INHIBICIÓN DE CRECIMIENTO CAUSADO CON EL EXTRACTO ACUOSO DE Azadirachta indica SOLO Y EN MEZCLA CON EL NEMATODO Romanomermis iyengari EN Culex quinquefasciatus Inhibition of growth caused with the watery extract of Azadirachta indica only and in mixture with the nematode Romanomermis iyengari in Culex quinquefasciatus Sabino Honorio Martínez-Tomás 1, Rafael Pérez-Pacheco 1, Cesáreo Rodríguez-Hernández 2, y Gustavo Ramírez-Valverde 2. 1 CIIDIR Unidad Oaxaca, Instituto Politécnico Nacional. Hornos 1003, Santa Cruz Xoxocotlán, 71230, Oaxaca, México. Fax:(951)5170400. 2 Colegio de Postgraduados. Carretera México-Texcoco, Km 36.5, 56230. Montecillo, Edo. de México.Tel.(595)9520265. E-Mail: sabinodos@yahoo.com.mx, rafaelperezpacheco@yahoo.com. Palabras Clave: Nim, Nematodo y Mosquito. Introducción El control de mosquitos se ha realizado con insecticidas organosintéticos, como DDT y Malation, que han causado contaminación, resistencia en mosquitos e intoxicaciones, por lo que es necesaria la implementación de alternativas para combatir bioracionalmente a estos transmisores de organismos que causan enfermedades como paludismo, dengue y Virus del Nilo. Diferentes alternativas no químicas pueden ser utilizadas entre las alternativas naturales, las substancias vegetales son una opción para reducir el uso de insecticidas químicos, así como lo indica el efecto que se ha reportado en más de 344 especies de plantas contra mosquitos (Sukumar et al., 1991), sobresaliendo el nim Azadirachta indica (Meliaceae) por sus diversos efectos y para el control biológico de mosquitos, se han utilizado virus, bacterias, hongos, peces larvívoros y nematodos parásitos del género Romanomermis spp., especialmente el nematodo Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermithidae), parásito especifico de larvas de mosquitos, que presenta alto potencial para reducir poblaciones de larvas de mosquitos en criaderos naturales (Pérez et al., 2003, 2004, 2005). Sin embargo, no se cuenta con reportes de compatibilidad del uso de productos vegetales con los nematodos parásitos de mosquitos. Por lo que en el presente estudio el objetivo fue determinar el efecto del extracto acuoso de la semilla de nim (EASN) A. indica y del nematodo R. iyengari, en forma independiente y mezclados, sobre el crecimiento de larvas de 2º instar del mosquito C. quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Materiales y Método Material biológico. Los nematodos R. iyengari y larvas de mosquito C. quinquefasciatus se obtuvieron de la planta de producción masiva de nematodos ubicada en las instalaciones del CIIDIR-IPN Unidad Oaxaca. Las larvas de C. quinquefasciatus se criaron a una temperatura de 27 ºC ±2 ºC bajo la metodología descrita por Pérez et al. (2004). Los nematodos emergidos de larvas previamente infestadas fueron depositados en recipientes de plástico (21x 14x6 cm) conteniendo arena de río y fueron almacenados por seis semanas a 25 ºC ±2 ºC (Pérez et al., 2003). Cuando se necesitaron nematodos infectivos (J 2 ) los cultivos fueron inundados con agua destilada para inducir la eclosión de huevos y la emergencia de los nematodos infectivos. Para determinar el volumen necesario 442
a aplicar en los diferentes tratamientos, el agua de los cultivos fue colectada después de 4 h y la concentración de nematodos en suspensión fue calculada por medio del método de dilución volumétrica (Petersen y Willis, 1992). Material vegetal. El nim A. indica se colectó en Santa Rosa de Lima Tututepec, Oaxaca, México, en agosto de 2005. Se despulpó 5 kg de fruto y la semilla se secó, posteriormente se depositaron 20 g en 200 ml de agua destilada que fueron licuados por un minuto, y posteriormente la mezcla se depositó en un frasco de vidrio dejando en reposo 24 h, para mejor extracción de las substancias hidrosolubles Se filtró con tela de manta; la parte sólida se desechó y la líquida (macerado acuoso a 10%) que representa la solución madre, se utilizó para preparar las diferentes concentraciones usadas en los experimentos. Fase experimental 1. Efecto del extracto de nim A. indica en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. La unidad experimental consistió de un vaso de plástico con 100 ml de agua destilada donde se colocaron 20 larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus y se les aplicó 1 ml de la concentración correspondiente de extracto de nim. En esta fase se realizaron dos experimentos, en el primero se evaluaron 8 concentraciones consecutivas: 10, 1.0, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 y 0.000001 para el primer experimento, con la finalidad de determinar el rango de acción del EASN sobre larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. Entre las concentraciones de 10 y 1% se registró el mayor efecto de inhibición de crecimiento (IC= 0.04 y 0.77) del EASN, por lo que se realizó un segundo experimento y se evaluaron las concentraciones de 7, 5, 3, 2, 1.5, 1 y 0.3 para después calcular la concentración efectiva (CE 50 ) que inhibe en 50% el crecimiento de la población de 2º instar de C. quinquefasciatus. Fase experimental 2. Efecto del nematodo R. iyengari en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. Se realizaron dos experimentos, en el primero se aplicaron nematodos (J 2 ) a dosis de 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, y 1:1 nematodos por larva de mosquito para determinar el mayor efecto del nematodo en el crecimiento de larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. Con los resultados obtenidos, el mayor efecto fue entre las dosis de 5.0 y 1:1 nematodos por larva por lo que en el segundo experimento se evaluaron las dosis de 5.0, 3.4, 3.1, 2.8, 2.5, 2.2, 1.9, 1.6, 1.3, 1.0, y 0.5:1 nematodos/larva para encontrar una mejor correlación entre crecimiento y dosis del nematodo, y así calcular la Dosis Efectiva (DE 50 ) que inhibe 50% el crecimiento de la población larval de C. quinquefasciatus. Fase experimental 3. Nim y nematodo en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. Con la información obtenida en las dos fases experimentales anteriores, se calcularon las Concentraciones o Dosis Efectivas (CE o DE) que inhibieron en 20, 40, 50, 60 y 80% el crecimiento para el caso del nim y para el nematodo las que inhibieron 53, 70, 72, 74 y 83% el crecimiento de la población de 2º instar de C. quinquefasciatus; estas fueron de 5.1, 4.3, 4.0, 3.8 y 3.2% del EASN y para el nematodo de 5.0, 2.5, 2.2, 1.9 y 0.9:1 nematodos/larva respectivamente. En esta fase se evaluaron las diferentes combinaciones de las Concentraciones y Dosis Efectivas tanto del nim como del nematodo, con sus respectivos testigos (CE o DE 50 ), para determinar sí existe efecto sinergista o antagonista de los tratamientos sobre larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. En el momento que en el testigo se observó a 93% de pupas, se registró el número de larvas (en diferentes instares) y pupas vivas como muertas. Se consideraron larvas o pupas muertas a las que no presentaron movimientos normales al ser perturbadas con una aguja de disección. Con esta información se cuantificó la inhibición de crecimiento (IC) con la formulas de Zhang et al. (1993): 443
5 5 (No.insectos vivos X Fase insecto) No.insectos muertos X (Fase insecto -1) IC i 1 i 1 (No. totalde insectos evaluados X Totalde fases del insecto) IC deltratamiento IRC IC deltestigo Con la correlación de la concentración y el IRC, se determinó la Concentración Efectiva media (CE 50 ), que indica la concentración que inhibe 50% el crecimiento de la población. Resultados y discusión Fase experimental 1. Efecto del extracto de nim A. indica en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. En el primer experimento, las concentraciones de 10 y 1% provocaron mayor efecto del EASN en el crecimiento de la población larval registrando valores de IC de 0.04 y 0.77. En el segundo experimento, las concentraciones de 10 y 7% evitaron la formación de pupas, provocando mortalidad más del 50% de larvas de 2º instar y por consecuencia sin crecimiento, obteniendo valores de IC de 0.01 y 0.04, mientras con la concentración de 5% se registró de igual manera mortalidad larval más del 50% en 2º instar con un IC de 0.21 indicando moderado crecimiento, mostrando diferencia significativa. En cambio con las concentraciones 3% se formó 90-94% de pupas con valores de IC de 0.95-0.99 indicando máximo crecimiento al igual que el testigo. El EASN, aplicado a larvas de 2º instar inhibe en 50% el crecimiento de la población con la concentración de 400 ppm y evita la formación de pupas a concentraciones de 10 y 7% cuando se formó el 97% de pupas en el testigo (Cuadro 1). Cuadro 1. Larvas y pupas (vivas y muertas) e índice de crecimiento del mosquito C. quinquefasciatus con la aplicación del nim A. indica en larvas de 2º instar. Conc. (%) II III IV Pupa Rango (IC) IRC 10 0 /95 0/5 0/0 0/0 (0.01) c 0.01 7 0/84 0/16 0/0 0/0 (0.04) c 0.04 5 0/63 0/2 8/25 2/0 (0.21) b 0.21 3 0/2 0/0 4/3 90/1 (0.95) a 0.95 2 0/0 0/1 2/3 93/1 (0.97) a 0.97 1 0/0 0/0 1/5 94/0 (0.97) a 0.97 0.3 0/1 0/0 5/1 92/1 (0.97) a 0.97 Testigo 0/0 0/0 2/1 97/0 (0.99) a CE 50 4.0 Registro de larvas y pupas vivas /muertas cuando se formó el 97% de pupas en el testigo. Medias obtenidas del análisis no paramétrico con Kruskal-Wallis (p 0.05). Las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p 0.05). Al terminar el ciclo biológico hasta la emergencia a adultos, se observó que las concentraciones 7% evitaron la formación de pupas. Las duraciones y viabilidades tanto larvales como pupales fueron normales a concentraciones a 5%; no obstante, en algunas la duración larval y/o pupal se acortó y en otras fueron normales, a excepción a 5% en la viabilidad larval donde se formó solamente el 2% de pupas y fue diferente al testigo. 444
Fase experimental 2. Efecto del nematodo R. iyengari en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. En el primer experimento, la aplicación del nematodo a dosis de 5 y 1:1 nematodos por larva se registraron valores de IC de 0.49 y 0.69, lo que indica que entre estas concentraciones se encuentra la Dosis Efectiva media (DE 50 ) que inhibe 50% el crecimiento de larvas de 2º instar. En el segundo experimento, el nematodo R. iyengari, aplicado a larvas de 2º instar inhibió en 50% el crecimiento de la población con la dosis de 5.4:1 nematodos por larva y evitó la formación de pupas a dosis 5:1 cuando se formó el 96% de pupas en el testigo (Cuadro 2). Cuadro 2. Larvas y pupas (vivas y muertas) e índice de crecimiento del mosquito C. quinquefasciatus con la aplicación del nematodo R. iyengari en larvas de 2o instar. Nematodos/larva: II III IV Pupa Rango (IC ) IRC 5:1 0 /2 0/1 0/97 0/0 8.20 (0.49) b 0.50 3.4:1 0/5 0/0 0/92 3/0 9.30 (0.49) b 0.50 3.1:1 0/2 0/0 4/82 12/0 20.30 (0.55) ab 0.56 2.8:1 0/3 0/0 0/79 18/0 26.20 (0.58) ab 0.59 2.5:1 0/4 0/0 1/76 18/1 26.50 (0.58) ab 0.59 2.2:1 0/3 0/0 0/85 12/0 19.90 (0.55) ab 0.56 1.9:1 0/4 0/0 0/72 24/0 30.70 (0.60) ab 0.62 1.6:1 0/2 0/0 0/75 23/0 31.60 (0.61) ab 0.62 1.3:1 0/1 0/0 0/57 42/0 44.20 (0.71) ab 0.72 1:1 0/0 0/0 10/60 30/0 38.10 (0.65) ab 0.67 0.5:1 0/2 0/1 2/2 93/0 54.50 (0.96) a 0.98 Testigo 0/1 0/0 1/2 95/1 56.50 (0.98) a CE 50 5.4 Registro de larvas y pupas vivas /muertas cuando se formó el 93% de pupas en el testigo; Las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p 0.05). En la mayor correlación entre el nematodo y su efectividad (Experimento 2) la dosis de 5 y 3.4:1 nematodos provocaron mortalidades más del 90% de la población de larvas de 4º instar, registrándose un IC=0.49 afectando moderadamente su desarrollo, por otra parte a dosis de 1 hasta 3.1:1 nematodos por larva se observó 57-85% de mortalidad larval en 4º instar con valores de IC de 0.55-0.71 indicando leve efecto de inhibición de crecimiento. En cambio a dosis de 0.5:1 nematodos por larva el crecimiento de la población fue normal. Cuando larvas de 2º instar emergieron hasta adultos se observó que el nematodo aplicado a larvas a dosis 3.4:1 provocaron 97-100% de mortalidad larval, en tanto que a dosis a 3.1:1 hasta 1.0:1 nematodos por larva sobrevivieron 12 a 42% de pupas y de estas más del 95.5% se formaron como adultos, mientras que a 0.5:1 la viabilidad larval y pupal fueron normales. Con respecto a las viabilidades larvales y pupales, las concentraciones a 3.4:1 nematodos por larva fueron similares al testigo. Fase experimental 3. Nim y nematodo en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. En todos los tratamientos de la combinación nim-nematodo se observó más del 50% de mortalidad larval de 4º instar, ocasionado principalmente por el parasitismo del nematodo. Las combinaciones de concentraciones altas 4.3% de extracto 445
de A. indica con la más alta dosis del nematodo (5:1) se evitó la formación de pupas, con valores de IC de 0.42-0.45 indicando moderada inhibición de crecimiento. Además con la dosis alta de EASN de 5.1% con dosis 2.2:1 nematodos por larva, se observó las más altas mortalidades de 25-32% de larvas de 3er instar. De igual manera la aplicación de la concentración más alta 5.1% de EASN con la dosis de 2.5:1 nematodos/larva, evitaron la formación de pupas y todos los tratamientos nim-nematodo provocaron 90-100% de mortalidad de larvas y pupas, resultando IC de 0.42 a 0.52 indicando moderada inhibición de crecimiento. La aplicación de la mínima dosis (0.5:1) nematodos/larva y la mínima concentración del EASN (3.2%) inhibió en 50% el crecimiento de la población (Cuadro 3). Cuadro 3. Larvas y pupas (vivas y muertas) e índice de crecimiento del mosquito, con la aplicación del nim A. indica y del nematodo R. iyengari en larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. Nim y Nema II III IV Pupa IC IRC Nim y II III IV Pupa IC IRC 5.1 y 5:1 0 /1 0/32 0/67 0/0 0.42 e 0.43 3.8 y 5:1 0/0 0/8 0/91 1/0 0.49 cde 0.50 5.1 y 2.5:1 0/0 0/25 3/72 0/0 0.45 e 0.45 3.8 y 2.5:1 0/1 0/14 0/83 1/1 0.47 cde 0.48 5.1 y 2.2:1 0/1 0/25 0/73 0/1 0.44 e 0.45 3.8 y 2.2:1 0/3 0/10 2/81 3/1 0.48 cde 0.49 5.1 y 1.9:1 0/1 0/24 2/71 2/0 0.45 de 0.46 3.8 y 1.9:1 0/0 0/17 0/81 1/1 0.47 cde 0.48 5.1 y 0.5:1 0/2 0/15 0/79 3/1 0.47 cde 0.48 3.8 y 0.5:1 0/0 0/9 2/81 7/1 0.52 cd 0.53 4.3 y 5:1 0/1 0/18 0/81 0/0 0.45 de 0.46 3.2 y 5:1 0/2 0/16 0/82 0/0 0.45 de 0.46 4.3 y 2.5:1 0/1 0/17 1/79 1/1 0.46 de 0.47 3.2 y 2.5:1 0/0 0/19 1/76 4/0 0.48 cde 0.49 4.3 y 2.2:1 0/0 0/23 1/73 3/0 0.46 de 0.47 3.2 y 2.2:1 0/1 0/18 0/77 4/0 0.47 cde 0.48 4.3 y 1.9:1 0/1 0/19 1/76 3/0 0.47 cde 0.48 3.2 y 1.9:1 0/0 0/20 0/75 3/2 0.47 cde 0.48 4.3 y 0.5:1 0/0 0/16 2/77 3/2 0.49 cde 0.49 3.2 y 0.5:1 0/0 0/25 0/62 10/3 0.50 cde 0.51 4.0 y 5:1 0/2 0/11 0/83 4/0 0.48 cde 0.50 T1 (4.0) 0/1 0/16 1/59 12/11 0.55 c 0.56 4.0 y 2.5:1 0/1 0/19 0/78 2/0 0.46 de 0.47 T2 (mosquito) 0/0 0/0 4/3 92/1 0.97 a 4.0 y 2.2:1 0/0 0/11 0/88 0/1 0.48 cde 0.49 T3 (2.2:1) 0/0 0/0 1/51 45/3 0.74 b 0.75 4.0 y 1.9:1 0/1 0/14 1/79 4/1 0.49 cde 0.50 4.0 y 0.5:1 0/2 0/13 2/81 1/1 0.47 cde 0.48 Registro de larvas y pupas vivas /muertas al momento de formarse el 93% de pupas en el testigo; Las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (p 0.05). Al terminar el ciclo biológico hasta emergencia de adultos, se observó que la combinación de la dosis 5:1 nematodos por larva con las concentraciones 5.1, 4.3 y 3.2% del extracto de nim y las dosis 2.5:1 del nematodo con 5.1% del EASN, inhibieron la formación de pupas y por consecuencia no se formaron adultos, cuando se aplicaron a larvas de 2º instar de C. quinquefasciatus. En los demás tratamientos se formaron 1-13% de pupas y de estas 40-100% alcanzaron la etapa adulta. Las viabilidades y duraciones tanto larvales como pupales fueron normales en todos los tratamientos. Los valores calculados de IC 50 del nim y nematodo estos fueron de 4.0% y 5.4:1 (Cuadro 1 y 2) comparados con el valor de IC obtenido de la mezcla de la concentración de extracto de nim de 4.0% y 5:1 nematodos/larva, este tuvo un valor de 0.48 (Cuadro 3), indicando que no hubo efecto sinergista, por lo que a estas concentraciones da igual aplicar el EASN o el nematodo. Nema 446
El EASN no es insecticida, es insectistático en C. quinquefasciatus; inhibe el crecimiento en diversos niveles hasta evitar la formación de pupas, inhibe el desarrollo con distinto efecto hasta la no emergencia de adultos y disminuye la viabilidad larval y pupal. Se constató que las larvas que evitaron el parasitismo del nematodo, su duración larval y pupal fueron similares al testigo. El periodo de supervivencia de larvas parasitadas de C. quinquefasciatus disminuyó al aumentar las dosis del nematodo. Con la aplicación de diferentes dosis de nematodos no permitió que las larvas parasitadas se convirtieran a pupa y las que se formaron no fueron afectadas en su desarrollo. Al no formase pupas, ni emerger adultos, no habrá hembras de C. quinquefasciatus que transmitan virus que provoquen encefalitis y fiebre del Nilo Occidental, ni tampoco habrá transmisión de nematodos que ocasionen filariasis. Agradecimientos Al Tec. Gonzalo Flores Ambrocio por su apoyo en la realización de los experimentos. Literatura citada Pérez, P. R., Rodríguez, H. C., Lara, R. J., Montes, B. R., Ramírez, V. G. 2003. Susceptibilidad de larvas de mosquitos Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) al parasitismo del nemátodo Romanomermis iyengari Welch. Folia Entomol. Mex. 42: 321 327. Pérez P., R., C. Rodríguez H., J. Lara R., Montes B., G. Ramírez V., y L. Martínez M. 2004. Parasitism of Romanomermis iyengari in larvae of three species of mosquito in the laboratory and in Anopheles pseudopunctipennis in the field. Agrociencia 38(4): 413-421. Pérez P., R., C. Rodríguez H., J. Lara R., Montes B., y J. Ruíz V. 2005. Control of the mosquito Anopheles pseudopunctipennis (Diptera: Culicidae) with Romanomermis iyengari (Nematoda: Mermithidae)in Oaxaca, Mexico. Biol.Control. 32(2005):137-142. Petersen, J.J., and O. R. Willis. 1972. Procedures for the mass rearing of a mermithid parasite of mosquitoes. Mosquito News 2: 226 230. Sukumar, K., M. J. Perich and L. R. Boombar. 1991. Botanical derivates in mosquito control: a review. J. Am. Mosq. Control Assoc. 7 (2): 210-237. Zhang, M., S.K. Chaudhuri, and I. Kubo. 1993. Quantification of insect growth and its use in screening of naturally occurring insect control agents. J. Chem. Ecol. 19(6):1109-1118. 447