Cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC): fundamentos y teoría CONSTRUYENDO UNA CIENCIA MEJOR ENTRE AGILENT Y USTED 1
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Introducción La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, por sus siglas en inglés), anteriormente denominada cromatografía de líquidos de alta presión, es una técnica en el campo de la química analítica utilizada para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla. En la HPLC se utilizan bombas para hacer pasar un disolvente líquido presurizado mezclado con la muestra a través de una columna rellena de un adsorbente sólido. Cada componente de la muestra interactúa de forma ligeramente diferente con el adsorbente, lo que hace que los distintos componentes presenten velocidades de flujo distintas y posibilita la separación de los componentes a medida que salen de la columna. Fuente: Wikipedia. 3
Introducción Qué sucede en el interior de la columna? Parámetros clave Tiempo de retención y anchura de pico Resolución: separación en la línea de base Resolución: ecuación fundamental Eficiencia o número de platos teóricos Factor de retención Selectividad o factor de separación Cómo se puede influir sobre la selectividad? Selectividad: ejemplo n.º 1 Selectividad: ejemplo n.º 2 Selectividad: ejemplo n.º 3 Número de platos Ecuación de Van Deemter Difusión turbulenta Difusión axial Resistencia a la transferencia de masa Más información sobre la ecuación de Van Deemter Capacidad de picos Análisis en gradiente Definición Cálculo de la capacidad de picos Anchura de pico Ejemplo 4
Introducción Qué sucede en el interior de la columna? Tiempo (t) Separación (t r2 -t r1 ) Anchura de pico (W b1,2 ) 5
Introducción Qué sucede en el interior de la columna? t r2 -t r1 t r2 -t r1 Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad W b1 W b2 W b1 W b2 Separación de mayor calidad frente a Separación de menor calidad 6
Introducción Qué sucede en el interior de la columna? R s tr2 tr1 1/ 2 ( Wb 2 Wb 1) Tiempo (t) La resolución indica la capacidad de una columna para separar los picos de interés. Permite conocer si se ha conseguido la separación en la línea de base o no. Separación (t r2 -t r1 ) Anchura de pico (W b1,2 ) Etiqueta de confidencialidad 6 kwietnia 2016 7
h Parámetros clave Tiempo de retención y anchura de pico t r1 t r2 t ri W 1/2 W bi Tiempo de retención del compuesto "i" Anchura de pico a la mitad de la altura Anchura de pico en la línea de base W 1/2 W b1 W b2 t 8
h Parámetros clave Resolución: separación en la línea de base La resolución indica la capacidad de una columna para separar los picos de interés. Sobre la resolución influyen la eficiencia (N), la selectividad (a) y la retención (k). Debe tener como mínimo un valor igual a 1 para que se produzca una separación medible y se pueda realizar una cuantificación adecuada. Se necesita un valor igual a 0,6 para que se pueda distinguir un valle entre dos picos de la misma altura. Para los métodos más robustos normalmente se requieren valores iguales o superiores a 1,7. Se considera que un valor igual a 1,6 se corresponde con una separación en línea de base y garantiza unos resultados cuantitativos de precisión máxima. R s = 1,5 t 9
Parámetros clave Resolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC R s 1 4 N a 1 k a 1 k Eficiencia Selectividad Retención La resolución se puede aumentar mejorando cualquiera de esos parámetros: La selectividad es el parámetro con mayor influencia sobre la resolución. Con pequeñas variaciones de selectividad se pueden conseguir grandes cambios en las resoluciones. La retención únicamente influye de manera significativa cuando el valor del parámetro k es bajo. La eficiencia indica el poder de separación de la columna. 10
Parámetros clave Resolución: ecuación fundamental de la (U)HPLC La selectividad tiene una influencia máxima sobre la resolución: Cambio de la fase estacionaria. Cambio de la fase móvil. Es la forma más sencilla de aumentar el número de platos. En la figura se muestra la resolución en función de la selectividad, la eficiencia de la columna y la retención. 11
Parámetros clave Eficiencia o número de platos teóricos (N) N tr 16 W b 2 N t 5,54 W r 1/ 2 2 La eficiencia de la columna se utiliza para comparar el rendimiento de diferentes columnas. Se expresa por medio del número de platos teóricos (N). Las columnas con un número alto de platos son más eficientes. Una columna con un valor N alto generará picos más estrechos para un determinado tiempo de retención que una columna con un valor N más bajo. Parámetros que influyen sobre la eficiencia de la columna: Longitud de la columna (a mayor longitud, mayor eficiencia). Tamaño de partícula (a menor tamaño de partícula, mayor eficiencia). 12
Parámetros clave Factor de retención (k) k t r t t 0 0 El factor de retención mide el tiempo que un componente de la muestra permanece en la fase estacionaria en comparación con el tiempo que permanece en la fase móvil. Se calcula dividiendo el tiempo de retención entre el tiempo de un pico no retenido (t 0 ). Parámetros que influyen sobre el factor de retención: Fase estacionaria Fase móvil Pendiente del gradiente* Volumen muerto del sistema* * Únicamente para la elución en gradiente. 13
Parámetros clave Factor de retención (k): eluciones en gradiente k ` S tg F V m Esta ecuación indica la influencia sobre el factor de retención de la velocidad de flujo (F), el tiempo del gradiente (t G ), el rango del gradiente (ΔΦ) y el volumen de la columna (V m ). Recuerde: Para mantener constante el factor de retención, los cambios en el denominador se deben compensar con cambios proporcionales en el numerador y viceversa. 14
Parámetros clave Selectividad o factor de separación (α) a k k 2 1 a k 1 k 2 Selectividad Factor de retención del primer pico Factor de retención del segundo pico La selectividad es una medida del tiempo o la distancia entre los máximos de dos picos. Si α = 1, ambos picos tendrán el mismo tiempo de retención y se coeluirán. Se define como la relación de los factores de capacidad. Parámetros que influyen sobre el factor de retención: Fase estacionaria Fase móvil Temperatura 15
Parámetros clave Influencia de N, α y k sobre la resolución 16
Cómo se puede influir sobre la separación? Muestra idéntica analizada con diferentes fases estacionarias, pero con la misma temperatura, fase móvil y gradiente. 17
Cómo se puede influir sobre la separación? Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y temperatura, pero con diferentes fases móviles (mismo gradiente). 18
Cómo se puede influir sobre la separación? Muestra idéntica analizada con la misma fase estacionaria y fase móvil, pero con diferentes temperaturas (mismo gradiente). 19
Cómo se puede influir sobre la separación? Qué es un plato en HPLC? R s ~ 1 4 N R s ~ 1 4 Lc H ~ 1 4 Lc h d p L C d p h Longitud de la columna Tamaño de partícula Altura reducida de un plato teórico Un plato teórico es la etapa hipotética en la cual dos fases de una sustancia (fase líquida y fase vapor) se encuentran en equilibrio. 20
Cómo se puede influir sobre la separación? Un número de platos (N) alto aporta las siguientes ventajas: Picos agudos y estrechos Mejora de la detección Capacidad de picos que permite analizar muestras complejas No obstante, la resolución únicamente aumenta de forma proporcional a la raíz cuadrada del número de platos. R S ~ N Asimismo, el aumento del número de platos viene limitado por las condiciones experimentales. Por ejemplo, el tiempo de análisis y la presión. 21
Cómo se puede influir sobre la separación? Interrelación: anchura de pico y altura reducida de un plato teórico R s 1 / 2 tr1 t (W b2 r 2 W b1 ) R s ~ 1 4 Lc h d p h f (w ) h f (w eddy w ax w C ) h: altura reducida de un plato teórico 22
Ecuación de Van Deemter Difusión turbulenta w turb ~ λ d p λ: Calidad del relleno de la columna Diferencias en las vías de difusión causadas por: Trayectorias diferentes Relleno deficiente de la columna Distribución amplia de tamaños de partícula 23
Ecuación de Van Deemter Difusión axial o longitudinal Aumento de la anchura de pico debido a la autodifusión del analito. Si existe un flujo reducido, el analito permanece en la fase móvil durante un tiempo prolongado. Notable aumento de la anchura de pico. Mayor altura de plato teórico. Flujo 24
Ecuación de Van Deemter Resistencia a la transferencia de masa w C ~ d p 2 Diferentes trayectorias de difusión Partícula porosa Capa estacionaria de fase móvil 25
Ecuación de Van Deemter La ecuación de Van Deemter expresa las variaciones por unidad de longitud de una columna de separación en función de la fase móvil lineal, de forma que tiene en cuenta las propiedades físicas, cinéticas y termodinámicas de una separación (fuente: Wikipedia). h = f (w turb + w ax + w C ) h = A + B/u + C u Difusión turbulenta Coeficiente de difusión Resistencia a la transferencia de masa 26
Altura reducida de un plato teórico (h) Ecuación de Van Deemter h = A + B/u + C u Curva total (Van Deemter) Resistencia a la transferencia de masa Difusión turbulenta Difusión axial Flujo 27
Ecuación de Van Deemter Medidas con diferentes tamaños de partícula Las partículas pequeñas reducen la altura de los platos teóricos y, por tanto, aumentan la eficiencia de la separación. En el caso de las partículas de menor tamaño, la eficiencia de la separación se ve menos afectada al aumentar el flujo. 3,5 m 1,8 m 5,0 m 28
Ecuación de Van Deemter Curvas reales para diferentes analitos Ecuación de Van Deemter solo para análisis isocráticos. Específica para compuestos e instrumentos concretos. No horizontal incluso para partículas de tamaño inferior a 2 μm. La velocidad de flujo óptima depende del compuesto P. Petersson et al. (AZ), J. Sep. Sci., 31, 2346-2357, 2008. 29
Capacidad de picos Análisis en gradiente h f (w 2 ) Altura reducida del plato teórico en función de la anchura de pico Análisis isocrático: La anchura de pico depende exclusivamente de los procesos de difusión. Análisis en gradiente: La anchura de pico depende de los procesos de difusión y del gradiente, sobre todo en la cabeza de la columna. 30
Capacidad de picos Definición La capacidad de picos es el número de picos (n) que se pueden separar en un determinado tiempo con una determinada resolución. La capacidad de picos depende de diferentes factores, como la longitud de la columna y el tamaño de partícula. Capacidad de picos: 32 picos en 2,5 min 31
Capacidad de picos Significado aplicando la teoría estadística de la superposición de picos la resolución de los picos se ve notablemente perjudicada cuando el número de componentes presentes en una muestra supera la tercera parte de la capacidad de picos. J.M. DAVIS, J.C. GIDDINGS, ANAL. CHEM., 55 (1983), 418 para poder analizar el 98 % de los componentes, la capacidad de picos debe ser mayor que el número de componentes en un factor igual a 100. J.C. GIDDINGS, J. CHROMATOGR., A 703 (1995), 3 32
Capacidad de picos Cálculo de la capacidad de picos P 1 1 n t G n 1 w 1 t w G av w av n t G w Anchura media de los picos Número de picos Tiempo del gradiente Anchura del pico seleccionado Simplificación: P 1 tg w 33
Capacidad de picos Anchura de pico Anchura de pico a la mitad de la altura Anchura de pico al 5 % de la altura Anchura de pico al 4,4 % de la altura (5σ) Anchura de pico según el método de la tangente 34
Capacidad de picos Ejemplo mau 60 Columna: 2,1 x 150 mm, 1,8 µm Retropresión: 402 bar Capacidad de picos: 313 40 20 0 mau 50 40 10 20 30 40 50 min Columna: 2,1 x 300 mm*, 1,8 µm Retropresión: 598 bar Capacidad de picos: 406 30 20 10 0 20 40 60 80 100 min * Columna de 300 mm obtenida mediante la unión de dos columnas de 150 mm. 35
Más información Para obtener más información sobre los productos de Agilent, visite los sitios web www.agilent.com y www.agilent.com/chem/academia. Tiene alguna consulta o sugerencia en relación con esta presentación? Escriba a andrea_zenker@agilent.com. Publicación Título N.º pub. Manual técnico The LC Handbook 5990-7595EN Nota de aplicación The influence of silica pore size on efficiency, resolution and loading in Reversed-Phase HPLC 5990-8298EN Nota de aplicación Increasing resolution using longer columns while maintaining analysis time 5991-0513EN Reimpresión de artículo Póster Nota de aplicación A simple approach to performance optimization in HPLC and its application in ultrafast separation development Study of physical properties of superficially porous silica on its superior chromatographic performance Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using gradient parameters 5990-6933EN Nota de aplicación Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC 5990-6932EN Nota de aplicación Increased peak capacity for peptide analysis with the Agilent 1290 Infinity LC system 5990-6313EN Sitio web CHROMacademy (acceso gratuito a los cursos online para estudiantes y personal universitario) 36
GRACIAS POR SU ATENCIÓN 5991-5411ES 37
Abreviaturas Abreviatura Definición Abreviatura Definición α Selectividad t Tiempo d p Tamaño de partícula t r Tiempo de retención ΔΦ Rango del gradiente t 0 Tiempo muerto de la columna F Velocidad de flujo t G Tiempo del gradiente h k L c λ N Altura reducida de un plato teórico (medida del poder de resolución de una columna) Factor de retención, anteriormente conocido como factor de capacidad (k') Longitud de la columna Calidad del relleno de la columna Eficiencia o número de platos de la columna V m w W 1/2 W bi w turb w ax w C w av Volumen de la columna Anchura de pico Anchura de pico a la mitad de la altura Anchura de pico en la línea de base Difusión turbulenta Difusión axial o longitudinal Resistencia a la transferencia de masa Anchura media de los picos P Capacidad de picos R Resolución 38