MICROALGAS OLEAGINOSAS Grupo de Bioenergía Facultad de Ciencias Físico Matemáticas e Ingeniería de la Universidad Católica Argentina
MICROALGAS Algunas Características Protistas eucarióticos y cianoficeas procarióticas. Fotosintetizadoras: Sustancias inorgánicas luz solar M. O. CO 2 Consumen 183 Ton CO 2 y producen 100 Ton masa. Producen 60-80 Ton Peso Seco/Ha/Año.
MICROALGAS Algunas Características Crecen en medios líquidos agua dulce agua de mar efluentes medios inorgánicos Crecimiento en condiciones variables. Corto tiempo generacional. Al ser unicelulares toda la biomasa presenta los productos de interés.
MICROALGAS Algunas Características A diferencia de los vegetales superiores: Sus cultivos no son estacionales. Cosecha continua. No compiten por el uso de los suelos. No compiten por el uso del Agua. No requieren pesticidas ni herbicidas.
Producción de aceite Fuente Rendimiento de Aceite(L/ha) Área necesaria de Cultivo (M ha) c Maíz 172 1540 Soya 446 594 Canola 1190 223 Jatrofa 1892 140 Coco 2689 99 Aceite de Palma 5950 45 Microalga a 136900 2 Microalga b 58700 4.5 Producción de aceite a partir de diferentes fuentes a. 70% en peso de aceite en la biomasa b. 30% en peso de aceite en la biomasa c. Para solventar el 50% del combustible necesario para el transporte en USA. Jaramillo Obando, Juan Jacobo, Evaluación Tecno económica de la producción de biocombustibles a partir de microalgas, Universidad Nacional de Colombia, 2011 Gao, 2009; Schenk, 2008; Chisti 2007.
MICROALGAS en el siglo XX 1935-1940: Desarrollo de sistemas algales como fuente de proteínas. 1939-1945: Alemania produce algas para extraer lípidos y proteínas. 1940: Desarrollo de sistemas algales para acuicultura. 1960: Japón y Taiwan producen Chlorella como fuente de alimento natural. 1960-1980: Investigaciones con fines medioambientales (transformación de aguas residuales) Biomasa 1970: para combustible Efluente Tratado para biofertilizantes
Alimentos. MICROALGAS Aplicaciones Pigmentos. Vitaminas. Polisacáridos. Tratamiento efluentes/ fertilización. Generación de Biocombustibles.
BIOETANOL MICROALGAS Aplicaciones BIOMETANO BIOHIDRÓGENO BIODIESEL OTROS industria farmacéutica cosmetología complementos nutricionales
MICROALGAS Composición Química 20-30% Lípidos Biomasa Algal 40-50% Proteínas Carbohidratos y otros
MICROALGAS Contenido de Aceite de Algunas Especies Especies Botryococcus braunii 25-75 Chlorella sp 28-32 Crypthecodinium cohnii 20 Cylindrotheca sp 16-37 Dunaliella primolecta Isochrysis sp Monallanthus salina Nannochloris sp Contenido de Aceite (% peso biomasa seca) 23 25-33 20 20-35 Nanochloropsis sp 31-68 Neochloris oleoabundans Nitzchia sp 35-54 45-47 Shizochytrium sp 50-77 Chisti, 2007
MICROALGAS Diversos Lípidos Sintetizan ácidos grasos para diversos lípidos: Lípidos polares. Lípidos neutrales triglicéridos Ceras. Esteroles. Glicolípidos. Carotenoides. Tocoferoles.
MICROALGAS Loera-Quezada, Maribel; Olguín, Eugenia, Las microalgas oleaginosas como fuente de Biodiesel: retos y oportunidades en Revista Latinoamericana Biotecnol Amb Algal, 2010, p. 99
MICROALGAS La concentración total y la tipología de ácidos grasos: a) Específica. b) Tiene influencia ambiental -luz -ph -salinidad -temperatura -concentración de Nitrógeno y otros
Desarrollo de un cultivo intermitente dx X 0 dt dx dt dx dt. t
MICROALGAS Producción de Triglicéridos La producción de biomasa y de triglicéridos NO es simultánea Primera Etapa: Producir biomasa (medio de cultivo rico en nutrientes). Segunda Etapa: Aumentar la concentración de lípidos en la biomasa ya producida (condiciones de estrés)
MICROALGAS Producción de Triglicéridos Condiciones de estrés Deficiencia de nutrientes Químico Salinidad ph Físico Temperatura Luz
MICROALGAS Producción biomasa algal a) Sistema abierto tipo carrousel
MICROALGAS Producción biomasa algal b) Sistema cerrado (FBR)
Otros fotobiorreactores
MICROALGAS Grupo Biocombustibles-UCA 2012 Curso en el Laboratorio de Microalgas de la Facultad de Ciencias Naturales, de la UNPSJB bajo dirección de Prof. Isabel Albarracín (UNPSJB - CONICET). Incorporación de cepas provenientes de UNPSJB. Mantenimiento de cepas con repiques periódicos. 15 días
Factores involucrados en el crecimiento de cultivos en pequeña escala Iluminación Nutrientes Alga Salinidad (marinas) Agitación Temperatura ph
Mantenimiento de cultivos unialgales.
Obtención de cultivos axénicos.
Determinación del crecimiento algal por recuento microscópico (cámara Neubauer). Realización de ensayos para investigar comportamiento metabólico (Chlorella vulgaris y Scenedesmus quadricauda).
APROVECHAMIENTO DE LA GLICERINA PARA LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA ALGAL Se estudió el aprovechamiento de glicerina para la producción de biomasa algal por la especie Chlorella vulgaris. (UNPSJB) Se evaluó el crecimiento algal con diferentes concentraciones de glicerina. Se determinaron la glicerina residual, los triglicéridos totales y el perfil de los mismos.
Ensayo A- La microalga utilizada: Chlorella vulgaris B- Se utilizó medio de cultivo Detmer modificado (Accorinti,1960). (Anexo). C- Se realizaron 5 tratamientos, todos sobre 200 cc de medio de cultivo. GLICERINA/ LITRO 1 0, 125 gr 2 0,25 gr 3 0,5 gr 4 1 gr 5 2 gr D- Todos fueron inoculados con una densidad inicial de 75.937 células/ ml.
CHLORELLA VULGARIS Taxonomía Orden: CHLOROCOCCALES Familia: OOCYTACEA Género: CHLORELLA Morfología: esférica, 2-10 micrones diámetro Clorofila a y b Vitamina C Betacaroteno Vitaminas B1, B2, B6, B12.
Condiciones del Ensayo A- Duración del ensayo: 12 días. B- Incubación a temperatura de 22 C C- Fotoperíodo16:8. D- Agitación diaria manual. E-Diariamente se realizaron recuentos celulares con Cámara de Neubauer, por triplicado y se determinó el ph.
Densidad celular (n celulas/ml) RESULTADOS ENSAYO 1: CHLORELLA VULGARIS CON 0,125 gr de glicerina /L Día ph Densidad celular 0 6,8 75937,5 3000000 1 2 2500000 3 7,95 92000 4 8,2 128750 5 8,47 215400 6 8,35 533750 7 7,62 532500 2000000 1500000 1000000 8 8,53 473750 9 8,81 678000 10 8,77 873700 11 9,09 1000800 12 9,39 1185833 13 9,64 2633750 14 9,38 2823330 500000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Días
ENSAYO 1: CHLORELLA VULGARIS CON 0,125 gr de glicerina /L Tiempo Concentracion ln C/Co 3 9,2 0,000000 4 12,875 0,336084 5 21,54 0,850708 6 53,375 1,758139 7 53,25 1,755794 8 47,375 1,638891 9 67,8 1,997359 10 87,37 2,250948 11 100,08 2,386766 12 118,5833 2,556412 13 263,375 3,354375 14 282,333 3,423884
Densidad celular (n celulas/ml) ENSAYO 2: CHLORELLA VULGARIS CON 0,25 gr de glicerina /L Día ph Densidad celular 0 6,8 75937 1 2 3 8,2 159583 4 8,16 167916 5 8,27 355000 6 8,21 393750 7 8,81 538333 8 8,16 815833 9 8,25 875416 10 7,74 903333 11 7,84 1103333 12 7,85 1055000 Días 13 9,21 1192900 14 9,24 1647916
ENSAYO 2: CHLORELLA VULGARIS CON 0,25 gr de glicerina /L Tiempo Concentracion ln C/Co 3 15,9583 0,000000 4 16,7916 0,050900 5 35,3 0,793904 6 39,375 0,903152 7 53,8333 1,215913 8 81,5833 1,631646 9 87,5416 1,702135 10 90,3333 1,733527 11 110,3333 1,933527 12 105,5 1,888732 13 119,29 2,011578 14 164,7916 2,334703
Densidad celular (n celulas/ml) ENSAYO 3: CHLORELLA VULGARIS CON 0,5 gr de glicerina /L Día ph Densidad celular 0 6,8 75937 1 2 3 8,17 187500 3000000 2500000 4 8,32 283750 5 8,41 267375 6 8,11 334166 2000000 1500000 7 8,65 444166 8 8,52 482083 9 8,67 682500 10 7,95 703750 11 8,48 1084166 12 8,41 1172916 13 7,64 1526666 14 7,47 2672916 1000000 500000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Días
ENSAYO 3: CHLORELLA VULGARIS CON 0,5 gr de glicerina /L Tiempo Concentracion ln C/Co 3 18,75 0,000000 4 28,375 0,414315 5 26,7375 0,354873 6 33,4166 0,577859 7 44,4166 0,862420 8 48,2083 0,944337 9 68,25 1,291984 10 70,375 1,322644 11 108,4166 1,754787 12 117,2916 1,833469 13 152,6666 2,097063 14 267,2916 2,657146
Modelado de la cinética de crecimiento de las micro algas X. 2 X o n Si definimos un tiempo de generación g =t/n X ln ln X 2 g X o.2 ln t g X dx. dt X ln X ln X o t.ln t. 2 g velocidad o generalizando específica de crecimiento
Cinética de crecimiento Ln X/X o lnx - lnx o = t.µ lnx/x o = t.µ Pendiente = µ Tiempo en días
Densidad celular (n celulas/ml) ENSAYO 4: CHLORELLA VULGARIS CON 1 gr de glicerina /L Día ph Densidad celular 0 6,8 75937 1 2 3 8,28 266250 4 8,43 364166 5 8,28 422500 6 8,28 507083 7 8,81 587500 8 8,3 716666 9 7,96 690833 10 7,58 1134166 11 7,63 1004583 12 7,59 1208750 Días 13 7,7 1752083 14 7,67 2162083
ENSAYO 4: CHLORELLA VULGARIS CON 1 gr de glicerina /L Tiempo Concentracion ln C/Co 3 26,625 0,000000 4 36,4166 0,313174 5 42,25 0,461754 y = 0,1744x - 0,4475 R² = 0,9733 6 50,7083 0,644239 7 58,75 0,791441 8 71,6666 0,990174 9 69,0833 0,953462 10 113,4166 1,449217 11 100,4583 1,327892 12 120,875 1,512906 13 175,2083 1,884125 14 216,2083 2,094392 µ 0,174 1/ días
Densidad celular (n celulas/ml) ENSAYO 5: CHLORELLA VULGARIS CON 2 gr de glicerina /L Día ph Densidad celular 0 6,8 75937 1 2 3 8,25 165400 2100000 1800000 1500000 4 8,19 275000 5 8,3 417783 6 8,1 479166 7 8,8 541666 8 8,17 583333 9 8,16 782916 10 7,72 768750 11 7,89 859583 12 7,65 1270416 13 7,46 1317916 14 7,57 2120800 1200000 900000 600000 300000 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Días
ENSAYO 5: CHLORELLA VULGARIS CON 2 gr de glicerina /L Tiempo Concentracion ln C/Co 3 16,54 0,000000 4 27,5 0,508404 5 41,7783 0,926595 6 47,9166 1,063680 7 54,1666 1,186283 y = 0,1898x - 0,2504 R² = 0,9456 8 58,33 1,260335 9 78,296 1,554715 10 76,875 1,536399 11 85,9583 1,648081 12 127,0416 2,038733 13 131,79 2,075428 µ 0,189 1/ días 14 213,4166 2,557464
Anexo - Medio Detmer Modificado Fuente Accorinti (1960) Solución A (macronutrientes) Ca (NO 3 ) 2 4H 2 O 1.439gr KH 2 PO 4 0.25gr MgSO 4 7H 2 O KCl Solución B (Tartrato férrico) FeCl 3 6H 2 O 0.91gr Ácido tartárico 0.5gr 0.51gr 0.25gr Solución C (micronutrientes) H 3 BO 3 MnCl 2-4H 2 O ZnCl 2 CuCl 2 0.28gr 0.18gr 0.01gr 0.005gr Observaciones: para un litro de solución final se necesita Solución A: 25ml Solución B: 1 ml Solución C: 1ml Se utiliza agua destilada para llevar a un litro de solución final. Se debe ajustar el ph de la solución final a 6.8 con OHNa 0.40% (m/v). Se esteriliza en autoclave a 120 C y 1.5 kg/cm 2 durante 25 minutos.
Método cromatográfico Para triglicéridos se basó en la Norma ASTM D6584-00 (Glicerina en Biodiesel B-100) Para glicerina libre se utilizó un método basado en las Normas USP y Farmacopea Europea. Para ácidos grasos, Normas USP y Farmacopea Europea. Para todas las corridas, Cromatógrafo gaseoso marca Agilent 6890 con detector de Masas 5973 usando columna HP-5MS DE 30 m, 0,25 mm diámetro y 0,25 µm de espesor de film.
Cuantificación de Glicerina Residual 1) Preparación de la muestra: Centrifugación de la muestra Secado de sólido en estufa a 100 C Adición de 2mL de Cloroformo + 1 ml de Metanol Ultrasonido Adición de 0,5 ml de solución saturada de NaCl Fase acuosa: Análisis de Glicerina libre
Cuantificación de Glicerina Residual 2) Resultados: Muestras Glicerina Libre % P/P Extracto seco 0,025 gr/200 ml 0,24 0,05 gr/200 ml 0,05 0,10 gr/200 ml 4,94 0,20 gr/200 ml 2,85 0,40 gr/200 ml 19,02
Cuantificación de Glicerina Residual Ensayo Glicerina inicial (gr/200ml) Glicerina remanente (gr/200ml) Glicerina aprovechada (%) 1 0,025 0,0030 88 2 0,05 0,0006 98,8 3 0,10 0,0622 37,8 4 0,20 0,0359 82,05 5 0,40 0,2396 40,1
Muestra 2013-09-0143 SIN GLICER CIC 34250 2013-09-0144 0.025 g de GLICER CIC 34251 2013-09-0145 0.05 g de GLICER CIC 34252 2013-09-0146 0.1 g de GLICER CIC 34253 2013-09-0147 0.2 g de GLICER CIC 34254 2013-09-0148 0.4 g de GLICER CIC 34255 Mono, di y trigliceridos Ácidos grasos metil ésteres % P/P extracto seco TOTAL 0,19 3,32 ND 3.70 ND 5.65 <LC 6.34 ND 3.14 ND 6.65 Límite de cuantificación (LC): Límite de detección (LD): 0.009% para glicerina libre, 0.009% para mono di y triglicéridos y 0.006% para FAME 0.003% para glicerina libre, 0.003% para mono di y triglicéridos y 0.002% para FAME
Perfil ácidos grasos Ensayo sin glicerina Ácido graso % area Palmitato de metilo 31.1 Palmitoleato de metilo 4.3 Hexadecadienoato de metilo 3.6 Hexadecatrienoato de metilo 5.0 Stearato de metilo 11.1 Oleato de metilo C18:1n-10 24.4 Oleato de metiloc18:1n-9 12.5 Linoleato de metilo 8.0
Perfil ácidos grasos Ensayo con 0.025 g de glicerina/200ml Ácido graso % area Palmitato de metilo 25.6 Palmitoleato de metilo 10.7 Hexadecadienoato de metilo 2.6 Heptadecanoato de metilo 2.6 Heptadecadienoato de metilo 7.1 No identificado posible C18 5.3 Estearato de metilo 3.7 Oleato de metilo C18:1n-10 16.4 Oleato de metiloc18:1n-9 4.1 Linoleato de metilo 11.8 Linolenato de metilo 6.1
Perfil ácidos grasos Ensayo con 0.05 g de glicerina/200ml Ácido graso % area Palmitato de metilo 27.7 Palmitoleato de metilo 1.2 Hexadecadienoato de metilo 1.1 Heptadecanoato de metilo 0.9 No identificado posible C18 4.4 Stearato de metilo 8.7 Oleato de metilo C18:1n-10 21.4 Oleato de metiloc18:1n-9 9.5 Linoleato de metilo 17.2 Linolenato de metilo 8.0
Perfil ácidos grasos Ensayo con 0,1 g de glicerina/200ml Ácido graso % area Miristato de metilo 2.9 Palmitato de metilo 21.5 Palmitoleato de metilo 7.4 Hexadecadienoato de metilo 3.7 Heptadecanoato de metilo 5.0 Heptadecadienoato de metilo 8.0 No identificado posible C18 4.2 Stearato de metilo 14.0 Oleato de metilo C18:1n-10 14.5 Oleato de metiloc18:1n-9 5.0 Linoleato de metilo 8.6 Linolenato de metilo 5.0
Perfil ácidos grasos Ensayo con 0,2 g de glicerina/200ml Ácido graso % area Miristato de metilo 3.5 Palmitato de metilo 22.6 Palmitoleato de metilo 3.2 Hexadecadienoato de metilo 1.4 Heptadecanoato de metilo 1.9 Heptadecadienoato de metilo 4.3 No identificado posible C18 8.1 Stearato de metilo 8.9 Oleato de metilo C18:1n-10 19.5 Oleato de metiloc18:1n-9 7.3 Linoleato de metilo 10.5 9,12,15 Linolenato de metilo 2.6 3,9,12 Linolenato de metilo 6.4
Perfil ácidos grasos Ensayo con 0,4 g de glicerina/200ml Ácido graso % area Miristato de metilo 8.3 Palmitato de metilo 28.4 Palmitoleato de metilo 6.4 Hexadecadienoato de metilo 1.9 Heptadecanoato de metilo 1.8 Heptadecadienoato de metilo 3.8 No identificado posible C18 2.8 Hexadecatrienoato de metilo 1.1 Estearato de metilo 6.1 Oleato de metilo C18:1n-10 17.5 Oleato de metiloc18:1n-9 3.9 Linoleato de metilo 12.0 9,12,15 Linolenato de metilo 5.9