romatografía de exclusión molecular (filtración en gel) K av K av = V e - V o V t -V o log MW
Purificación de la HD de rata recombinante Etapa Actividad (µg 2 /h) Prot. total (mg) Actividad específica (pmol 2 /h µg pr) Purificación (veces) Rendimiento (%) Extracto crudo 4,6 1488 3,11 1 100 Precip. + Phenyl-seph. 1,7 243,2 7,16 2,3 36,7 DEAE-sephadex 0,87 3,45 254 81 18,9 Hidrixiapa. + filtr. 0,31 0,55 577,8 185 6,7 1 2 3 HD Figura 2P. Etapas de purificación de HD recombinante. 1: Phenyl-Sepharose; 2: Macro-prep DEAE; 3: Hidroxiapatito.
Secuenciación de la ribonucleasa A Digestión con tripsina (14 fragmentos) 1. K 2. SR 3. DR 4. FER 5. NLTK 6. NVAK 7. ATGSSK 8. TTQANK 9. ETAAAK 10. YPNAYK 11. NGQTNYQSYSTMSITDR 12. HIIVAEGNPYVPVHFDASV 13. QHMDSSTSAASSSNYNEMMK 14. KPVNTFVHESLADVQAVSQK Digestión con NBr (5 fragmentos) 1. M 2. KETAAAKFERQHM 3. DSSTSASSSNYNEM 4. SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIV AEGNPYVPVHFADASV 5. KSRNLTKDRKPVNTFVLIESLADVQAV SQKNVAKNGQTNYQSYSTM 6, 11, 13 y 10, 12, 14 Tripina NBr Tripina NBr Tripina NBr Tripina NBr...10...20...30...40...QHMDSSTSAASSSNYNEMMK... KETAAAKFERQHM...KSRNLTKDR KETAAAKFERQHMDSSTSAASSSNYNEMMKSRNLTKDR...50...60...70...80...NGQTNYQSYSTM KPVNTFVLIESLADVQAVSQKNVAKNGQTNYQSYSTM KPVNTFVLIESLADVQAVSQKNVAKNGQTNYQSYSTM...90...100...110...120 SITDR...HIIVAEGNPYVPVH SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIVAEGNPYVPVH SITDRETGSSKYPNAYKTTQANKHIIVAEGNPYVPVH..125 FDASV FDASV FDASV
Dependencia de la solubilidad del ph
Influencia de los pequeños iones sobre las interacciones entre los macroiones
Especificidades de varias endopeptidasas punto de corte H H R n-1 R n Enzima fuente especificidad omentario Tripsina Pancreas bovino R n-1 = R o K; R n P Altamente específico quimiotripsina Pancreas bovino R n-1 = F, W o Y; R n P rompe más lentamente para R n-1 = N, H, M o L Elastasa Pancreas bovino R n-1 = A, G, S o V; R n P Termolisina B. thermoproteolyticus R n = I, M, F, W, Y, V; R n-1 P ocasionalmente rompe cuando Rn = A, D, H, T; es termoestable Pepsina mucosa gastrica bovina R n = L, F, W o Y; R n-1 P es bastante inespecífica, ph óptimo = 2 Endopeptidasa V8 S. aureus R n-1 = E
Degradación de Edman N S +.. H 2 N H H H R 1 R 2 R 3 Fenilisotiocianato (PIT) -H - Polipéptido N.. H H H Feniltiocarbanil-polipéptido (PT-polipéptido) S R 1 R 2 R 3 R 1 F 3 H anhidro N S + + H 3 N H H N H Derivado Tiazolina H + R 2 R 3 Polipéptido sin el extremo N-terminal R 1 N S N H Feniltiohidantona-aminoácido (PTH-aminoácido)
adenas pesadas adenas ligeras Dominio de unión al antígeno Bisagra Dominio Fab Dominio Fc arbohidrato Antígeno Zona de corte con papaina Dominio de unión al antígeno Bisagra -S-S- -S-S- -S-S- -S-S- Dominio Fab Dominio Fc Zona de corte con pepsina
Inmunodifusión en gel (uchternoly) A A B α-a B α-a Los antígenos A y B son inmunológicamente identicos Los antígenos A y B están estrechamente relacionados A A B α-a B α-a Ambos antígenos son reactivos pero con una relación lejana A es reactivo, pero B no lo es Inmunoelectroforesis A + - B En primer lugar las muestras A y B se somoten a una electroforesis antisuero El antisuero se coloca en el gel entre las dos muestras y se deja difundir. Se formaran arcos de precipitación con las bandas de cada mezcla que reaccionen con el antisuero
Transferencia Western Separación de proteínas en SDS-PAGE Transferencia a membrana Incubación con anticuerpos y revelado de la proteína marcadora P12 N17 NGF - + - + P12 N17 blot: α-py ERK1 ERK2 blot: α-p75 p75 NTR
Inmunoprecipitación Incubación con el anticuerpo Incubación con Proteína A Precipitación del complejo antígeno-anticuerpo-proteína A Análisis de los complejos en SDS- PAGE P12 N17 NGF - + - + IP: 203 blot: α-py p140 Trk p110 Trk P12 N17 blot: RTA p140 Trk p110 Trk
btención de anticuerpos monoclonales
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Ensayos de captura de anticuerpos Unión del antígeno a la fase sólida Unión del anticuerpo marcado al antígeno uantificación del anticuerpo Ensayos con dos anticuerpos Unión del anticuerpo a la fase sólida Unión del antígeno al anticuerpo Unión del anticuerpo secundario marcado uantificación del anticuerpo secundario Ensayos de captura de antígeno Unión del anticuerpo a la fase sólida Unión del antígeno marcado al anticuerpo uantificación del antígeno
Radioinmunoanálisis ontrol Muestra desconacida antidad fija de antigeno A radiactivo Se añade una cantidad desconocida de antigeno A sin marcar Se añade una cantidad fija de anticuerpos anti-a Se añade un agente precipitante (anticuerpo anti-inmunoglobulina) cpm control Se determina la radiactividad en los precipitados cpm desconocido cpm desconocido cpm control X 100% = % Ag* unido