eritrocitos ovinos, suero ovino y suero problema. El nombre de esta prue- Contador de centelleo liquido Isocap 300. ba alude a la disposición que adoptan los linfocitos T y los eritrocitos ovinos, en el caso de que el suero problema corresponda a una hembra que no se encuentra en gestación y, por consiguiente, no tiene en su sangre la sustancia inmunosupresora EPF; tal disposición recuerda la forma de una pequeña flor, ya que alrededor de cada linfocito se sitúan cuatro o más eritrocitos. Conclusión Como resumen de todo lo expuesto conviene recordarjos siguientes puntos: El diagnóstico precoz de gestación tiene un gran interés económico en ganadería, porque descubre antes de que transcurra un ciclo ovárico completo, la falta de gestación en hembras que han sido cubiertas por los machos en el momento oportuno, y, esto, a su vez, permite estudiar las causas que impiden que la reproducción se realice normalmente y establecer el tratamiento adecuado. Además del diagnóstico clínico de gestación, basado en el comportamiento de los animales, en el examen de los genitales externos de las hembras y, a veces, en el empleo de ultrasonidos, existen en la actualidad métodos de laboratorio que permiten diagnosticar con precisión, rapidez y certeza la gestación en vacas, ovejas, yeguas y cerdas. Uno de estos procedimientos es el radioinmuno-análisis (R.I.A.), técnica que en España ha sido puesta a punto y realiza el Departamento de Reproducción Animal del CRIDA-06. El diagnóstico efectuado siguiendo este método se basa en determinar la concentración de progesterona que hay en la sangre o en la leche de las vacas veintidós días después del último celo. Por ello, para hacer un diagnóstico precoz de gestación empleando esta técnica, hay que enviar al laboratorio una muestra de sangre o de leche de cada una de las hembras cuyo estado se quiere conocer. La recogida de las muestras y su envío al laboratorio debe hacerse siguiendo exactamente las normas que han quedado expuestas con detalle anteriormente. Este método de análisis proporciona resultados muy satisfactorios y fiables, sin embargo, los trabajos de investigación en este campo continúan con el fin de poner a punto nuevas técnicas que permitan llevar a cabo el diagnóstico de gestación en ganadería con mayor anticipación, sencillez y economía. José Manuel Hernández Benedí 12