Evaluación de tres estrategias de diagnóstico para el Huanglongbing de los cítricos en la zona de Cuitláhuac, Ver.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Campus Peñuela Zona Orizaba-Córdoba Evaluación de tres estrategias de diagnóstico para el Huanglongbing de los cítricos en la zona de Cuitláhuac, Ver. Araceli Montiel Flores Araceli, Alejandra Vera Aguilar, Ángel Gabriel Alpuche Solís, Mario Felipe Herrera Tenorio, Héctor Fernando Cabrera Barragán

Objetivo general Evaluar tres estrategias de diagnóstico para el Huanglongbing de los cítricos en la zona de Cuitláhuac, Ver.

Objetivos particulares Para determinar: 1) Presencia o ausencia (hasta Diciembre de 2010) del patógeno Candidatus Liberibacter asiaticus en muestras foliares de cítricos de traspatio de la región de Cuitláhuac y alrededores. 2) Utilidad d de la estrategia t de sintomatología t visual para detección en campo y/o laboratorio del HLB mediante muestras foliares de cítricos. 3) Utilidad de la estrategia de tinción o prueba de almidón para la detección en campo y/o laboratorio del HLB en muestras foliares de cítricos. 4) Utilidad de la estrategia de detección por PCR del patógeno Candidatus Liberibacter asiaticus. 5) Eficacia del uso conjunto de diferentes estrategias de detección de HLB en muestras foliares de cítricos.

Método 1. Lugares seleccionados Cuitláhuac Orizaba Peñuela Yanga 2. Técnicas: a) Sintomatología visual, b) Método tinción de almidón c) Diagnóstico por PCR. 3. Infraestructura - Laboratorio de Genética y Biología Molecular; Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Campus Peñuela, Ver., Universidad Veracruzana. - Laboratorio de Biología Molecular de Plantas del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnología de San Luis Potosí (IPICYT).

RESULTADOS I) POR SÍNTOMAS

RESULTADOS 1. Sintomatología visual en tangerina Colecta en Orizaba, Ver. (21 de Noviembre de 2010) Moteado Hojas sanas (Derecha). Moteado asimétrico

1. Sintomatología visual en tangerina Colecta en Orizaba, Ver. (21 de Noviembre de 2010) Fruto de forma irregular Manchas amarillas en la base del disco del fruto: Tangerina Fruto irregular, columna curveada Hojas sanas: Tangerina Comparación de hojas enfermas (Moteado clásico) (Izquierda); con una hoja sana (Derecha). Naranja de ombligo. Semillas oscuras; aun no presentan abortamiento: Tangerina

2. Sintomatología visual Colecta en Yanga, Veracruz (27 de Diciembre de 2010) A) B) C) D) E) F) Moteado clásico asimétrico (A, D, E y F) y Aclaramiento de nervaduras (B y C)

3. Sintomatología Visual: Colecta en Cuitláhuac, Veracruz (27 de Diciembre de 2010) A) B) Muerte de ramas (A y B) y sectores amarillos (B) en planta de Pomelo

3. Sintomatología Visual: Colecta en Cuitláhuac, Veracruz (27 de Diciembre de 2010) A) B) C) sectores amarillos y muerte en ramas (A, B y C) en limón Persa

3. Sintomatología Visual: Colecta en Cuitláhuac, Veracruz (27 de Diciembre de 2010) Inversión del color en fruto (Izquierda), moteado y aclaramiento de nervaduras (derecha) Moteado asimétrico (A y C) y aclaramiento de nervaduras (B) en limón Persa A) B) C)

Colecta en Cuitláhuac, Ver., (27 de Diciembre de 2010)

Cuadro 1. Síntomas observados en muestras de follaje de cítricos de plantas de traspatios de Cuitláhuac, Orizaba, Yanga y Peñuela Ver. N de Muestra Zona Variedad Aparente sintomatología HLB Otras causas (en árbol) 1 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja 2 Cuitláhuac Limón Persa Muerte de ramas Moteado asimétrico Araña roja Ácaro blanco 3 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja Deficiencia de Mg 4 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja 5 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Hormiga roja Ácaro blanco 6 Cuitláhuac Limón Persa Sectores amarillos Moteado asimétrico Ácaro blanco 7 Cuitláhuac. Pomelo Muerte de ramas Moteado asimétrico Sectores amarillos Deficiencia de Mg Hormiga roja Araña roja Mancha grasienta 8 Cuitláhuac Naranja Moteado asimétrico Ácaro blanco 9 Cuitláhuac Limón Persa Muerte de ramas Moteado asimétrico Araña roja 10 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Hormiga roja Muerte de ramas Araña roja Sectores amarillos Mancha grasienta 11 Yanga Naranja Moteado asimétrico Aclaramiento de nervaduras Deficiencia de Mg 12 Yanga Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja 13 Orizaba Tangerina Moteado asimétrico Roña 14 Orizaba Naranja de Ombligo Moteado asimétrico Ácaro blanco Araña roja 15-24 Peñuela Limón Persa Sin síntomas Ácaro blanco Deficiencias nutricionales

Clasificación para determinar la probabilidad de la presencia del HLB de acuerdo al tipo de síntomas (Fuente: Tapia, 2009)

RESULTADOS II) Método de almidón

Hojas con probabilidad de HLB, de un mismo, árbol, rama y sintomatología similar. Hoja sana Cortes cuadrados en las hojas con posible HLB (Izquierda) Cortes en los cuadrados de las hojas (Derecha) (de acuerdo a Loredo, 2010). Inmersión por dos minutos de los cortes de las muestras en la solución diluida (10%) de tintura de yodo al 2%. Método de raspado con lija con solución de yodo al 2% (Fuente: González et al., 2009).

Cuadro 2. Resultados de la prueba de almidón en muestras foliares procedentes de plantas ubicadas en Yanga Ver. No de Muestra Zona Variedad Sintomatología HLB Otros causas (en árbol) Prueba de Almidón (corte) Prueba de Almidón (raspado) 1 Yanga Naranja Moteado asimétrico Aclaramiento de nervaduras Deficiencia de Mg Negativo Negativo 2 Yanga Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja Negativo Negativo Prueba de almidón (corte) negativa, para la zona de Yanga, Ver. Resultado de las muestras 1-2 (Ver Cuadro 1) Prueba de almidón (raspado) negativa, para la zona de Yanga, Ver. Resultado de las muestras 1-2 (Ver Cuadro 1)

Cuadro 3. Resultados de la prueba de almidón, en muestras de Orizaba Ver. No de Muestra Zona Variedad Sintomatología HLB Otros Síntomas (Árbol) Prueba de Almidón Prueba de Almidón raspado 1 Orizaba Ver. Tangerina Moteado asimétrico Roña Negativa Negativa 2 Orizaba Ver. Naranja de Ombligo Moteado asimétrico Acaro blanco Araña roja Negativa Negativa Prueba de almidón negativa, para la zona de Orizaba, Ver. Resultado de las muestras de 1-2 (Ver Cuadro 1) Prueba de almidón (raspado) Prueba de almidón (raspado) negativa, para la zona de Orizaba, Ver. Resultado de las Muestras 1-2 (Ver Cuadro 1).

Cuadro 4. Resultados de la prueba de almidón en muestras de Cuitláhuac Ver. No de Muestra Zona Variedad Sintomatología HLB Otras causas (árbol) Prueba Almidón (corte) Prueba Almidón (raspado) 1 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja Negativo Negativo 2 Cuitláhuac Limón Persa Muerte de ramas Moteado asimétrico Araña roja Ácaro blanco Negativo Negativo 3 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja Deficiencia de Mg Negativo Negativo 4 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Araña roja Negativo Negativo 5 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Hormiga roja Negativo Negativo Ácaro blanco 6 Cuitláhuac Limón Persa Sectores amarillos Moteado asimétrico Ácaro blanco Negativo Negativo 7 Cuitláhuac Pomelo Muerte de ramas Moteado asimétrico Sectores amarillos Deficiencia de Mg Hormiga roja Araña roja Mancha grasienta Negativo Negativo 8 Cuitláhuac Naranja Moteado asimétrico Ácaro blanco Negativo Negativo 9 Cuitláhuac Limón Persa Muerte de ramas Araña roja Negativo Negativo Moteado asimétrico 10 Cuitláhuac Limón Persa Moteado asimétrico Muerte de ramas Sectores amarillos Hormiga roja Araña roja Mancha grasienta Positivo Positivo

Muestras de Cuitláhuac Ver.

RESULTADOS III. DIAGNÓSTICO POR PCR

Obtención ADN de alta calidad Amplificación por Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Obtención de amplificados visualizados por electroforesis

Resultados negativos de la electroforesis de los productos de amplificación de dos muestras de ADN de cítricos procedentes de Cuitláhuac, Ver. (Octubre, 2010) Iniciadores CL-16S-F y CL-16S-R dirigidos a la region 16S rdna (Li et al., 2006; Lin et al., 2009).

Observaciones: 1.- No amplificaron las dos muestras problema 2.- La banda observada del ADN que si amplificó, es de una bacteria colocada para corroborar que los oligos CL eran específicos de Candidatus Liberibacter, lo cual no sucedió así. 3.- Sin embargo, es común ver en artículos científicos acerca de oligos específicos en los que se asevera haber amplificado a la bacteria causante de HLB (falsos positivos en muestras reales) y realmente no es así. 4.- Al continuar con los análisis de PCR, se tomarían precauciones de los resultados con oligos CL.

Pero también: No haber obtenido amplicones de las muestras pudo deberse a que: a) La concentración de ADN no fue optimizada/ estandarizada, que resultó en: b) Demasiada concentración o inhibidores de la PCR en la muestra. c) Por tanto, se optó por realizar una dilución de las muestras de ADN, para conseguir la amplificación ió preferencial del probable ADN bacteriano contenido en ellas.

Resultados POSITIVOS de los productos de amplificación del ADN diluido de las muestras foliares. La presencia de la banda en ambas muestras de ADN diluidas es una prueba de que si es posible la amplificación del ADN en esas concentraciones o diluciones de 10² y 1:500 (Iniciadores CL-16S-F y CL-16S-R dirigidos a la region 16S rdna)

Como hubo amplificación fue factible realizar la: Ligación de productos de PCR Por tanto, t con los amplificados (productos de PCR) se procedió a: 1. Ligarlos en el vector pgemt GEM-T Easy 2. Para transformar células competentes de E. coli y 3. Obtener así, plásmidos y de ellos, 4. Obtener fragmentos clonados, para su: 5. Secuenciación

Pero, realmente que pasó? 1.- En tres ocasiones se hizo el cultivo bacteriano para la obtención de las clonas. 2.- La transformación por choque térmico se repitió tres veces (porque solo se observaban colonias blancas, sugiriendo que en los protocolos de cultivo bacteriano pudo haber errores (por reactivos del medio de cultivo, por células competentes o viabilidad), por lo que no se generaban colonias azules. 3.- Pero la tercera prueba es la vencida y ahora si, se hizo con nuevas células competentes y se formaron colonias blancas y azules (que se picaron y propagaron para obtener plásmidos por método de lisis alcalina). 4.- Eventualmente, la secuenciación de las clonas mostró que la amplificación observada por electroforesis, procedió realmente de ADN de otra bacteria, Methylobacterium

Secuenciación de clonas. Clona 1231-11 (FM13) G11.seq GCGGACGTGATTTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGC CGCGGGAATTCGATTTTAACACATGCAAGTCGAGCGGGCCCTTCGGGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTG GGAACGTGCCTTCT GGTCTGGAATAACCCTGGGAAACTAGGGCTAATACCGGATACGCCCTTTTGGGGAAAGGTTTACTGCCGGAAGATCGG CCCGCGTCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCA GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGC CTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTATCCGGGACGATAATGACGGTAC CGGAGGAATAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATCACT GGGCGTA AAGGGCGCGTAGGCGGCGTTTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCTGTGGCTCAACCACAGAATGGCCTTCGATACTGGGAC GCTTGAGTATGGTAGAGGTTGGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGCAAGAACACCGGTGGCG AAGGCGGCCAACTGGACCATTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGT CCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGCTGTTGGGGTGCTTGCACCGCAGTAGCGCAGCTAACGCTTTGAGCATTCCGC CTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCTACCATCCTTTTGACATGGCGTGTTATGGG GAGAGATCCTCAGTCCTCTTCGGAGGCGCGCACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT GGGGTTAAGGTCCCGCAAACGAGCGCAAACCCCACGTTCCCTTTAAGTTTGCATCATTCCAGTTGGGGGGACAACTCC CTAAGGGGGAAGGAAACCCTGTCACCGGAGT Eco R1: GAATTC Oligo CL-16S-F 5 -TTAACACATGCAAGTCGAGCG-3

Como había cierta duda razonable del resultado, entonces: - Una estrategia fue usar oligonucleótidos específicos de la especie asiática OI1 y OI2c diseñados por Karunasagar et al. (2004), - Para amplificar la sección de 1,160 pb del gen, pero: - No se obtuvo producto de PCR, por lo que se esas muestras no tenían HLB

CONCLUSIONES 1.- Los árboles de traspatio son más vulnerables de presentar HLB y su vector; (por no recibir manejo agronómico). 2. La detección visual de los síntomas podría significar que estados de infección ió tempranos están pasando desapercibidos. 3.- En varias muestras se observó el patrón asimétrico de clorosis en muestras foliares, uno de los síntomas del HLB. 4.- La única muestra positiva en la prueba de almidón- yodo (una en 10) parece escasa pero es una posibilidad del HLB en la zona de Cuitláhuac, Ver., y si pasa a huertos comerciales podría extenderse masivamente. 5.- En las muestras negativas de Yanga, Peñuela y Orizaba, Ver., no significa que no esté presente aún la bacteria, ya que: fueron pocas muestras, b) pudieron subvaluarse o confundirse algunos síntomas con otras causas y c) follaje realmente infectado, pudiera no haber desarrollado aún la sintomatología particular del HLB, por estar el patógeno en un periodo de incubación y al no tomar esas muestras asintomáticas, no fue detectada su presencia.

6.- La Prueba de almidón parece útil y confiable si se realiza adecuadamente; su diagnóstico es rápido, fácil y de bajo costo. Y, la versión de raspado permite una mejor observación de los cambios en pigmentación de la prueba cuando es positiva. 7.- La técnica de PCR es invaluable SI: a) se cuenta con los recursos económicos y/o equipamiento i b) se tienen específicamente estandarizados los protocolos c) Se utilizan iniciadores específicos para la detección del HLB. Al respecto, los oligonucleótidos universales reportados para detectar las tres especies de HLB, pueden ser convenientes para detectar en un solo ensayo más de una especie. Pero pueden amplificar otras bacterias dando falsos positivos, por lo que es importante usarlos como un tamiz y posteriormente usar oligonucleótidos por especie.

-Y, de ser posible, enviar a secuenciar los productos amplificados por PCR para tener mas certeza en el diagnóstico. - Como una sola prueba para la detección de HLB puede no ser suficiente para la confirmación precisa y confiable de HLB, la combinación de dos o más pruebas es conveniente para mayor seguridad en el diagnóstico e incluso, para muestras asintomáticas, usar técnicas moleculares cuantitativas como el PCR en tiempo real.

UNIVERSIDAD VERACRUZANA Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias Campus Peñuela Zona Orizaba-Córdoba Por su atención. MUCHAS GRACIAS Araceli Montiel Flores Araceli, Alejandra Vera Aguilar, Ángel Gabriel Alpuche Solís, Mario Felipe Herrera Tenorio, Héctor Fernando Cabrera Barragán