4 Encuentro de Jóvenes Investigadores CONACYT 11 Coloquio de Jóvenes Talentos en la Investigación Acapulco, Guerrero 21, 21 y 23 de septiembre 2016 Memorias Purificaciónde Inmunoglobulina A, a partir deleche materna para su posible estabilización in vitro Citlaly Higuera Jiménez Universidad Autónoma de Guerrero Unidad académica de Ciencias Químico Biológicas Programa de verano Delfín citla_2803@hotmail.com Área en la que participo: III Biología y Química M.EN C. Agustín Hilario Rocha Ramírez Profesor- Investigador de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería campus Guanajuato-Instituto Politécnico Nacional- UPIIG-IPN Arochar8@gmail.com Resumen La Inmunoglobulina A (IgA), se encuentra en las secreciones mucosas del aparato respiratorio, tracto gastrointestinal, genitourinario, saliva, lágrimas y leche materna. En estudios inmunológicos recientes se ha hablado de la importancia de la IgA, sin embargo no se ha logrado su uso fuera de ella. Se considera de suma importancia el lograr la estabilización in vitro como posibles alternativas en la nutrición de los infantes, que por razones materno-fetal no se efectúa la lactancia materna. Es importante crear un proceso para su purificación y estabilización in vitro, la cual podrá ser retomada en diferentes investigaciones, conduciendo a la generación de nuevas investigaciones. Se llevó a cabo un estudio, tomando en cuenta unamuestra de leche maternaobtenida de una mujer voluntaria de 20 años de edad con 4 meses postparto.se realizó la purificación de la IgA por el método de precipitación con sulfato de amonio, para obtener IgA pura, se cuantifico la cantidad de proteínas de leche materna y, dicho resultado de la purificación de IgA se realizó por medio de SDS-PAGE. En este estudio se logróla purificación de IgA a partir de leche materna por medio de los métodos anteriormente mencionados, obteniendo bandas de IgA que se encuentran entre un peso molecular de 140 a 160 KDa, las cuales están dentro del rango que marca la literatura. Los métodos empleados demuestran que son efectivos para su purificación donde podrá ser retomada en futuros estudios para su estabilización in vitro así conducir a nuevas investigaciones. Palabras clave: Purificación de IgA,Estabilización in vitro, lactancia materna.
INTRODUCCIÓN En la actualidad la inmunología es una ciencia autónoma y madura. Consiste en el estudio delas respuestas de defensa desarrollado frente a la invasión por microorganismos o partículas extrañas..la IgA secretora predominante en la leche, el calostro, las lágrimas, la saliva y las secreciones que bañan las superficies mucosas, como nuestro tracto respiratorio, gastrointestinal y genitourinario, se deriva principalmente de la síntesis local..durante el desarrollo de este estudio sabemos que laleche materna es un líquido producido por la glándula mamaria, de gran complejidad biológica, constituido por nutrimentos, substancias inmunológicas, hormonas, enzimas, factores de crecimiento, células inmunoprotectoras, que la hacen nutricional e inmunológicamente apta para que un niño sea alimentado.. La leche materna se encuentra integrada porelementos en diferentes etapas: El Precalostro producida en la glándula mamaria a partir de la semana 16 del embarazo siendorica en proteínas, inmunoglobulinas así como ácidos grasos, hierro, sodio y cloro. Por otro lado el calostro se secreta de cinco a siete días después del parto, presenta mayor cantidad de proteínas en un 97% en inmunoglobulinas IgA mencionando que el calostro alcanza niveles de 3640 mg/ml para ser su mayor concentración y la disminuye en la segunda y tercera semana, y permanece constante en la leche materna, así como vitaminas liposolubles, protegiendo contra infecciones y alergias.. La solubilidad de una proteína en solución acuosa depende de cuatro criterios: Propiedades físicas, la distribución hidrofóbica, hidrofílica y grupos de cargas en la superficie, la temperatura y ph de la solución y por último, la concentración de varios solutos.. La solubilidad de una proteína puede cambiar de acuerdo a la concentración de iones. Si incrementa la concentración iones, las proteínas aumentan, llamado salting in, pero si hay un exceso la concentración de iones, disminuye la solubilidad de proteínas y precipitan, nombrado salting out, esto se debe por que las moléculas de agua son ladeadas por las moléculas de iones sulfato y amonio.. El método de Bradford se fundamenta en la unión proteína colorante. Donde el azul brillante G-250 Coomassie se adhiere a la proteína, el colorante se torna de rojizo a azulado..la unión del colorante a la proteína provoca un desplazamiento en el máximo de absorción del colorante 465 a 595 nm, y es el aumento en la absorción a 595 nm que se controla..finalmentela electroforesis fue inventada y empleada por primera vez por Tiselius (1937).Es un método que se emplea para separar macromoléculas dependiendo de su tamaño, carga eléctrica..
MATERIALES Y MÉTODOS Primer paso, delimitar el tema para realizar el protocolo de investigación. Con base en mi interés expuesto en el verano Delfín, la aproximación metodológica se basa en obtener la purificación de IgA a parir de leche materna para su posible estabilización in vitro. Para lo que en primer lugar se obtuvo la muestra de leche materna de una paciente voluntaria, de 20 años de edad con 4 meses postparto en condiciones estériles. Posterior a ello, se realizó la precipitación de IgA con sulfato de amonio. Para ello se ajustó a 7.8 el ph de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N, colocando 5 ml de suero de leche materna en un tubo Falcón, se adicionó medio volumen de la solución sobresaturada de sulfato de amonio, lentamente y con agitación constante. De esta forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%. Se continuó con la agitación durante 10-15 minutos en el equipo vortex. Se centrifugó el tubo a temperatura ambiente (25 C) a 3500 rpm durante 15 minutos, disolviéndose así el sedimento en solución salina regulador de boratos al 0.1 M (SSRB) a un ph hasta alcanzar el volumen original del suero. Nuevamente se repitieron los pasos anteriores a excepción de disolver el sedimento en solución salina regulador de boratos al 0.1 M (SSRB). Se disolvió el sedimento en SSRB después de la última centrifugación hasta alcanzar la mitad o un tercio del volumen original del suero. Para separar los contaminantes o sales que esta puede contener: Se dializó con Cellulose Acetate Membrane en la solución de trabajo en frío (4 C) con agitación constante a 190 rpm, durante 3 días en incubadora shaker. Se centrifugó a 3500 rpm a 4 C durante 15 minutos, se eliminó el sobrenadante dejando el precipitado y se resuspendió con agua destilada hasta su volumen original (5ml), posterior a eso se agregó solución A (SSRB) hasta su volumen original, y se colocó en agitador orbital con puerto en un vaso de precipitado con hielo por 30 minutos. Se resuspendió un 1 ml de agua destilada y finalmente se transfirió en tubo eppendorf. SDS-PAGE En primer lugar se preparó solución de tapón, utilizando para ello: 1 ml Acrilamida- Bisacrilamida,a 25 de TEMED, yde igual manera de persulfato de amonio. Posteriormente se preparó un gel separador, utilizando un Amortiguador con un ph de 8.8 (2.5 ml), Acrilamida-Bisacrilamida a 3.75 ml, utilizando también H 2 O Bidestilada a 3.74ml,TEMED y persulfato de amonio a(100ml). A continuación se preparó un gel concentrador, con un Amortiguador de 6.8 de ph (750ml) y Acrilamida-Bisacrilamida a 500ml, utilizandopara ello 200 de H 2 O Bidestilada, TEMED a 60 y persulfato de amonio a 120. Se agregó las soluciones en el mismo orden a la cámara de electroforesis en tiempo rápido y así mismo se colocó el peine, colocando los vidrios en la parte que no se trabajó, adicionando buffer de corrida, y al término se retiró el buffer de corrida. Se retiraron los vidrios de la cámara de electroforesis para tomar solamente el gel y pasarlo a un recipiente,
agregando solución teñidora con un tiempo de 20 a 30 minutos en agitación constante en el agitador orbital con puerto. Posteriormente se retiró la solución teñidora, lavando con agua destilada. Se adicionó solución desteñidora I con un tiempo de 20 a 30 minutos en agitación constante en el agitador orbital con puerto, pasado ese tiempo en agitación se retira lasolución teñidora I, y nuevamente se vuelve a lavar con agua destilada. Se adiciona solución desteñidora II con un tiempo de 20 a 3 minutos en agitación constante en el agitador orbital con puerto, por último se retira la solución desteñidora II y se agrega agua destilada, colocando el gel en el transiluminador para su lectura. Cuantificación de proteínas de la leche materna por método de BRADFORD El método de Bradford tiene como objetivo la cuantificación de proteínas. La cuantificación de proteínas a través de derivados colorimétricos, fueútil para obtención de resultados en la metodología realizandolo siguiente. Primero se realizaron 3 diluciones de las proteínas de la leche materna, adicionando 200 de leche materna y 800 de agua destilada. Se agregó de la primera dilución 200y 800de agua destilada, después se agregó de la segunda dilución 200y 800de agua destilada. Posteriormente se realizaron otras diluciones, tomando de cada muestra 200y 800del reactivo de Bradford. Donde se obtuvieron diluciones de 20%, 0.2%, 0.02%, 0.002% y se midieron a una absorbancia de 280nm. Tomando en cuenta que para el análisis de las diluciones se utilizó en Nanodrop 2000c. RESULTADOS Con la técnica de precipitación por sulfato de amonio se logró obtener: La precipitación con sulfato de amonio nos permite precipitar una fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. De la muestra (leche materna), se purifico IgA para ello se aplicó la metodología de precipitación con sulfato de amonio, logrando el precipitado de IgA (Fig. 1), esto debido a cambio de ph, temperatura y la adición del antes mencionado solvente.
SDS-PAGE En la técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS se obtiene: La separación de proteínas se hace en función de la masa molecular, lo cual se logró observar al aplicar dicho método (Fig. 2) para seguir el avance de la separación, se añadió un colorante, como azul de bromofenol, que sirvo como referencia para la posterior lectura, siendo este reactivo el que nos muestra las bandas de IgA que se formaron las cuales reflejan se encuentra entre un peso molecular de 140 a 160 KDa encontrándose dentro del rango que sugiere la literatura posee la IgA. Cuantificación de proteínas de leche materna por método de BRADFORD El método de Bradford tiene como objetivo la cuantificación de proteínas A través de derivados colorimétricos, por medio de este método se logró conocer la concentración de proteínas que tenía nuestra muestra, siendo esta la leche materna a partir de una dilución 1:4, de 1ml. Tabla 1. Concentración de proteínas de leche materna en diferentes diluciones. Dilución (%) Absorbancia Concentración µg/ml 20 0,308 117,923077 0,2 0,252 103,564103 0,02 0,216 94,3333333
Discusión y conclusiones En base al desarrollo deeste estudiola IgA es de gran importancia. Es la que se encuentra en mayor proporción en leche materna, a diferencia del el resto de las inmunoglobulinas. Cabe mencionar que durante este trabajo, se llevó a la práctica la técnica de precipitación de gamma globulina con sulfato de amonio para su purificación con la finalidad de obtener el precipitado de IgA. Ahora en base a lo observado, el cambio de ph, el aumentode la temperatura así como su adicción de solventes es como se logra obtener el resultado de dicha precipitación, así mismo al momento de incrementar la concentración de las sales en la solución incorporando lentamente sulfato de amonio, se interpretaque la proteína comienza a ceder intercambios iónicos con los iones amonio y sulfato, sustituyendo así los sitios de intercambios y pasado dicho tiempo la proteína logrósu solubilidad llegando así a su precipitación, es por eso que esta técnicaes llevada a la práctica debido a que el sulfato de amonio es un excelente componente para la llamada precipitación de proteínas. Es importante mencionarque para la obtención de la purificación de proteínas Fue necesario realizar la diálisis, utilizando una membrana de acetato de celulosa ayudando a separar el producto, sales y otros compuestos, permitiendo la selección de partículas y limitar el resto. Por lo tanto para la realización de esta técnica es importante utilizar acetato de celulosa, ya que tiene importantes propiedades como buena absorción de transporte, baja absorción de proteínas, estabilidad mecánica, destacable hidrofilicidad, formación de película y rechazo alto de salinidad. Por lo tanto es importante que este paso se realice a una baja temperatura y en agitación constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales. Se realizópara este este estudioel método de electroforesis (SDS-PAGE) Utilizado para este estudio (SDS-PAGE), permitiendo en esta técnica poder observar la migración de proteínas a través de un soporte denominado como gel de poliacrilamida sujeto a un campo eléctrico, donde su movilidad estará dada en función principalmente de su peso molecular.el resultado de realizar la electroforesis consistió en la separación de mezclas de proteínas que permite analizar la pureza de la muestra de IgA en estudio. No obstantegracias a la concentración de acrilamida y bisacrilamida en la preparación del gel, nos ayudó a conseguir distintos grados de porosidad, así como distintos intervalos de separación de proteínas ya que eneste procedimiento de electroforesishacen relevante la capacidad del tris-hcl para ajustar el tampón a un ph específico de un intervalo de 7 a 9.2 de ph, por lo tanto en el desarrollo de este estudio utilizamos un ph de 8.8 para nuestro gel separador y otro ph de 6.8 para nuestro gel concentrador a fin de utilizarlos durante la lisis celular, para eliminar la precipitación de componentes celulares no deseados, evitando que otros factores celulares influyan en el ph estable. Al igual es importante mencionar que es necesario reactivos de alta calidad para hacer geles reproducibles y de alta resolución, en particular creemos que esto es muy importante para la acrilamida, ya que es el constituyente más abundante del gel ya que sus principales
impurezas son ácido acrílico residual que puede retardar la movilidad electroforética de algunas proteínas, poliacrilamida lineal e ion. Finalmente a partir del método de Bradford en los resultados fue posible: Determinar la concentración de proteínas de leche materna. En este método se utilizóel reactivo de azul brillante de coomasie, este tipo de reactivo ayuda a reaccionar directamente con aminoácidos específicos y estructuras terciarias de la proteína, observando que el color cambia de color azul a café, siendo asíposiblela cuantificación delas proteínas que se encuentran en la leche materna a partir de diluciones seriadas de la muestra. La leche materna es importante, y está constituida por nutrimentos esenciales. Es abastecedora de inmunidad, donde la IgA se encuentra en mayor concentración y juega un papel muy importante en la protección contra infecciones del infante debido a sus nutrientes. En base a los resultados obtenidos del método empleado para la purificación de IgA mediante precipitación de IgA con sulfato de amonio, el cualdemostró ser rápido y tenerpropiedades físico-químicas que favorecen su unión por lo tanto evita su degradación.por medio del método de Bradford es posible cuantificar las proteínas que se encuentran en la leche materna a partir de diluciones seriadas de la muestra. Para la identificación de la proteína se utilizó el método de SDS-PAGE. Este consiste en migración de partículas cargadas en campo eléctrico, lo cual nos permite relacionar la proteína de interés expresada en Dalton (Da). Los métodos empleados demuestran que son efectivos para su purificación donde podrá ser retomada en futuros estudios para su estabilización in vitro así conducir a nuevas investigaciones. Agradecimientos Por medio de esta estancia, obtuve nuevos conocimientos, los cuales serán de gran utilidad para mi formación académica, por lo que agradezco: En primer lugar al programa Delfín, por permitirnos participar como jóvenes investigadores en el XXI Verano de la Investigación Científica y Tecnológica del Pacifico 2016. También agradezco a la Universidad Autónoma de Guerrero, por apoyarme en los trámites correspondientes para obtener este logro.agradeciendo a mi investigador elm. EN C. Agustín Hilario Rocha Ramírez por aceptar ser mi asesor en el proyecto de investigación Purificación de Inmunoglobulina A, a partir de Leche Materna para su posible estabilización in vitro, quese llevó a cabo en la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería campus Guanajuato- Instituto Politécnico Nacional UPIIG-IPN mostrando disponibilidad e interés para obtener un trabajo adecuado. A los profesores asesores, responsables del laboratorio Claudia Pérez Sánchez. Así mismo agradezco a los compañeros que trabajamos en conjunto para culminar esta etapa en nuestra formación: María Guadalupe Estrada Muñoz, Diana Laura Hernández Vázquez y Citlaly Higuera Jiménez.
Referencias