NUEVAS PERSPECTIVAS PARA LA REDUCCIÓN DE LAS

1 DIRECCION GENERAL DE TRAFICO OBSERVATORIO NACIONAL DE SEGURIDAD VIAL NUEVAS PERSPECTIVAS PARA LA REDUCCIÓN DE LAS LESIONES Y SECUELAS NEUROLÓGICAS ESTABLECIDAS TRAS UN ACCIDENTE DE TRÁFICO CON TRAUMA CRANEOENCEFÁLICO GRAVE J. Vaquero, M. Zurita, C. Bonilla ASOCIACION CIENCIAS NEUROLOGICAS

2 INTRODUCCION Y PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO En la actualidad las lesiones traumáticas constituyen la principal causa de muerte en personas menores de 45 años de edad, siendo el TCE (traumatismo craneoencefálico) la variedad que mayor relación tiene con las cifras de mortalidad. El TCE se define como cualquier lesión física o deterioro funcional del contenido craneal secundario a un intercambio brusco de energía mecánica. De acuerdo con estudios epidemiológicos existentes, la incidencia anual es de aproximadamente 200 casos por 100.000 habitantes. El grupo de edad de mayor riesgo es aquel comprendido entre los 15 y 24 años de edad, siendo los accidentes de tráfico la principal causa de las lesiones (Bruns et al, 2003). Por todo ello son muchos los estudios que se están llevando a cabo para intentar paliar las secuelas del daño cerebral traumático, con especial atención al producido tras un accidente de tráfico grave, causante de secuelas neurológicas supuestamente irreversibles. La mortalidad por TCE ha disminuido considerablemente desde que se reconoció la existencia de dos tipos de fenómenos secuenciales e interdependientes en el desarrollo de un TCE: la lesión primaria y la lesión secundaria. La lesión primaria es responsable de todas las lesiones nerviosas y vasculares que aparecen inmediatamente después de la agresión mecánica. Las lesiones anatómicas resultantes son la degeneración axonal difusa (principal causa del coma postraumático), muerte de neuronas y células gliales, contusiones, laceraciones y hematomas intracerebrales. Todo esto es debido a que la lesión primaria altera un sistema elevadamente integrado que carece casi totalmente de capacidad funcional de reparación siendo la plasticidad neuronal también muy limitada. La lesión secundaria es aquella que induce lesiones cerebrales producidas por fenómenos sistémicos e intracraneales, que aparecen en los minutos, horas o incluso en los primeros días que siguen a un TCE. Dado que la lesión primaria carece hoy de tratamiento específico, la reducción de la mortalidad y secuelas que se ha producido en el tratamiento de los TCE en los últimos años, viene dado al mejor control, conocimiento y prevención de los procesos que imperan en la lesión secundaria. Esta lesión secundaria también incluye muerte neuronal, formación de la cicatriz glial y generación de un microambiente que inhibe la reparación del tejido dañado. El daño cerebral post-traumático representa un gran problema médico y social ya que no existen terapias efectivas capaces de restablecer las secuelas que se producen tras el mismo. Por todo ello son numerosas las vías de investigación que están tratando de desarrollar protocolos de actuación para tratar las secuelas del TCE.

3 Nuevas perspectivas en el tratamiento de las lesiones traumáticas del Sistema Nervioso Central: Terapias protectoras y reparadoras La habilidad limitada del sistema nervioso para repararse ha centrado la atención de numerosos grupos, donde en un principio se trata de encontrar tratamientos farmacológicos que impidan o disminuyan el proceso de lesión primaria que se inicia tras un TCE (Lu et al, 2004a, 2004b, 2005; Qu et al, 2005). En principio todos estos estudios tratan de activar mecanismos protectores que inhiban mecanismos de muerte celular o apoptosis. En relación con las terapias protectoras, se está intentando estudiar sobre modelos experimentales de daño cerebral el posible efecto terapéutico de diversos factores neurotróficos, capaces de crear en el SNC un entorno propicio a los fenómenos de reparación, y entre ellos, se han utilizado el factor de crecimiento nervioso (Zhou et al, 2003), el factor de crecimieno fifroblástico tipo 2 (Yoshimura et al, 2003), o el factor de crecimiento análogo a la Insulina de tipo 1 (Saatman et al, 1997). De forma simultánea, se han ensayado protocolos de terapia génica, capaces de hacer llegar estos factores a las zonas lesionadas y lograr su permanencia en ellas por medio de células transfectadas (Longhi et al, 2004) y aunque estas estrategias ofrecen interesantes perspectivas, lo cierto es que su aplicacion requiere aún muchos estudios en lo que respecta a las vías y pautas de administración, y al empleo de los vectores víricos utilizados. Una segunda línea de investigación que está cobrando importancia creciente en los últimos años para intentar reparar el tejido nervioso lesionado es el empleo de protocolos de terapia celular con células madre. La posibilidad de regeneración del tejido nervioso usando estas células ha generado múltiples expectativas en relación al tratamiento de enfermadades del SNC. Los resultados obtenidos en estudios experimentales, permiten pensar en una no muy lejana posible aplicación de estas técnicas para paliar determinadas enfermedades humanas. Estas células serían capaces por una parte de liberar factores neurotróficos, y por otra, de reparar el tejido nervioso lesionado por medio de su diferenciación hacia células nerviosas adultas. Las células madre En los últimos años existe un gran interés por el tema de las llamadas «células madre» y su posible potencial terapéutico para paliar determinadas enfermedades en el ser humano. Existen diferentes tipos de células madre. Dentro de los tipos de células madre, las células madre embrionarias son las más pluripotenciales, tienen una gran capacidad para proliferar in vitro y mantienen la posibilidad de diferenciarse hacia una gran variedad de líneas celulares. Los primeros estudios experimentales se hicieron utilizando dichas células madre embrionarias (Yoshizaki et al, 2004) y células madre fetales (Gao et al, 2006). Es difícil que estos estudios lleguen a una aplicación clínica en pacientes, por las dificultades, técnicas y ético-legales, a la hora de poder aislar este tipo de células, y por ello, más frecuentemente se emplean las células madre adultas.

4 Células madre adultas Las células madre adultas pueden obtenerse de diferentes tejidos, siendo la fuente más utilizada para obtener estas células madre adultas o células madre mesenquimales (CMM) el estroma de la médula ósea. Las CMM de la médula ósea constituyen una población muy heterogénea totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas, y su papel principal es contribuir a la regeneración de los tejidos de origen mesenquimal tales como hueso, cartílago, músculo, ligamento, tendón, tejido adiposo y estroma (Prockop, 1997). La esperanza terapéutica principal que se tiene con el uso de las células madre y en concreto con las CMM es la posibilidad de realizar trasplantes antólogos para tratar determinadas enfermedades humanas, sin la necesidad de administrar drogas inmunosupresoras con sus nocivos efectos secundarios. Las CMM se obtienen clásicamente por su tendencia de adhesión al plástico de los frascos de cultivo (Friedenstein et al, 1976), dichas células pueden dividirse rápidamente y por ello son habitualmente utilizadas en trabajos experimentales de laboratorio. Las CMM pueden ser inducidas in vitro para diferenciarse en multitud de linajes celulares diferentes bajo determinados medios de cultivo (Sánchez-Ramos el al, 2000; Woodbury el al, 2000). Estas células son multipotenciales y hoy día sabemos que, bajo determinados estímulos, pueden transdiferenciarse a células nerviosas, tanto in vitro como in vivo, y son capaces, a largo plazo, de regenerar el tejido nervioso sometido a lesiones traumáticas. Hay evidencias de transdiferenciación neuronal in vitro de células madre del estroma de la médula ósea por medio de sustancias químicas o factores de crecimiento (Zurita et al, 2007a, 2008a) y por métodos biológicos, donde se observa que las CMM se diferencian a un fenotipo neuronal cuando son co-cultivadas en presencia de células de Schwann (Zurita et al, 2007b). Terapia celular con CMM en modelos de lesión traumática del SNC En esta línea de investigación, hay grupos que aportan una amplia experiencia con el empleo de las células madre adultas de la médula ósea en modelos experimentales de lesión traumática crónica de la médula espinal, obteniendo buenos resultados funcionales tras el trasplante intralesional de dichas células en las lesiones medulares (Vaquero et al, 2006; Zurita et al, 2006, 2008b). Como consecuencia de estos estudios se han obtenido evidencias a favor de que las CMM del estroma de la médula ósea no requieren ser diferenciadas in vitro antes de su implantación en zonas lesionadas de Sistema Nervioso para lograr un efecto funcional beneficioso, lográndose este efecto tanto a través de una transdiferenciación local por factores ambientales, como posiblemente, al menos en las fases inmediatas tras el trasplante, por medio de la liberación de factores tróficos capaces de inducir a su vez la proliferación de células madre neurales endógenas (Chen et al 2002; Lu et al, 2003; Mahmood et al, 2004) y por último, realizando un efecto protector sobre las células que permanecen en las zonas lesionadas. Tratamiento del TCE con CMM En los últimos años se han iniciado diversos estudios experimentales que tratan de estudiar el efecto terapéutico de la CMM en las secuelas del daño post-traumático cerebral, con el propósito de encontrar datos que permitan aplicar esta forma de terapia celular en ensayos clínicos con pacientes. Hay estudios que intentan comprobar el potencial terapeutico de las

5 CMM administradas intravenosamente (Lu et al, 2001a; Mahmood et al, 2003, 2004) donde se ha visto que un porcentaje muy bajo de células llega al cerebro y por tanto muy pocas de ellas se diferencian hacia elementos neurales. También se ha estudiado su capacidad reparadora en trasplantes intraarteriales (Lu et al, 2001b), concluyendo que no es la forma de terapia mas efectiva ya que se puede producir isquemia cerebral aumentando el daño traumático en los animales tratados. La evidencia científica ha mostrado que las CMM, una vez trasplantadas intralesionalmente en el cerebro de ratas adultas, reducen los déficits funcionales aparecidos inmediatamente tras sufrir un accidente vascular (Chen et al, 2001a) o un traumatismo (Chopp et al, 2002; Mahmood et al, 2002), debido a su administración en fase aguda, es decir a las horas o pocos días tras producirse la lesión. Como ya se ha mencionado, una de las utilidades de las células madre mesenquimales, debido a su capacidad de diferenciación hacia elementos neurales y su capacidad de migración, es la posibilidad de tratar dichas lesiones a través de dos posibles mecanismos: por un lado por la activación de las propias células progenitoras neurales, ya que se sabe que las CMM son bombas liberadoras de factores tróficos y por otro lado contribuir a la reparación del tejido dañado, ya que estas células son implantadas en la propia lesión (Chopp et al, 2000; Hofstetter et al, 2002). La diferenciación de las CMM ha sido observada en aquellos estudios de terapia celular sobre lesiones cerebrales donde se han administrado en fase aguda, mostrando que un pequeño número de células trasplantadas presentan marcadores típicos neurales tales como marcadores neuronales, Neu N (Lu et al, 2001a), marcador típico de astrocitos, PGFA, marcador CNPasa de oligodendrocitos y marcador microglial OX-42 (Lu et al, 2006). Al mismo tiempo se han observado mejoras tanto motoras como sensoriales. Sin embargo, el número de células donantes encontradas expresando marcadores neurales fue bajo, tanto en los trasplantes en los que se administraron intravenosa o intraarterialmente, como en aquellos en los que se realizó un trasplante intralesional. La hipótesis que se maneja al respecto señala que esta recuperación funcional puede deberse a una interacción entre las células trasplantadas y el tejido cerebral, lo cual se refleja en una producción de factores de crecimiento y citoquinas. Pudiendo ser el efecto el aumento de la proliferacion celular después del trasplante de las CMM ( Mahmood et al, 2004). En la actualidad se están desarrollando vías de administración conjunta de CMM y factores de crecimiento (Bhang et al, 2007), donde parece que la actividad apoptótica en los animales trasplantados con CMM humanas y factor de crecimiento fibrobástico es la mitad que en el grupo de animales trasplantados únicamente con células. Uno de los problemas que se plantea en prácticamente todos los estudios mencionados, es que aunque se encuentran células trasplantadas en la zona de lesión, y aunque éstas muestran fenotipos de elementos neurales aparecen en muy bajo número, por lo que no se detecta una reducción del volumen de lesión, posiblemente porque las cavidades posttraumáticas son muy amplias, y las células encuentran un ambiente poco favorable para poder sobrevivir y proliferar, y en mucha menor medida diferenciarse. Aunque los resultados obtenidos con los trasplantes de las células madre adultas parecen estar dando sus frutos, y aunque cada vez parece más claro que tal vez el futuro esté en desarrollar terapias combinadas (Mahmood et al, 2007), aún queda una cuestión importante por resolver, en la que parece que aún no se han centrado los investigadores. Tanto con la administración intravenosa como con la administración intracraneal se encuentran células marcadas en los bordes de la lesión (Chopp et al, 2002; Lu et al, 2001a; Mahmood et al, 2002, 2003) quedando un gran vacío en el que ni los factores de crecimiento ni las propias células pueden actuar. Posiblemente esto se deba a que estos protocolos de administración de las células siempre se han desarrollado en fases tempranas tras producirse el daño, dónde el efecto protector de las CMM puede tener un mayor papel que el reparador.

6 Cuando se produce un TCE, en el que ya se han desarrollado los procesos de lesión primaria y lesión secundaria, el tejido se reabsorbe quedando como resultado un gran agujero allí donde se produjo el daño. El desarrollo de protocolos de administración de células madre en fases tardías tras producirse una lesión, puede tener un gran potencial dentro del tratamiento de las secuelas cerebrales crónicas establecidas. Estas células por un lado pueden establecer una serie de interacciones con las propias células del cerebro que active, a través de la producción de factores neurotróficos y citoquinas, a las propias células madre neurales induciéndolas a proliferar y reparar el tejido lesionado, y por otro lado las propias células trasplantadas pueden ser capaces de integrarse en el circuito neuronal dañado, proliferando y diferenciandose hacia elementos neurales, traduciéndose en una recuperación sensorial y motora. Experiencia de nuestro grupo de investigación Nuestro grupo de investigación ha realizado estudios acerca de las posibilidades terapéuticas del empleo de CMM en las secuelas de las lesiones cerebrales crónicamente establecidas, con el objetivo fundamental de encontrar tratamientos paliativos útiles para abordar el grave problema médico y social que representan los accidentes de tráfico que se acompañan de trauma craneoencefálico grave. Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un modelo experimental de lesión traumática cerebral y hemos demostrado que la administración intralesional de CMM es útil para paliar las secuelas crónicamente establecidas tras un TCE grave, abriendo así la puerta a nuevos estudios en este campo con posible aplicación en pacientes discapacitados tras un accidente de tráfico causante de grave daño cerebral (Bonilla et al, 2009). Sin embargo, antes de plantearnos el inicio de ensayos clínicos en humanos, se hace preciso conocer nuevos datos acerca de la potencial utilidad de estas nuevas técnicas, y entre ellos conocer algunos indicios que nos permitan una aproximación a problemas como cuáles serían las características de déficit funcional más susceptibles de mejora y si todos los pacientes con graves secuelas serían candidatos a este tipo de terapia. El Objetivo principal de nuestro estudio sería hacer un estudio experimental que permita responder a la cuestión acerca de si existe un determinado grado de severidad de lesión neurológica, a partir de la cual no es esperable ninguna recuperación de las secuelas de los traumatismos craneoencefálicos mediante técnicas de terapia celular. MATERIAL Y MÉTODOS Modelo experimental de TCE Para el presente estudio se realizará un modelo de traumatismo cerebral adaptado de un protocolo previamente descrito en la literatura para inducir lesiones traumáticas en ratas Wistar adultas (Zurita et al, 2006). Los animales (hembras adultas) serán anestesiados con isoflurano y sometidos posteriormente a una craneotomía de 10 mm de diámetro sobre el hueso parietal derecho del cráneo, entre las suturas lambda y bregma. Tras la exposición de la dura madre cortical, se abrirá una ventana sobre la misma con el fin de exponer la corteza cerebral y se realizarás una lesión cerebral traumática por contusión, reproduciendo el mismo tipo de daño

7 cerebral que suele producirse en pacientes, en el caso de un traumatismo craneoencefálico en el curso de un accidente de tráfico. Zona de la craneotomía. A B Modelo de TCE en ratas dónde se muestra en la figura A el modelo de lesión traumática y en la B la zona de la craneotomía. Rata Wistar a la que se le acaba de realizar un traumatismo en el hemisferio derecho del cerebro. Se produce una lesión cerebral traumática dejando caer, desde una altura de 15 cm, sobre la superficie del cerebro, una barra de 12 mm de diámetro y 25 g de peso. Esta barra es guiada en su caída a través de un cilindro hueco, adaptado al área de la craneotomía y que permite realizar una lesión estandarizada que se define como el producto del peso de la barra por la

8 altura desde la cual se deja ésta caer. Con este modelo experimental, logramos producir una lesión cerebral grave. Tras la cirugía, las ratas serán colocadas en una cámara con temperatura y humedad controladas, realizándose cuidados postoperatorios acordes con la situación clínica de las mismas y procedimientos diarios de vigilancia. Evaluación de la función neurológica Para llevar a cabo el seguimiento de la función motora y sensorial se realizan un total de 2 test diferentes con el fin de detectar los posibles cambios en la función neurológica: Escala de valoración sensitivo-motora. Valoración en el test Video-tracking-Box (VTB) Los test se realizarán 10 veces antes del TCE, con el fin de establecer los valores basales de los animales, posteriormente se realizará un seguimiento dos veces por semana durante los dos meses que siguen al desarrollo de la lesión cerebral. La experiencia con este modelo experimental, que hemos obtenido tras más de 3 años de estudios previos en esta línea de investigación, es que aunque se realiza una lesión traumática estandarizada, las secuelas funcionales son variables, debido a la concurrencia de daño traumático en sí mismo, y un daño vascular, preferentemente causado por la contusión hemorrágica que se produce, y que es diferente de unos animales a otros. Esto condiciona que con el mismo tipo de severidad de trauma, podamos encontrar, a largo plazo, diferente grado de secuelas neurológicas, en cuanto a severidad de las mismas. Lesiones cerebrales producidas tras el traumatismo craneoencefálico en fase aguda (izda) y en un estadío crónico (dcha).

9 Escala de valoración sensitivo-motora La evaluación neurológica se realizará a través de la modificación de un test descrito previamente en la literatura, el test MNSs (Chen et al, 2001b). Dicho test modificado cuenta con una serie de valoraciones que abarca la función motora, sensorial, test de equilibrio de la viga y medida de ausencia de reflejos. Consta de una puntuación máxima de 19 puntos, donde se establece una serie de categorías de gravedad de la lesión según la puntuación obtenida: 1 a 6 puntos, lesión leve. 7 a 12 puntos, lesión moderada. 13 a 19 puntos, lesión severa. Escala de valoración sensitivo-motora donde se muestra el test de la viga donde en A se ve un animal antes de realizarle la lesión y en B un animal lesionado que no es capaz de mantener el equilibrio. Test sensorial y motor Puntos Test motor Levantando la rata por el rabo - Flexión de los miembros traseros - Flexión de los miembros delanteros - El animal está rotado 1 1 1

10 Situando la rata en el suelo - Camina normal - Inhabilidad para caminar recto - Circular hacia el lado parético ) 0 1 2 Test sensorial Test de orientación (Visual y Táctil ) 1 Test propioceptivo ( sensibilidad profunda) 1 Mantener el equilibrio con postura firme 0 Agarrarse al costado de la viga 1 Abrazado a la viga y 1 de los miembros cae de la viga 2 Test del equilibrio en la viga Abrazado a la viga y 2 de los miembros caen de la viga, o gira en la viga (>60 Seg) Conseguir el equilibrio en la viga pero cae fuera (>40 Seg) 4 Conseguir el equilibrio en la viga pero cae fuera (>20 Seg) 5 3 Caer fuera; no consigue el equilibrio o queda colgado de la viga (< 20 Seg) 6 Reflejo pinna (Sacudida de cabeza cuando tocamos oreja) 1 Reflejo corneal (Parpadeo del ojo cuando lo rozamos con un algodón ) 1 Ausencia de reflejos Reflejo Susto ( Respuesta motora cuando hacemos ruido con las palmas de las manos ) Inmovilidad y mirada fija 1 1 Temblor (Sacudida de perro mojado ) 1 Irritabilidad, crísis epilépticas, clonus y miodistonía (espasticidad) 1 Puntuación máxima 19 Para una evaluación más objetiva, hemos utilizado un segundo test, que utiliza un programa de ordenador, vinculado a un vídeo-seguimiento (test VTB) para estudiar la función neurológica en los animales. Este nuevo método cuantifica adecuadamente los parámetros relacionados con la actividad locomotora y la orientación en ratas con lesiones cerebrales. Este método ha sido utilizado en nuestro laboratorio con el fin de medir el resultado del comportamiento después de

11 una lesión cerebral causada por una hemorragia intracerebral en ratas Wistar adultas (Otero y cols, 2010). El test VTB permite analizar las imágenes de la actividad de los animales en una plataforma. Definimos las diferentes áreas dentro de la plataforma, para determinar las diferencias en el movimiento y la orientación de los animales en la zona interna y zona externa de la plataforma. Las ratas sin lesión cerebral prefieren zona externa, mientras que los animales con la lesión cerebral penetran y permanecen más tiempo en la zona interna. Se estudia el tiempo que los animales pasan en la zona interna (tiempo de permanencia, izpt) y este valor se considera un índice de actividad y orientación. Establecimiento de los diferentes niveles de daño cerebral crónico Cuando los resultados de los test fueron analizados (MNSs e izpt) se establecieron tres niveles de gravedad de lesión cerebral crónica: leve, moderado y grave. En el diagrama de resultados en el test MNSs observamos tres picos: el primero corresponde a los animales que obtienen menos de 4 puntos en la prueba MNSs (6 ratas) el segundo pico tiene un rango entre 4-10 puntos (33 animales) y el tercer pico correspondió a los animales con más de 10 puntos en la prueba MNSs (11 ratas). Los animales con menos puntuación (primer pico) fueron considerados como un grupo de lesiones leves. Los animales en el segundo pico fueron considerados en el grupo de lesiones moderadas. Por último, los animales del tercer pico fueron considerados como pertenecientes al grupo de lesión grave. El estudio del diagrama de frecuencias izpt obtenido con el VTB también mostró una tendencia a mostrar tres picos. El primer pico corresponde a los animales que permanecen menos de 4 segundos en la zona interna de la caja del VTB-test (6 ratas). El segundo pico (4 a 15 segundos) se consideró integrado por 35 ratas. El último pico corresponde a los animales con más tiempo en la zona interna, del VTB, con más de 15 segundos (9 ratas). Al igual que con el test MNSs, asociamos un grado de lesión cerebral con los picos obtenidos en el diagrama. El primer pico, correspondiente a los animales que permanecen menos tiempo en la zona interna, se consideró el grupo de lesiones leves. Los animales en el segundo pico fueron asignados al grupo de lesiones moderadas. Por último, el tercer pico. con los animales que más tiempo pasan en la zona interna, fue asignado al grupo de lesiones graves. Debido a que había animales que habían obtenido un grado de lesión cerebral diferente en ambas pruebas funcionales (MNSs y izpt), hemos establecido criterios para determinar el grado definitivo de déficit neurológico (lesión leve, moderada lesión y lesión grave). Los animales con lesiones leves en ambas pruebas en general, fueron eliminados del estidio (6 ratas). Para definir los criterios de lesión moderada se determinó que los animales deben estar en el grupo moderado de al menos una de las pruebas neurológicas (29 ratas). Los animales

12 con la clasificación de lesión severa en una de las dos pruebas fueron asignados al grupo de lesión grave (15 animales). Obtención y aislamiento de las CMM Las CMM se obtuvieron de ratas Wistar adultas de 200-250 g de peso y se expandieron in vitro durante 4 semanas. Con una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 21, médula ósea completa fue extraida asépticamente de la tibia y el fémur. Ambos extremos de los huesos se cortan y la médula se empuja con 5 ml de medio de alfa-mem (Lonza Group Ltd, Suiza). La médula ósea fue disociada mecánicamente para obtener una mezcla homogénea. La suspensión celular fue filtrada a través de una malla de 70 de nylon y se colocó en un frasco de 75 cm 2 para el cultivo con 12 ml de medio alfa-mem que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS, Lonza Group Ltd, Suiza), 2 mm L- glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 25 ng / ml de anfotericina B). Las células se incubaron a 37 º C en 5% de CO 2 durante 3 días. En este momento, las células no adherentes son removidas mediante la sustitución del medio. El medio de cultivo fue reemplazado tres veces a la semana. Después de que los cultivos primarios alcanzaron la confluencia, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se disociaron con solución de tripsina 0,25% y 1 mm EDTA durante 5 min a 37 º C. Las células se lavaron dos veces con medio de alfa-mem / 2,5% de SFB a 1000 rpm durante 5 minutos y fueron cultivadas a 37 º C en 5% de CO2. A B C Obtención de las CMM del estroma de la médula ósea de ratas macho dónde se muestra en la figura A el lavado de las diáfisis con medio alfa-mem completo/20%fbs, en la figura B se muestra la disgregación mecánica de la médula ósea obtenida y en la C el flitrado de la suspensión celular a través de una malla de nylon de 70 µm. Preparación y caracterización de los trasplantes Para obtener las CMM para los trasplantes, las células correspondientes a un P1 se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se disociaron con solución de tripsina 0,25% y 1 mm EDTA durante 5 min a 37 º C. El cultivo, que mostró una viabilidad de más del 96%, se inyecta en la cavidad cerebral traumática.

13 Los estudios de citometría se realizaron en un citómetro de flujo para la caracterización de CMM. Para el análisis de citometría de flujo, las células se despegaron con tripsina y se marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o Alexa 647 como anticuerpos primarios conjugados (Ab). Se estudiaron como marcadores CD11b, CD29, CD31, CD45 y CD90 con un control de isotipo adecuado (todos de AbD Serotec, Oxford, Reino Unido). Un control de isotipo apropiado (ABD Serotec) se incluyó en cada experimento. Más del 95% de la población CMM debe expresar CD29 y CD90. Además, estas células no deben tener expresión ( 5% positivo) de CD11b, CD45 o CD31. Los datos recogidos fueron analizados con el software CXP (versión 2.1, Beckman Coulter Inc.). Trasplante intracerebral de CMM y grupos experimentales Para el trasplante intracerebral, 2 meses después del TCE, se hizo una incisión de 1 cm sobre el lugar de la craneotomía para exponer la cavidad post-traumática y el tratamiento intralesional se realizó administrando CMM de acuerdo con lo referido en el apartado anterior. Para definir los grupos experimentales, las ratas correspondientes a lesiones consideradas moderadas y severas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos, respectivamente: aproximadamente el 50% de las ratas de cada nivel se separaron para el grupo de terapia CMM mientras que el otro 50% de cada nivel para el grupo control (administración de solución salina). Las ratas en el grupo de lesiones leves fueron eliminadas del estudio. Evaluación de la función neurológica después de los tratamientos Para realizar la evaluación de la función neurológica después de los tratamientos, todas las ratas fueron estudiadas con las mismas pruebas para el establecimiento de grados de déficit neurológico (MNSs y izpt). Se estudiaron cada semana durante los dos meses siguientes a la administración de CMM intracerebral o de solución salina, en los grupos de lesiones moderadas y graves. Estudios morfológicos Cuatro meses después de la lesión cerebral y dos meses después de la administración de CMM o de solución salina en los grupos moderados y graves, todas las ratas se sacrificaron para estudiar los aspectos macroscópicos e histológicos de los cerebros. Para el sacrificio, los animales fueron anestesiados con sevoflurano 8% en un flujo continuo de oxígeno de 3 l / min, y perfundidos transcardialmente con 20 ml de solución salina con heparina seguida de 120 ml

14 de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (ph 7,4). Los cerebros fueron fijados en formol al 4% durante 1-2 días a temperatura ambiente, y bloques de tejido conteniendo la zona de lesión fueron procesados para estudios histológicos. El volumen de la lesión se calculó sobre cortes histológicos de acuerdo con la ecuación V (mm3) = d2 (mm2) xd (mm) / 2, donde d y D son los diámetros menores y mayores de la lesión, respectivamente (Houchens, 1978; Morales y cols, 2002). Análisis estadístico de la eficacia de la terapia celular El análisis estadístico de los datos referentes al comportamiento de los animales en grupos controles y tratados fue realizado con el sistema SPSS, utilizando el análisis de ANOVA para datos paramétricos. En estos estudios, un valor de p 0,05 fue considerado significativo. Cronologia del estudio. Tiempo de evolucion de los animales, momento de evaluacion funcional y de la eficacia del tratamiento. RESULTADOS Mortalidad y evaluación neurológica precoz Para producir la lesión traumática cerebral, se utilizaron 62 ratas. Murieron 9 ratas durante la cirugía o pocas horas después del procedimiento (mortalidad de 14,52%). Después de la lesión se detectó un déficit neurológico evidente en todos los animales. Tres ratas se sacrificaron por su incapacidad para ser independientes, una semana después de la lesión (mortalidad del

15 4,84%). Con nuestro modelo experimental, el porcentaje de mortalidad final obtenido fue del 19.36 %. Caracterización de las CMM utilizadas Para el tratamiento se utilizaron células con fenotipo mostrando CD29 y CD90 ( 95% positivo) y sin expresión de CD11b, CD45 o CD31 ( 5% positivo). En nuestros estudios el perfil fenotípico de las células administradas mostró expresión de marcadores: CD29 (99,5%), CD90 (99,3 %), CD11b (1,0%), CD45 (4.2 %) y CD31 (0,3%). Establecimiento de los grupos experimentales de tratamiento El número de animales y el tratamiento específico para cada grupo fue el siguiente: El grupo de animales con lesiones moderadas (n = 29), se dividió en dos grupos: Grupo 1 (n:14) en el que cada animal recibió CMM (5x10 6 CMM en solución salina, con un volumen total de 50 L, que se inyectan directamente en el núcleo de la lesión dos meses después de lesión cerebral traumática) y Grupo 2 (n: 15), como grupo control, cuyos animales recibieron el mismo volumen que en el grupo 1, pero sólo solución salina. El grupo de lesiones graves estaba constituido por 15 animales y se dividió en; Grupo 3 (n:6) cuyos animales recibieron CMM con las mismas pautad ya descritas, y Grupo 4 (n:9) controles, que recibieron solo solución salina. Establecimiento de los grados de lesion de acuerdo a los tests utilizados A: MNSs. B: Tiempo de permanencia en zona interna del VTB test.

16 Neurological deficit mnss (points) izpt (seconds) Number of animals Experimental groups Classification criteria Mild lesion < 4 < 4 N=6 Moderate lesión 4-10 4-15 N=29 Animals that left the study Group 1 CMM n=14 Group 2 Saline n=15 Animals with mild classification in both tests. Animals with moderate classification at less in one of the neurological tests, and never obtained severe classification. Severe lesión > 10 > 15 N=15 Group 3 CMM n=6 Group 4 Saline n=9 Animals with severe classification at less in one of the neurological tests Criterios para determinar el grado de lesion neurológica de acuerdo con los tests utilizados. Caracterizacion de las CMM utilizadas, de acuerdo a la citometría de flujo. Evolución de la función neurológica Dos meses después de los tratamientos (cuatro meses después de la lesión) se obtuvieron los resultados funcionales de los cuatro grupos experimentales de ambas pruebas neurológicas. Cuando las pruebas MNSs fueron valoradas, se observó que en el grupo de lesión grave, o severa, la evolución de los animales tratados con CMM fue similar a la evolución de los controles (p 0.05) en todos los momentos del estudio. Sin embargo, en el grupo de animales con lesión moderada la administración de CMM sí obtuvo diferencia significativa (* p <0.05)

17 entre animales tratados con CMM o controles. Esta observación se detectó ya a las 6 semanas tras la administración de CMM. Recuperacion funcional en los diferentes grupos y subgrupos experimentales.

18 Estudio morfológico de la zona de lesión Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados para realizar el estudio macroscópico de la zona de lesión. Los animales del grupo de lesión moderada tenían una cavidad postraumática de menor tamaño que los animales con lesión severa (p<0.05). La cavidad postraumática correspondía a la evolución de una zona de necrosis, donde histológicamente se iodentificaban macrófagos y células astrocitarias reactivas. Comparando los subgrupos de animales tratados con CMM o que recibieron solo solución salina, se apreció en los primeros un mayor número de vasos sanguíneos, relacionable con la capacidad de inducir angiogénesis atribuida a las células madre estromales. Imagenes del cerebro en los diferentes grupos y subgrupos experimentales. No se observaron diferencias en el volumen de la lesión entre animales tratados con CMM o con solución salina.

19 Imagenes microscópicas representativas. Solo se observaron diferencias significativas sobre la angiogénesis en los animales tratados con CMM DISCUSION Es bien sabido que la lesión cerebral traumática es la principal causa de muerte y discapacidad en personas menores de 25 años de edad (Langlois y colsl, 2006; Tagliaferri y cols, 2006; Thurman y Guerrero, 1999) y cuando las secuelas se han establecido, no hay tratamiento eficaz para promover la recuperación funcional, excepto la rehabilitación (Beauchamp y colsl, 2008; Narayan y colsl, 2002; Royo y cols, 2003). Por lo tanto, el TCE es un problema de salud importante y una enorme carga socioeconómica. El desarrollo de nuevas modalidades de tratamiento para pacientes con TCE abren un futuro terapéutico prometedor con un gran beneficio clínico y económico. El primer objetivo de este estudio fue establecer una escala para clasificar los diferentes niveles de déficit neurológico en un modelo experimental de lesión cerebral traumática. Las

20 características más comunes y debilitantes en los sobrevivientes de un trauma cerebral son los déficits cognitivos y trastornos motores. Los modelos animales han sido ampliamente empleados (Morganti-Kossmann y cols, 2010; Schwarzbach y cols, 2006), pero pocos estudios han investigado los efectos de diferentes terapias en relación con la gravedad de la lesión cerebral y esta posible influencia no ha sido previamente estudiada en los protocolos de terapia celular. Tsenter y cols (2008) definen la severidad del trauma a través de pruebas realizadas con el test MNSs en ratones 1 hora después del TCE. Un trauma leve corresponde a una puntuación inferior a 5; un trauma moderado, a las puntuaciones de 5-6, un trauma severo, a las puntuaciones de 7-8, y un trauma fatal o casi fatal, puntuaciones de 9-10. Más recientemente Schwarzbold y cols (2010) utilizan esta clasificación para estudiar diferentes secuelas asociadas con lesión cerebral en ratones. La evaluación neurológica realizada 1 hora después del trauma mostró que la gravedad del TCE se relacionaba con elpeso con el cual se provocana la lesión contusiva, de acuerdo al modelo de Allen. En nuestra experiencia, sin embrgo, se pueden obtener diferentes niveles de gravedad de TCE, en cuanto a secuelas neurológicas, con el mismo modelo de impacto traumático, lo que está de acuerdo con algunos autores que señalan secuelas diferentes utilizando similares modelos de lesión traumártica (Jones y cols, 2008; Pandey y cols 2009,). En nuestro estudio analizamos la evolución de los déficits neurológicos en los primeros dos meses después del traumatismo cerebral. El TCE es un proceso complejo que incluye la lesión primaria y secundaria, y la activación del mecanismo intrínseco de la regeneración (Cernak, 2005; Reilly, 2001). Los días siguientes a la lesión traumática cerebral, todos nuestros animales tenían evidentes déficits neurológicos. Durante la semana después del trauma cerebral se detectaron diferencias en la evolución de las secuelas, las cuales fueron representadas en la diferente clasificación del grado de lesión. Es posible que estos hallazgos estén relacionados con la evolución de la lesión secundaria, y se ha establecido que los daños secundarios, pueden contribuir significativamente a la discapacidad neurológica post-traumática (DeKosky y cols, 1998). En modelos animales, el control de la evolución de la lesión secundaria es difícil de realizar. En nuestro estudio hemos determinado tres niveles de daño cerebral: lesiones leves, lesiones moderadas y graves lesiones. Nuestra clasificación es ligeramente diferente a la de otos autores porque utiliza una escala de déficit sensorial modificada (nuestro test MNSs) y un nuevo test (prueba de VTB), más objetiva, para evaluar la lesión cerebral. En la fase de lesión leve, los animales tenían pocas deficiencias neurológicas y estos animales se sacaron del estudio, ya que estos animales tienen una recuperación espontánea de la función neurológica durante el tiempo de evolución, similar a lo que ocurre en un TCE leve en humanos, y ha sido documentado en estudios de TCE en ratones (Flierl y cols, 2009).

21 El segundo y principal objetivo de nuestro estudio fue conocer si el grado de déficit neurológico influye en la eficacia de la terapia con CMM después de daño cerebral establecido. En las fases aguda y subagudas el beneficio terapéutico de la terapia celular en la lesión cerebral traumática es ya conocido y aceptado sobre modelos experimentales, aunque estas nuevas tácnicas no se utilizan aún en humanos y están limitadas a escasos Ensayos Clínicos, considerados por tanto como estudios de investigación clínica. El tratamiento con CMM después de un TCE ha demostrado una mejora en el resultado funcional en ratas (Bonilla y coll, 2009, Lu y col, 2001b; Mahmood y coll, 2001; Mahmood y col, 2002) y su uso tiene un gran potencial para aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, ningún estudio ha investigado el efecto de la terapia celular en la lesión traum stica cerebral establecida en función del grado de severidad de las secuelas neurológicas. En el presente estudio, hemos llevado a cabo la administración tardía de CMM en una etapa de secuelas establecidas, sobre animales con daño cerebral moderado y grave. Nuestro modelo experimental de lesión cerebral causa la pérdida de tejido cerebral y anomalías de comportamiento que son evidentes en todos los animales inmediatamente después de un trauma, pero difieren en la gravedad entre los grupos experimentales. Una vez que el tratamiento se realizó, hemos obtenido resultados diferentes después de la administración intracerebral de CMM según que analizáramos el grupo de animales con secuelas moderadas o con secuelas severas. En el grupo de lesión severa, la administración de CMM o de solución salina mostró una evolución neurológica similar, sin modificar el déficit funcional establecido. En el grupo de lesión moderada, el trasplante intracerebral de CMM mostró una recuperación evidente y progresiva de funciones neurológicas, a partir de unas pocas semanas después del procedimiento. Este hallazgo sugiere por primera vez en la literatura, una relación entre el grado de daño cerebral y la eficacia de la terapia celular con CMM sobre las secuelas neurológicas crónicamente establecidas. En nuestro estudio, las CMM logran recuperación neurológica en el caso de lesiones neurológicas moderadas, pero no en el caso de lesiones severas, y probablemente estos datos están condicionados por la evolución de la lesión secundaria. La lesión secundaria se produce después de un trauma cerebral y evoluciona durante las horas, días y semanas después del trauma. Se inicia con el daño oxidativo que induce procesos inflamatorios y la activación del mecanismo de muerte celular apoptótica (Chong y col, 2005; Darwish y col, 2007; Werner y Engelhard, 2007). Muchas cascadas fisiopatológicos pueden contribuir a la lesión secundaria después (Xiong y col, 2009a). Los resultados de este estudio contribuyen a conocer los beneficios potenciales de las CMM en el tratamiento de la lesión cerebral traumática crónica. Por otra parte, la evaluación del comportamiento es un punto clave en la evaluación del daño cerebral (Fujimoto y col, 2004). Las diferencias de resultados entre lesiones moderadas y

22 severas, es posible que se relacionen con la severidad de la lesión secundaria en el grupo de daño traumático severo, lo que puede limitar la eficacia de la terapia celular. En el estudio histológico no hubo diferencias entre los grupos de lesión grave y moderada aunque en el caso de animales tratados con CMM se observó un mayor grado de angiogénesis que en los subgrupos de animales controles correspondientes. En estudios previos de nuestro grupo, la co-localización de CMM trasplantados y Neu-N o GFAP apoyó la supervivencia a largo plazo y la transdiferenciación de las CMM trasplantadas en el cerebro lesionado, junto con un aumento de la neurogénesis endógena (Bonilla et al, 2009), pero el escaso número de células trasplantadas que se encuentra en estos estudios no puede ser responsable de la mejora de los resultados funcionales observados después del trasplante. Parece ser que las CMM secretan varios factores de crecimiento (Chen et al, 2002; Chopp et al, 2002; Mahmood et al, 2004; Yoshimura et al, 2003) que se relacionan con la mejoría de las secuelas neurológicas. Las CMM también inducen a las células intrínsecas del cerebro para producir estos factores de crecimiento (Mahmood et al, 2004) que a su vez promueven la sinaptogénesis, la angiogénesis y la neurogénesis (Chen et al, 2006; Bonilla et al, 2009). Por lo tanto, es evidente que diversos mecanismos de recuperación pueden desempeñar un papel después del trasplante, incluyendo la expresión de factores neurotróficos, o la activación de mecanismos endógenos capaces de restaurar las funciones neurológicas que habían sido suprimidas (Vaquero y Zurita, 2009). Aunque estos resultados iniciales parecen prometedores, se necesitan más estudios. Uno de los problemas a considerar en este estudio es la reducción del volumen de las cavidades postraumáticas. La administración de CMM por sí mismas no parece reducir significativamente el volumen de la lesión después de un TCE. En una revisión reciente sobre las perspectivas actuales del tratamiento de lesiones en el SNC hemos señalado (Vaquero y Zurita, 2009, 2010) que el tamaño de las lesiones cerebrales y su variabilidad parecen ser determinantes en la eficacia de las terapias celulares, y es necesario por tanto encontrar matrices biológicas que permitan la supervivencia celular y la diferenciación de las células madre trasplantadas. Del mismo modo, el número crítico de CMM que sean necesarias para restablecer el déficit funcional después de un traumatismo cerebral experimental representa una de las principales cuestiones por resolver (Vaquero y Zurita, 2010). Independientemente del número de células administradas varios factores están presentes en el tejido del huésped, la mayoría de los cuales relacionados con la fisiopatología de la lesión traumática, que disminuyen la supervivencia de las células trasplantadas. Si podemos mejorar la supervivencia y la integración de las células en el tejido lesionado se podría disminuir la cavidad postraumática y mejorar los resultados funcionales. El reciente hallazgo en nuestro laboratorio de que las matrices de soporte celular derivados del plasma son muy útiles en el logro de este objetivo (Zurita et al, 2010) ofrece nuevas perspectivas en este apasionante campo de investigación.

23 Recientemente se han iniciado protocolos de terapia celular para el TCE en humanos (Zhang et al, 2008, Cox et al, 2011). No se observó toxicidad inmediata o diferida relacionada con la administración de CMM y parece haber indicios de eficacia terapéutica. Aunque la aplicación de estas técnicas a pacientes está empezando, es obvio que todavía no se tienen los conocimientos necesarios acerca de la fisiopatología de la lesión cerebral traumática y cómo estas células madre adultas funcionan y cómo podemos optimizar los resultados experimentales, aparentemente buenos. Nuestro estudio aporta una visión preclínica importante, por cuanto nos lleva a tener en cuenta que la intensidad del trauma cerebral y consecuentemente sus secuelas puede tener una cxlara influencia en la eficacia terapéutica de estas nuevas técnicas que indudablemente serán aplicadas en un futuro inmediato a pacientes con secuelas neurológicas causadas por un traumatismo craneoencefálico causado por un accidente de tráfico. CONCLUSIONES Nuestros resultados confirman la posibilidad de recuperar parcialmente las secuelas neurológicas tras un TCE por medio de las modernas técnicas de terapia celular con células madre adultas, obtenidas del estroma de la médula ósea. Sin embargo, este efecto terapéutico parece estar limitado por el grado de lesión neurológica, ya que en el caso de lesiones graves, con importantes secuelas postraumáticas, la terapia celular no parece ser eficaz. Estas observaciones deben ser tenidas en cuenta, ya que se están iniciando Ensayos Clínicos que tratan de confirmar en humanos la eficacia que la terapia celular parece mostrar en estudios experimentales preclínicos y que serán aplicados en un futuro próximo como tratamiento de las secuelas neurológicas derivadas de los accidentes de tráfico. BIBLIOGRAFIA Allen AR. Surgery of experimental lesión of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. JAMA 1911; 57:878-80. Andres RH, Guzman R, Ducray AD, Mordasini P, Gera A, Barth A, Widmer HR, Steinberg GK. Cell replacement therapy for intracerebral hemorrhage. Neurosurgical Focus 2008; 24(3&4), E15. Bajetto A, Bonavia R, Barbero S, Florio T, Schettini G. Chemokines and their receptors in the Central Nervous System. Frontiers in Neuroendocrinology 2001;22:147-184. Beauchamp K, Mutlak H, Smith WR, Shohami E, Stahel PF. Pharmacology of traumatic brain injury: where is the golden bullet? Mol Med 2008; 14:731 40. Bhang SH, Lee YE, Cho SW, Shim JW, Lee SH, Choi CY, Chang JW, Kim BS. Basic fibroblast growth factor promotes bone marrow stromal cell transplantation-mediated neural regeneration in traumatic brain injury. Biochemical Biophysiology Research Commun 2007; 359:40-45.

24 Bonilla C, Zurita M, Otero L, Aguayo C, Vaquero J. Delayed intralesional transplantation of bone marrow stromal cells increases endogenous neurogenesis and promotes functional recovery after severe traumatic brain injury. Brain Inj. 2009; 23: 760-769. Brazelton TR, Rossi Fabio MV, Keshet GI, Blau HM. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science. 2000;290:1775-1779. Bruns J, Hauser WA. The Epidemiology of Traumatic Brain Injury: A Review. Epilepsia 2003;44(10):2-10. Cernak I. Animal Models of Head Injury. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro- Therapeutics 2005; 2: 410-22. Chen J, Chopp M. Neurorestorative treatment of stroke: cell and pharmacological approaches. NeuroRx 2006; 3:466 73. Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Journal of Neurological Sciences 2001a;189:49-57. Chen J, Li Y, Wang L, Zhang X, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke 2001b;32:1005-1011. Chen J, Sanberg PR, Li Y, Wang L, Lu M, Willing AE, Sanchez-Ramos J, Chopp M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32(11):2682-8. Chen X, Iwata A, Nonaka M, Browne KD, Smith DH. Neurogenesis and glial proliferation persist for at least one year in the subventricular zone following brain trauma in rats. Journal of Neurotrauma 2003;20:623-631. Chen X, Katakosky M, Li Y. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. Journal of Neuroscience Research 2002;69:687-691. Chong ZZ, Li F, Maiese K. Oxidative stress in the brain: novel cellular targets that govern survival during neurodegenerative disease. Prog Neurobiol 2005; 75: 207 46. Chopp M, Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol 2002; 1: 92 100. Chopp M, Zhang X, Li Y, Wang L, Chen J, Lu D, Lu M, Rosemblum M. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cells transplantation. Neuroreport 2000; 11:3001-3005. Cox CS Jr, Baumgartner JE, Harting MT, Worth LL, Walker PA, Shah SK, Ewing-Cobbs L, Hasan KM, Day MC, Lee D, Jimenez F, Gee A. Autologous bone marrow mononuclear cell therapy for severe traumatic brain injury in children. Neurosurgery 2011; 68: 588-600. Darwish RS, Amiridze N, Aarabi B. Nitrotyrosine as an oxidative stress marker: evidence for involvement in neurologic outcome in human traumatic brain injury. J Trauma 2007; 63: 439 42. DeKosky ST, Kochanek PM, Clark RS, Ciallella JR, Dixon CE. Secondary injury after head trauma: subacute and long-term mechanisms. Semin Clin Neuropsychiatry 1998; 3:176 85. Flierl MA, Stahel PF, Beauchamp KM, Morgan SJ, Smith WR, Shohami E. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc 2009; 4: 1328 37. Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology 1976;4:267-274. Fujimoto ST, Longhi L, Saatman KE, Conte V, Stocchetti N, McIntosh TK. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neurosci Biobehav Rev. 2004; 28: 365-78. Gao J, Prough DS, McAdoo DJ, Grady JJ, Parsley MO, Ma L, Tarenko YI, Wu P. Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function in rats after traumatic brain injury. Experimental Neurology 2006; 201:281-292. Hawthorne, G., Gruen, R.L., and Kaye, A.H. Traumatic brain injury and long-term quality of life: findings from an Australian study. J. Neurotrauma 2009; 26:1623 33.