Ácidos nucleicos. «La doble hélice es una estructura elegante, pero su mensaje es absolutamente

Transcripción

1 5 Ácidos nucleicos 1. Ácidos nucleicos. 2. Ácido desoxirribonucleico (ADN). 3. Otros niveles de complejidad del ADN. 4. Ácido ribonucleico (ARN). 5. Funciones biológicas de los ácidos nucleicos. «La doble hélice es una estructura elegante, pero su mensaje es absolutamente prosaico: la vida es sencillamente una cuestión de química. Crick y yo comprendimos rápidamente el significado intelectual de nuestro descubrimiento, pero en modo alguno podíamos haber previsto el impacto explosivo de la doble hélice en la ciencia y la sociedad. Las encantadoras curvas de la molécula contenían la clave de la biología molecular, una nueva ciencia que en el curso de estos últimos cincuenta años ha progresado de un modo sorprendente El ADN ya no es solo un asunto que interese a los científicos de bata blanca en oscuros laboratorios universitarios; nos afecta a todos». JAMES D. WATSON. ADN: el secreto de la vida. Ed. Taurus. 103

2 1. Ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos son moléculas fibrilares gigantes, no ramificadas, que de - sempeñan funciones biológicas de trascendental importancia en todos los seres vivos. Contienen información genética, es decir, la información codificada que permite a los organismos desarrollar sus ciclos biológicos, desde su nacimiento a su muerte, y no solamente cuentan con el mensaje genético (los genes), sino también con las instrucciones precisas para su lectura, como veremos en las unidades 12 y 13. Los ácidos nucleicos son biopolímeros formados por otras subunidades estructurales más pequeñas o monómeros, denominadas nucleótidos. Pentosa Grupo fosfato ß-D-Ribosa (Ri) ß-D-Desoxirribosa (dri) Bases púricas Adenina (A) Guanina (G) Bases Pirimidínicas Timina (T) Citosina (C) Uracilo (U) Los nucleótidos, a diferencia de los aminoácidos, que constituyen cada uno una molécula sencilla, son ya ellos mismos moléculas complejas que resultan de la combinación de tres componentes:» Una molécula de ácido fosfórico (en forma de gru po fosfato).» Un azúcar (pentosa). Se encuentra en la forma cíclica y puede ser: La -D-ribosa (en los ribonucleótidos componentes de los ácidos ribonucleicos o ARN). La -D-desoxirribosa (en los desoxirribonucleótidos que constituyen las moléculas de los ácidos desoxirribonucleicos o ADN).» Una base nitrogenada (se denomina base porque su presencia aumenta el ph en una disolución). Tiene una estructura en forma de anillo que contiene átomos de carbono y de nitrógeno. Las bases nitrogenadas pueden ser de dos tipos: Púricas (derivadas de la purina), presentan una estructura formada por un doble anillo: son la adenina (A) y la guanina (G). Pirimidínicas (derivadas de la pirimidina), presentan una estructura con un solo anillo: son la citosina (C), la timina (T) y el uracilo (U). 1.1 Nucleósidos Se domina nucleósido a la molécula que resulta de la unión entre la pentosa (ribosa o desoxirribosa) y una base nitrogenada (púrica o pirimidínica). Enlace N-glucosídico Ribonucleósido de adenina, que se de nomina adenosina. De las cinco bases, solo intervienen cuatro de ellas en los dos tipos de nucleósidos:» Los ribonucleósidos contienen A, G, C y U unidas a la ribosa.» Los desoxirribonucleósidos contienen A, G, C y T unidas a la desoxirribosa. El enlace entre la pentosa y la base nitrogenada es de tipo N glucosídico y se establece, con pérdida de una molécula de agua, entre el OH hemiacetálico del C 1 de la pentosa (ribosa o desoxirribosa) y el hidrógeno del N 1, si se trata de una base pirimidínica, o del N 9, si es una base púrica (para evitar confusiones, los átomos de la base nitrogenada se numeran con la serie 1, 2, 3, 4..., mientras que los átomos de la pentosa lo hacen con la serie 1, 2, 3, 4,5 ). 104 I. La base molecular de la vida

3 1.2 Nucleótidos Se denomina nucleótido a la molécula que resulta de la unión mediante un enlace éster de una molécula de ácido fosfórico (en forma de grupo fosfato) con el OH de carbono 5 de la pentosa de un nucleósido, de manera que el nucleótido es el nucleósido fosforilado en posición 5. Enlace éster Enlace N-glucosídico Tipos de nucleótidos y funciones que desempeñan Algunos nucleótidos se presentan libres en la naturaleza y forman parte de otras moléculas que no son ácidos nucleicos, como por ejemplo, moléculas portadoras de energía, moléculas señalizadoras o coenzimas; otros se encuentran polimerizados y forman ácidos nucleicos. En todos los casos, el grupo fosfato de los nucleótidos-5 -monofosfato puede unirse a otros grupos y dar lugar a las siguientes combinaciones de gran interés biológico:» Forma enlaces «ricos en energía» con otros grupos fosfato para dar lugar a los nucleótidos difosfato y trifosfato, como el ADP y el ATP, capaces de transportar la energía almacenada en sus enlaces, que son fácilmente hidrolizables (ver página 187).» Establece un segundo enlace éster con el OH en posición 3, lo que origina un puente intramolecular y da lugar al AMP cíclico (AMPc), que es una molécula señalizadora que actúa de segundo mensajero entre las moléculas extracelulares portadoras de información (neurotransmisores, hormonas, prostaglandinas, etc.) y el interior de la célula (ver página 279).» Si se une al grupo fosfato de otro mononucleótido o de otra sustancia, da lugar a los nucleótidos no nucleicos que actúan de coenzimas. Por ejemplo, la coenzima A, el FAD (flavín adenín dinucleótido) y el NAD + (nicotín adenín dinucleótido) (ver página 185).» Por último, forma otro enlace éster con el OH en posición 3 de otro nucleó - tido; que a su vez puede incorporar otro nucleótido, y así sucesivamente hasta originar cadenas de polinucleótidos constitutivas de los ácidos nucleicos. Son estas formaciones las que se van a considerar a continuación con más detenimiento. Grupo fosfato Ribonucleótido de adenina que se denomina adenosina-5 -monofosfato (AMP). Enlaces éster «ricos» en energía ATP: adenosina-5 -trifosfato. Puente intramolecular AMP cíclico (AMPc). Bases Ribonucleósidos Nomenclatura y clases de nucleósidos y de nucleótidos Ribonucleótidos (constituyentes del ARN) Desoxirribonucleósidos Desoxirribonucleótidos (constituyentes del ADN) Adenina (A) Adenosina Adenosina-5 -monofosfato Desoxiadenosina Desoxiadenosina-5 -monofosfato (AMP) (damp) Guanina (G) Guanosina Guanosina-5 -monofosfato Desoxiguanosina Desoxiguanosina-5 -monofosfato (GMP) (dgmp) Citosina (C) Citidina Citidina-5 -monofosfato Desoxicitidina Desoxicitidina-5 -monofosfato (CMP) (dcmp) Uracilo (U) Uridina Uridina-5 -monofosfato (UMP) Timina (T) Desoxitimidina Desoxitimidina-5 -monofosfato (dtmp) 1. Indica si son verdaderas o falsas las siguientes frases: a) El ARN posee ribonucleótidos de timina. b) Todos los nucleótidos son componentes de los ácidos nucleicos. c) La adenosina es un ribonucleósido de adenina. 5. Ácidos nucleicos 105

4 2. Ácido desoxirribonucleico (ADN) Las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) son biopolímeros lineales formados por la polimerización de desoxirribonucleótidos-5 -monofosfato de adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). En el medio acuoso celular, los largos filamentos de ADN adoptan igual que las proteínas una estructura tridimensional o, lo que es lo mismo, una conformación espacial. Pero no es tan compleja como la desarrollada por las proteínas, ya que no llega a formar estructuras terciarias y cuaternarias que sean comparables, y tan solo manifiesta estructura primaria y secundaria. Aunque, como veremos más adelante, cuando el ADN se asocia a determinadas proteínas para su empaquetamiento puede alcanzar niveles de gran complejidad estructural. Esqueleto de polidesoxirribosa fosfato Adenina 2.1 Estructura primaria del ADN La estructura pri maria del ADN consiste en la formación de largas cadenas de polinucleótidos por unión de desoxirribonucleótidos 5 monofosfato. Extremo 5 Puente fosfodiéster Citosina Timina En el ADN se encadenan los nucleótidos mediante enlaces éster: el grupo fosfato que se encuentra en posición 5 de un nucleótido esterifica al grupo OH situado en posición 3 del nucleótido siguiente; de esta forma se va alargando la cadena por el encadenamiento de nucleótidos en las posiciones , donde cada molécula del grupo fosfato forma un puente fosfodiéster entre dos moléculas de desoxirribosa. En un polinucleótido se pueden diferenciar dos partes: El esqueleto de polidesoxirribosa-fosfato (... dri-p dri-p dri-p...), que es común para todas las clases de ADN. En cada cadena aparece un extremo 5, que posee un grupo fosfato libre unido al carbono 5 del nucleótido, y un extremo 3, que posee el OH (alcohol) en posición 3 del nucleótido también libre. Las diferentes bases, A, G, C y T, alineadas a lo largo de este esqueleto, que constituyen el elemento característico y diferenciador entre las distintas clases de ADN. Aparece aquí, al igual que en las proteínas, la noción de secuencia. Se nombran indicando los extremos y la secuencia de bases, como por ejemplo: 5...ATTACGCGGCCTCGGCTTTAAA... 3 Guanina Cada molécula de ADN se caracteriza por la composición o porcentaje de cada una de sus bases y por la secuencia, es decir, el orden de distribución de los cuatro tipos de bases (A, G, C, T) a lo largo del esqueleto de polidesoxirribosa fosfato y es en la naturaleza misma de esta secuencia donde reside la información necesaria para la síntesis de las proteínas. 2.2 Estructura secundaria del ADN Extremo 3 Estructura primaria del ADN. En cada polidesoxirribonucleótido se diferencia el esqueleto de polidesoxirribosa fosfato y las distintas bases alineadas en este esqueleto y dispuestas según una secuencia característica. La estructura secundaria del ADN es una doble hélice formada por dos cadenas de polinucleótidos enfrentadas por sus bases y unidas entre sí mediante puentes de hidrógeno. La estructura resultante se asemeja a una escalera de mano, cuyos pasamanos corresponden a los esqueletos de polidesoxirribosa fosfato y los peldaños son los pares de bases enfrentadas entre sí. En realidad, el conjunto se pliega sobre sí mismo obligado por los puentes de hidrógeno establecidos entre diferentes regiones de la molécula, hasta adoptar la conformación más estable, que es la doble hélice. 106 I. La base molecular de la vida

5 Modelo de doble hélice ADN-B A El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma de doble hélice dextrógira (ADN-B), propuesto por Watson y Crick, pone de manifiesto que la estructura de la molécula de ADN presenta las siguientes características:» Las cadenas polinucleotídicas son antiparalelas, es decir, una se encuentra en dirección opuesta a la otra: si una presenta la dirección 5 3, la otra posee la dirección 3 5. Esto es así con el fin de que ambas cadenas queden enfrentadas por sus bases y puedan unirse mediante puentes de hidrógeno.» Las secuencias de bases son complementarias, pues existe una correspondencia entre las bases de ambas cadenas, de tal forma que la adenina solo puede estar frente a la timina (y viceversa) y la guanina frente a la citosina (y viceversa). La correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de ADN posean secuencias complementarias. Las bases púricas, que son más grandes, se encuentran enfrentadas a las bases pirimidínicas, más pequeñas, y la unión se realiza por puentes de hidrógeno entre los grupos polares de las bases: dos puentes de hidrógeno en los pares A = T y tres en los pares G C. Por tanto, el enlace G C es más fuerte que el A = T; de ahí que la cadena de ADN que posea mayor número de pares G C será más estable al efecto de la temperatura y más resistente a la desnaturalización (ver página siguiente). B» El enrollamiento entre las dos hebras de la doble hélice es dextrógiro y de tipo plectonémico, como si estuvieran trenzadas. En este modelo de doble hélice ADN-B los pares de bases están casi horizontales (inclinación cero) y el eje los atraviesa prácticamente por su centro. C Eje central Estructura secundaria del ADN: A) Disposición antiparalela de las dos cadenas de ADN en la estructura secundaria. B) Apareamiento entre bases complementarias mediante puentes de hidrógeno: las bases púricas A, G se aparean con las pirimidínicas, T, C, respectivamente. C) Plegamiento plectonémico de la doble hélice del ADN en el modelo de Watson y Crick, también llamado forma B: los pares de bases están casi horizontales y el eje los atraviesa prácticamente por su centro. Esqueletos de polidesoxirribosafosfato 1. Qué características definen la estructura primaria del ADN? 2. Una cadena de ADN tiene la secuencia y orientación siguientes: 5...AGGCTGCTTAATTGCCGTA...3. Escribe la secuencia y orientación de su cadena complementaria. 3. Indicar cuál de estas secuencias es incorrecta para un ADN. a)... A T T C G G T C C A T C G... b)... G C T A A A C G T A A A C G A T T T G C A T T T... c)... A G G T C U T T C G G A A T C C A G A A A G C C T T... Pares de bases horizontales 5. Ácidos nucleicos 107

6 Desnaturalización Doble hélice de ADN Calentamiento ADN parcialmente desnaturalizado Calentamiento Enfriamiento Enfriamiento ADN desnaturalizado Renaturalización Desnaturalización y renaturalización del ADN. 2.3 Desnaturalización del ADN La desnaturalización del ADN se produce cuando el incremento de temperatura, la variación del ph o de las condiciones iónicas del medio rompen los puentes de hidrógeno entre las bases y se separan las dos cadenas del ADN sin que se vean afectados los enlaces covalentes fosfodiéster de los esqueletos de polidesoxirribosa-fosfato. La desnaturalización del ADN provocada por el incremento de la temperatura se denomina fusión. Cuando la temperatura alcanza determinado valor, llamado punto de fusión del ADN (T m, del inglés melting temperature), la agitación térmica es capaz de separar las dos hebras: el punto de fusión es la temperatura a la cual se encuentran desnaturalizadas la mitad de las moléculas de ADN. La desnaturalización del ADN es un proceso reversible, ya que una disolución de ADN calentado ligeramente por encima de su punto de fusión y desnaturalizado, cuando se enfría y se mantiene en esta temperatura durante el tiempo suficiente, es capaz de recuperar su forma inicial de doble hélice (renaturalización). La única condición para que dos cadenas recuperen la estructura de doble hélice es que sean complementarias o, al menos, que posean tramos con secuencias complementarias suficientemente largos. Variaciones bruscas de ph también provocan desnaturalización del ADN, que se renaturaliza cuando los valores de ph se sitúan dentro de los parámetros biológicos. La reversibilidad de la desnaturalización ha dado lugar en los últimos años a una importante aplicación conocida como hibridación, que constituye una de las técnicas fundamentales en la tecnología de ADN recombinante (como la reacción de la polimerasa en cadena o PCR), fundamento de la ingeniería genética o biotecnología (ver unidad 15). OBSERVA La hibridación del ADN Las hebras de ADN desnaturalizadas, pertenecientes a individuos diferentes (de la misma o de distinta especie) pueden renaturalizarse y formar dúplex híbridos al aparear secuencias complementarias. ADN 1 desnaturalizado Enfriamiento Doble hélice híbrida ADN 2 desnaturalizado Doble hélice de ADN 1 Doble hélice de ADN 2 La hibridación de hélices bicatenarias no naturales de ADN-ADN y ADN-ARN, entre otras aplicaciones, permite reconocer el grado de relación genética o parentesco entre dos ADN y aplicarlo al estudio de las relaciones filogenéticas entre las especies; también se ha revelado de gran interés en biotecnología para la elaboración de sondas, que son fragmentos de ADN monocatenarios, de secuencia conocida, que permiten la detección de fragmentos de ADN que son complementarios. El contenido o porcentaje GC (guanina y citosina) es una característica del genoma de un organismo o de cualquier fragmento de ADN o ARN y se utiliza a veces para clasificar organismos en taxonomía. En la siguiente gráfica se representa la relación existente entre la variación del punto de fusión del ADN y el contenido GC de distintos genomas: 1) Staphylococcus aureus; 2) Timo de becerro; 3) Escherichia coli; 4) Brucella abortus; 5) Streptomyces griseus. A qué crees que se debe el incremento del punto de fusión del ADN conforme aumenta su porcentaje de GC? Por qué el contenido GC tiende a ser mayor en las arqueobacterias hipertermófilas que soportan temperaturas de casi 100 ºC? RAZONA T m ( C) % G+C I. La base molecular de la vida

7 CONTEXTO HISTÓRICO Y SOCIAL El descubrimiento de la doble hélice del ADN En 1869, el químico J. F. Miescher descubrió que en el núcleo celular existía una sustancia que denominó nucleína, a la que más tarde se dio el nombre de ácido desoxirribonucleico. La existencia de un alto grado de complejidad en el ADN se puso de manifiesto en la década de los años cincuenta del pasado siglo, a partir de la hipótesis de Erwin Chargaff, quien, tras analizar numerosas muestras de ADN procedentes de células de distintas especies animales, demostró que, salvo en muy raras excepciones, todos los ADN poseen igual número de moléculas de timina y adenina, y tantas de citosina como de guanina. Este hecho se puede representar mediante las llamadas reglas de Chargaff: A = T y G = C, o bien, A/T = 1 y G/C = 1; sin embargo, A+T G+C, y es precisamente el valor de la relación A+T/G+C lo que distingue los ADN de especies diferentes, siendo los valores tanto más parecidos cuanto más emparentadas filogenéticamente estén las especies entre sí. Por aquellos años, Linus Pauling era científico del Caltech, en EE.UU, y gozaba de excelente reputación entre sus colegas, pues a él se debía el modelo de hélice- propuesto para la estructura secundaria de las proteínas. Pero no gozaba de tan buena reputación entre determinados miembros de su gobierno, ya que su ideología pacifista a principios de los años 50 del pasado siglo cuando la «caza de brujas» se encontraba en pleno auge fue considerada subversiva y se le negó el pasaporte para acudir a Inglaterra, donde se celebraban reuniones sobre las últimas investigaciones llevadas a cabo por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins, científicos ingleses del King s College, sobre difracción por rayos X. Estas indicaban que la molécula de ADN era fibrosa y presentaba una estructura helicoidal. La misoginia reinante en los ambientes académicos a lo largo de la historia ha dificultado la actividad científica de muchas mujeres como Rosalind Franklin (por ser mujer se le negaba el acceso al club de la cafetería, organizado solo para los profesores varones). Ignorada e infravalorada, mantenía una difícil relación personal y profesional con su jefe, M. Wilkins. Pero era una excelente experimentadora y había demostrado su habilidad para obtener las mejores imágenes del ADN mediante difracción por rayos X. Wilkins mostró sin su permiso la imagen de difracción de rayos X del ADN (conocida hoy como la famosa fotografía 51) a dos jóvenes científicos, James Watson y Francis Crick. Con esta información en su poder y sin llevar a cabo ninguna experimentación formal, al cabo de un mes lograron armar un modelo teórico para la estructura del ADN: el modelo de la doble hélice del ADN, que fue publicado en 1953 en la revista Nature, en un artículo de no más de dos páginas. En aquella época se consideró una propuesta revolucionaria y marcó el inicio del espectacular avance registrado en la biología molecular en las décadas posteriores. Tal vez, como más tarde comentó Watson, si Pauling hubiera podido viajar hasta Inglaterra y hubiera podido ver las fotografías de difracción por rayos X, «a más tardar en una semana, Linus tendría la estructura». Pauling, demostrando gran categoría, felicitó a los dos jóvenes investigadores por su ingeniosa solución del enigma de la doble hélice del ADN. El modelo de la doble hélice del ADN propuesto por Watson y Crick en 1953 explicaba satisfactoriamente los resultados de los experimentos de Chargaff, Franklin y Wilkins, al tiempo que demostraban la estructura que adoptaban las fibras de ADN en el espacio. En 1962, Watson, Crick y Wilkins, recibieron el premio Nobel de Fisiología y Medicina. Rosalind Franklin no figuró entre los premiados, pues para entonces, en 1958, a la edad de 38 años, había muerto de cáncer de ovarios, probablemente a causa de las repetidas exposiciones a los rayos X durante sus investigaciones (el premio Nobel no se concede con carácter póstumo y tampoco se comparte entre más de tres personas). Imagen obtenida por difracción de rayos X del ADN, conocida hoy como la fotografía 51. Modelo espacial compacto de la doble hélice del ADN propuesto por Watson y Crick. Con sus bases dirigidas hacia el interior, se asemeja a una estructura rígida destinada a proteger la información genética que contiene. Es un modelo capaz de explicar las dos funciones básicas del material hereditario: obtener réplicas que se transmiten a la descendencia, abriéndose como una cremallera, y almacenar información codificada en un idioma de cuatro letras para la síntesis de proteínas. 5. Ácidos nucleicos 109

8 EVIDENCIA EXPERIMENTAL 1 Micropipeta eppendorf Muestra 1 6 A Muestra 2 B D E D C V Muestra 3 A 3 + Separación de fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa La electroforesis permite separar fragmentos de ADN, ARN o proteínas según su tamaño y carga eléctrica mediante la aplicación de una corriente eléctrica continua. Esta técnica se basa en el principio de la emigración de los iones cuando se someten a un campo eléctrico: los iones positivos tienden a emigrar al cátodo y los negativos, al ánodo. Se puede realizar sobre diversos soportes, pero cuando se utiliza como técnica de separación y análisis de fragmentos de ADN, uno de los soportes que ofrece mejores resultados por su resolución es el gel de agarosa (un heteropolisacárido extraído de las algas rojas). El protocolo experimental es el siguiente:» Los tubos eppendorf (1) contienen los fragmentos de ADN que se desean separar, disueltos en una solución tampón: muestra 1 (fragmentos A y B), muestra 2 (fragmentos C y D) y muestra 3 (fragmentos A, E y D)» Se polimeriza el gel de agarosa: se disuelve el polisacárido en agua fría, luego se calienta y después se deja enfriar. Se utiliza un molde que permite la formación de una especie de muescas o pocillos en su parte superior (2) y a continuación se coloca a modo de lámina entre dos placas de vidrio, con las muescas hacia arriba (3), que se sitúa, a su vez, entre las cubeta superior (4) e inferior (5).» En cada muesca de la parte superior del gel se aplica con una micropipeta eppendorf una muestra diferente (6). A continuación, se añade a cada muestra una pequeña cantidad de glicerol para que adquiera mayor densidad y no se mezcle con la solución tampón de la cubeta superior. También se le añade un colorante de localización, como el azul de bromofenol, que se desplaza más rápidamente que el fragmento de ADN más veloz (7). Cuando este colorante se aproxime al extremo inferior del gel es la señal para detener la electroforesis.» Las cubetas superior e inferior contienen una solución de electrolitos tamponada y en ellas se colocan los electrodos: en la cubeta superior (4), el cátodo ( ) y en la inferior (5), el ánodo (+).» Entre ellas se hace pasar una corriente continua de unos 100 V (8) durante un tiempo suficiente para que se produzca la separación de las diferentes fracciones de ADN de cada muestra, que lo harán en función de su carga neta, y de su tamaño: en conjunto, definen un parámetro que es característico de cada fragmento, denominado movilidad electroforética ( ). Los grupos fosfato del ADN suelen estar desprotonados, por lo que adquieren carga neta negativa y migran hacia el ánodo. 10 Gel de agarosa B A B C E A A D D pb » Al cabo de un tiempo, la mezcla de fragmentos de ADN se ha separado en bandas que se pueden identificar y poner de manifiesto si teñimos la lámina de agarosa con colorantes fluorescentes, como el bromuro de etidio, que hace visibles las bandas bajo la luz ultravioleta (9).» Evidentemente, los fragmentos con más carga negativa se moverán más deprisa hacia el ánodo, pero si son voluminosos verán frenado su movimiento, pues el interior del gel de agarosa forma un retículo que se comporta como una criba molecular; por esta razón, los fragmentos más pequeños (A) avanzan más rápido que los más grandes (B) (10).» La movilidad electroforética ( ) de los distintos fragmentos de ADN, medida en mililímetros recorridos por cada fragmento de ADN en el gel, es proporcional a sus tamaños, medidos en pares de bases (pb) (11). 110 I. La base molecular de la vida

9 3. Otros niveles de complejidad del ADN Tanto en el citoplasma de las células procariotas como en el núcleo de las células eucariotas debe resolverse el mismo problema: cómo almacenar grandes cantidades de ADN en un volumen reducido y, al mismo tiempo, que la información que contiene resulte accesible. 3.1 Empaquetamiento del ADN en procariotas El ADN de las bacterias y, en general, de todos los procariotas y también de las mitocondrias y de los cloroplastos de las células eucariotas es una doble hélice circular (excepto en algunos grupos bacterianos, que es lineal). En un principio se consideró que el cromosoma estaba desnudo, pero actualmente se sabe que está asociado a un pequeño número de proteínas que, junto a ciertas moléculas de ARN, desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de su estructura y en el empaquetamiento en la región del nucleoide. El cromosoma de una bacteria como Escherichia coli cuando está estirado mide casi un milímetro de longitud. Entonces, cómo empaquetar una macromolécula tan larga en el interior de la bacteria, cuyo tamaño oscila entre 0,3 y 10 m? La solución a la que se llega se basa en generar torsiones en la doble hélice circular, que responde a la tensión mediante el superenrollamiento. El superenrollamiento del ADN en el cromosoma bacteriano El cromosoma circular de E. coli está empaquetado en la región del nucleoide (1). Contiene unos 50 dominios de doble hélice de ADN superenrollados que se estabilizan mediante ARN y un conjunto de proteínas a las que se unen, similares a las histonas (2). El superenrollamiento del ADN circular en cada dominio (3) es similar al que se produce en un cable de teléfono retorcido (4). Flagelo Pared celular OBSERVA 1 Ribosomas Citoplasma El cromosoma bacteriano se pliega como una superhélice en forma de ochos y da lugar a una serie de dominios o bucles que le permiten ocupar un espacio mínimo. Dominios de ADN Para conseguir el máximo grado de empaquetamiento deben resolverse complicados problemas topológicos, para lo cual las células disponen de un equipo de topoenzimas que, como la ADN girasa, participan en el empaquetamiento del ADN y en su posterior descondensación durante la transcripción y la replicación. 3.2 Empaquetamiento del ADN en eucariotas: cromatina y cromosomas En este caso el problema consiste en introducir en cada célula (como, por ejemplo, una célula humana) más de un metro de ADN en el interior de un núcleo cuyo diámetro apenas mide 10 m. Evidentemente el empaquetamiento debe ser aún más compacto, y para ello el ADN se asocia con un tipo particular de proteínas, denominadas histonas (el núcleo de los espermatozoides presenta otra clase de proteínas análogas, las protaminas). Proteínas y ARN 2 3 La forma compacta que adquiere el ADN unido a las histonas en el núcleo de las células eucariotas se conoce como cromatina, y aunque aparentemente se asemeja a un conjunto de fibras entremezcladas y apelotonadas, en realidad esconde una estructura muy compleja y ordenada, en la que se distinguen diferentes niveles de organización estructural: nucleosoma y «collar de perlas», fibra cromatínica o de 30 nm, dominios estructurales en forma de bucles radiales, rosetón, espiral de rosetones y, por último, cromosoma. 4 Enrollado Superenrollado 1. Si los fragmentos mayores de ADN tienen más carga negativa, debido a la presencia de los grupos fosfato, por qué se mueven más despacio que los fragmentos más pequeños cuando se desplazan en la electroforesis hacia el ánodo a través de un gel de agarosa? 2. Qué estructura adopta el cromosoma de Escherichia coli? 3. Qué niveles de organización estructural adopta el ADN en el núcleo de las células eucariotas? 5. Ácidos nucleicos 111

10 Doble hélice de ADN: 2 nm de diámetro Empaquetamiento del ADN en el núcleo interfásico: estructura de la cromatina» Nucleosoma y «collar de perlas» Para conseguir el máximo empaquetamiento, la doble hélice de ADN se enrolla periódicamente alrededor de grupos de proteínas del tipo de las histonas para formar estructuras que reciben el nombre de nucleosomas y constituyen la subunidad fundamental de la estructura de la cromatina. Nucleosoma: dos vueltas de ADN bicatenario alrededor del octámero de histonas: 11 nm de diámetro Nivel de empaquetamiento de «collar de perlas» Cada nucleosoma consta de un núcleo compuesto por un octámero de histonas alrededor del cual se enrollan dos vueltas de ADN bicatenario. Los diferentes nucleosomas aparecen unidos por segmentos de ADN bicatenario, lo que confiere a este nivel de empaquetamiento el aspecto de un «collar de perlas», siendo las perlas los nucleosomas y el hilo que las engarza, los segmentos de ADN.» Fibra de 30 nm (300 Å) o fibra cromatínica La fibra de 30 nm (300 Å) o fibra cromatínica es una estructura que representa un nivel de plegamiento aún más complejo, caracterizado por el enrollamiento del «collar de perlas» sobre sí mismo hasta adoptar la forma de solenoides (aproximadamente seis nucleosomas por vuelta de solenoide). En estas estructuras los segmentos de ADN internucleosómicos interaccionan con moléculas de histonas H1 dispuestas en el núcleo de los solenoides, y el resultado de este enrollamiento solenoidal es la formación de una fibra de cromatina cuyo diámetro observado con el microscopio electrónico es de 30 nanometros (300 ángstrom) (ver página 221). Nivel de empaquetamiento de solenoide en la fibra cromatínica: 30 nm de diámetro La fibra cromatínica es el nivel de empaquetamiento que presenta el ADN cuando se encuentra en estado de cromatina, es decir, cuando se encuentra empaquetado en el interior del núcleo en interfase. Es en este estado cuando la célula está activa y sus genes resultan localizables y accesibles por el aparato enzimático encargado de la transcripción y de la replicación, como veremos en las unidades 12, 13 y 14. Octámero de histonas Histona H1 Núcleo interfásico Núcleo mitótico Cromatina Envoltura nuclear ADN Nivel de empaquetamiento de bucles o lazos radiales Sección transversal de un solenoide: disposición del «collar de perlas» alrededor de las histonas H1 112 I. La base molecular de la vida

11 Empaquetamiento del ADN en el núcleo mitótico: estructura del cromosoma Cuando la célula entra en mitosis (o en meiosis), el ADN se acaba de replicar y la cromatina se organiza y se empaqueta aún más, en forma de enrollamientos de enrollamientos de enrollamientos... (ver página 222). La fibra de 30 nm se pliega en forma de grandes bucles o lazos radiales, y estos se compactan extraordinariamente y se enrollan para formar sucesivamente rosetones de bucles, espirales de rosetones y, por fin, las cromátidas de cada cromosoma. Con esto se logra un grado de compactación unas veces mayor que la fibra de ADN desnudo. Los bucles radiales, al parecer, constituyen regiones estables relacionadas con la transcripción, ya que ciertas zonas de estos bucles se descondensan y se convierten en zonas activas para la transcripción al final de la interfase y al comienzo de la mitosis o de la meiosis; pero, más tarde, pueden volver a condensarse de nuevo, sus genes quedan inaccesibles y ya no se pueden transcribir (ver unidad 12). Célula en metafase. El empaquetamiento del ADN en las células eucariotas se encuentra en estado de cromosoma en células en mitosis o meiosis. Cromosoma metafásico formado por dos cromátidas: nm de diámetro El ADN no siempre se presenta de la misma forma en todos los organismos; en general pueden distinguirse cuatro clases de ADN:» Lineal unicatenario, se encuentra en algunos virus, como el bacteriófago MS2.» Lineal bicatenario, se presenta en algunos virus bacteriófagos (T2, T4, etc.) y en el núcleo de las células eucariotas (asociado a cierto tipo de proteínas). También constituye el cromosoma de algunas bacterias, como Borrelia burgdorferi, causante de la enfermedad de Lyme.» Circular unicatenario, propio de ciertos virus, como el -X- 174 (1). 1 LO SABÍAS? nm Espiral de rosetones: 700 nm de diámetro. Constituye el nivel de empaquetamiento de cada una de las dos cromátidas del cromosoma» Circular bicatenario, constituye el cromosoma desnudo (1) y los plámidos (2) de la mayoría de las bacterias; también aparece en ciertos virus (SV40) y en las mitocondrias y cloroplastos de las células eucariotas. Nivel de empaquetamiento de rosetones de bucles: 300 nm de diámetro 1 Plásmido 2 1. Ordena del más sencillo al más complejo los siguientes niveles de empaquetamiento del ADN en células eucariotas: cromosoma, «collar de perlas», nucleosoma, rosetones de bucles, fibra cromatínica o de 30 nm, bucles o lazos radiales y espirales de rosetones. 2. Qué diferente grado de empaquetamiento alcanza el ADN en el núcleo interfásico y en el núcleo mitótico de una célula eucariota? 5. Ácidos nucleicos 113

12 Esqueleto de polirribosa-fosfato Adenina 4. Ácido ribonucleico (ARN) Las moléculas de ARN son también biopolímeros y están formadas por el encadenamiento de ribonucleótidos-5 -monofosfato. Extremo 5 Puente de fosfodiéster Extremo 3 Uracilo Citosina Guanina Estructura primaria del ARN. Esqueleto de polirribosa-fosfato y secuencia de bases. Ultracentrífuga Densidad = 1,65 = 1,80 Proteína ADN ARN ARN ADN Proteína La centrifugación analítica en gradiente de densidad de cloruro de cesio permite separar diferentes componentes moleculares en función de su coeficiente de sedimentación expresado en unidades Svedberg. La estructura primaria en todos los tipos de ARN es similar a la del ADN y está constituida por las uniones fosfodiéster 5 3 de los ribonucleótidos. Queda definida, igual que la estructura primaria del ADN, por la naturaleza y la secuencia de bases de sus nucleótidos. Las características químicas que diferencian el ARN del ADN son las siguientes:» Los nucleótidos del ARN poseen ribosa, mientras que los del ADN contienen desoxirribosa. Esta característica permite que los grupos OH en posición 2 de los ribonucleótidos queden libres cuando se encadenan para dar moléculas de ARN, lo que origina en la estructura primaria tensiones que hacen que el ARN sea químicamente menos estable que el ADN. Por esta causa el ARN en disolución acuosa se hidroliza con mayor facilidad, y tal vez por ello la información genética se encuentra almacenada en el ADN, que es una molécula más estable y mejor adaptada para guardar información durante largos períodos de tiempo (aunque parece ser que en el comienzo de la vida fueron las moléculas de ARN las encargadas de conservar la información genética).» Otra de las diferencias reside en la naturaleza de las bases nitrogenadas, pues si bien tres de ellas, adenina, guanina y citosina, se encuentran en ambos ácidos nucleicos, en el ARN en lugar de timina existe uracilo (al igual que la timina, su base complementaria también es la adenina). Además, en ciertas clases de ARN, particularmente en el ARN de transferencia (ARNt), se encuentran, aunque en menor proporción, otros componentes nitrogenados; entre los más característicos están el pseudouracilo ( ), la dimetilguanina (GdiMe), la hipoxantina (Hi), la metilhipoxantina (HiMe), el dihidrouracilo (UH 2 ), la ribotimidina (T), etc.» Una última característica diferencial consiste en que las moléculas de ARN suelen tener únicamente estructura primaria, aunque en algunos casos existen ciertas regiones en una misma cadena que poseen secuencias complementarias capaces de aparearse y formar estructuras secundarias (doble hélice) y terciarias. Solo se ha descrito una estructura en doble hélice de ARN bicatenario en un tipo de virus denominado reovirus (clase III). Existen determinados ARN que constituyen el genoma de ciertos virus. Otros ARN manifiestan actividad catalítica, es decir, se comportan como enzimas y se denominan ribozimas: intervienen en determinados procesos relacionados con la maduración de las cadenas del ARN y en la catálisis del enlace peptídico en el ribosoma (ver página 298). Recientemente se ha descubierto que diversos tipos de pequeñas moléculas de ARN interferente (ARNi), de una longitud entre nucleótidos, están implicadas en el control de una amplia variedad de procesos del desarrollo y la diferenciación celular. El papel que desempeñan estos ARNi es cada vez más importante, ya que realizan diversas tareas relacionadas con el control de la expresión génica en la célula: en la mayoría de los casos inducen el corte y la posterior degradación de los ARNm, o bien inhiben la traducción de dichos ARNm. Estos ARNi también actúan en la degradación de ARN procedentes de virus y, por tanto, en la defensa antiviral (ver página 281). Como criterio de clasificación de los ARN se adopta la masa molecular media de sus cadenas, cuyo valor se deduce del coeficiente de sedimentación (está en función de la velocidad con que sedimentan las moléculas sometidas a un campo centrífugo). El coeficiente de sedimentación, que es una medida cualitativa de su masa molecular y de las dimensiones de la molécula, se expresa en unidades Svedberg (S), nombre del científico sueco que puso a punto las técnicas de centrifugación analítica. 114 I. La base molecular de la vida

13 4.1 ARN mensajero (ARNm) Las moléculas de ARNm son largas cadenas de polinucleótidos de tamaño variable que solo presentan estructura primaria, por lo que tienen aspecto filamentoso. El nombre de «mensajero» hace referencia a la función que desempeña, ya que cada ARNm contiene la información necesaria para la síntesis de una proteína determinada. 1 2 Exones Existe una correspondencia lineal entre la secuencia de bases del ARNm y la secuencia de aminoácidos de la proteína que se forma (ver página 292). Las moléculas de ARNm presentan características diferentes en procariotas y en eucariotas:» En los procariotas, como, por ejemplo, las bacterias, los ARNm poseen en el extremo 5 un grupo trifosfato.» En los eucariotas, por su parte, la mayoría de los ARNm poseen en el extremo 5 una especie de «caperuza» compuesta por un residuo de metil-guanosina unida al grupo trifosfato, y en el extremo 3 presentan una «cola» formada por un fragmento de unos 150 a 200 nucleótidos de adenina denominada «cola» de poli A. Además, estos ARNm de eucariotas contienen secuencias de bases que codifican para la síntesis de proteínas (exones) intercaladas con otras secuencias que no contienen información para la síntesis proteica (intrones); es decir, la información genética aparece fragmentada, por lo que requieren un proceso de maduración antes de convertirse en ARNm funcionales (ver página 276). Una característica peculiar de los ARNm es su corta vida, pues pueden transcurrir tan solo unos pocos minutos desde el momento de su síntesis hasta que son degradados. 4.2 ARN nucleolar (ARNn) Intrones Cola de poli A ARN mensajeros (ARNm) de procariotas (bacterias) (1) y de eucariotas (2). El ARNn es un ARN de elevado peso molecular (45 S), con estructura secundaria y terciaria en algunas regiones de la molécula, que se sintetiza en el nucleolo de las células eucariotas y, en realidad, no es más que el precursor de diferentes tipos de ARN ribosómico (ARNr). En efecto, la larga cadena de ARN nucleolar 45 S se rompe en lugares específicos y da lugar a diferentes fragmentos de ARNr de las subunidades grande y pequeña del ribosoma. 4.3 ARN ribosómico (ARNr) Los ARNr son moléculas de diferentes tamaños, con estructuras secundaria y terciaria en algunas regiones de la molécula, que participan en la formación de las subunidades ribosómicas al unirse a más de setenta proteínas. En los organismos procariotas existen tres tipos de ARNr, 23 S, 16 S y 5 S; mientras que en los organismos eucariotas hay cuatro tipos de ARNr: 28 S, 18 S, 5,8 S y 5 S (ver página 156). Los distintos tipos de ARNr contribuyen a que las subunidades grande y pequeña de los ribosomas posean una estructura acanalada, con hendiduras o sitios capaces de albergar simultáneamente a una molécula de ARNm (la subunidad pequeña) y a los diferentes aminoácidos unidos a los ARNt que participaran en la síntesis de una cadena polipeptídica (la subunidad grande). Además, el ARNr 23 S en procariotas y el ARN 28 S en eucariotas tienen actividad de ribozimas y actúan como agentes catalíticos en la formación del enlace peptídico durante la síntesis de las proteínas. Estructura secundaria del ARNr 16S de E. coli. 1. En qué se diferencia el ADN del ARN? 2. Qué son las ribozimas? 3. Qué son las unidades Svedberg y para qué se utilizan? 5. Ácidos nucleicos 115

14 En la estructura secundaria de los ARNt se distinguen las siguientes características:» Brazo aceptor formado por el extremo 5 y el extremo 3', que en todos los ARNt posee la secuencia CCA, cuyo grupo OH terminal sirve de lugar de unión con el aminoácido.» El bucle (o brazo) T ψ C, que actúa como lugar de reconocimiento del ribosoma.» El bucle (o brazo) D, cuya secuencia es reconocida de manera específica por una de las veinte enzimas, llamadas aminoacil-arnt sintetasas, encargadas de unir cada aminoácido con su correspondiente molécula de ARNt.» El bucle situado en el extremo del brazo largo del bumerán, que contiene una secuencia de tres bases llamada anticodón. Cada ARNt «cargado» con su correspondiente aminoácido se une, mediante la región del anticodón, con tripletes de bases del ARNm (tres bases del ARNm definen un triplete o codón) en el proceso de la traducción de la información genética que conduce a la síntesis de las proteínas, como veremos en la unidad ARN de transferencia (ARNt) Los ARNt son moléculas pequeñas (entre 80 y 100 nucleótidos), con estructuras secundaria y terciaria, encargadas del transporte de los aminoácidos hasta los ribosomas durante la síntesis de las proteínas. Cada ARNt presenta estructura secundaria en algunas regiones de su molécula que contienen secuencias de bases complementarias y permiten el apareamiento y la consiguiente formación de una doble hélice; las zonas que no se aparean adoptan el aspecto de bucles, como una hoja de trébol. Aunque, en realidad, el plegamiento es mucho más complejo y ofrece una imagen tortuosa y retorcida, que en nada se parece a una hoja de trébol, al adoptar la estructura terciaria que tiene forma de L, como un bumerán. Otra característica de los ARNt es la de contener aproximadamente un 10 por 100 de bases procedentes de modificaciones en las cuatro bases normales (A, G, C y U), como el pseudouracilo y otras ya mencionadas anteriormente. Brazo aceptor Bucle (o brazo) D Sitio de unión del aminoácido Bucle D Bucle (o brazo) T C Bucle T C Anticodón Brazo aceptor Sitio de unión del aminoácido Anticodón 5. Funciones biológicas de los ácidos nucleicos 1. Qué tipos de bases peculiares presentan los ARNt que no existen en otros ARN? 2. Dónde se localizan el brazo aceptor y el anticodón en los ARNt y qué funciones desempeñan? 3. Qué funciones biológicas desempeñan los ácidos nucleicos? La estructura en doble hélice del ADN refleja su función. El ácido desoxirribonucleico es una macromolécula que desempeña dos funciones de trascendental importancia para todos los seres vivos: se replica y guarda la información genética.» La doble hélice del ADN se replica. Para ello, en primer lugar, se libera de las histonas y luego se abre, como si fuera una cremallera, de manera que cada una de las dos hebras del ADN sirve de molde para que se sintetice su cadena complementaria (el codigo de complementariedad es A = T y G C). Así, cada molécula de ADN puede originar dos réplicas idénticas de sí misma, con la misma composición y secuencia de bases que la molécula original, que se repartirán una a cada célula hija. Gracias a esta propiedad, cada célula, antes de dividirse, hace una copia de sus genes con el fin de que cada célula hija contenga la misma dotación genética que la célula madre; de esta manera, la información genética se transmite de generación en generación. (Estos procesos se estudiarán con más detalle en la unidad 14). 116 I. La base molecular de la vida

15 » El ADN de los cromosomas es el material del que están formados los genes. Contiene la información necesaria que permite la síntesis de todas las proteínas de un organismo, que vienen a ser como los robots encargados de ejecutar sus órdenes. Pero esta información genética heredada de nuestros progenitores debe descodificarse para poder ser utilizada por la célula y este proceso se realiza en dos fases: Transcripción de la información genética contenida en un gen. Se sintetiza una cadena de ARN mensajero (ARNm) utilizando como molde una de las hebras del ADN del gen. Se denomina ARNm porque en las células eucariotas sale del núcleo y se dirige al citoplasma llevando el mensaje genético para que se sintetice una proteína. La transcripción utiliza una clave de complementariedad de bases similar a la que vimos en la replicación, pero teniendo en cuenta que la cadena de ARNm sintetizada tiene uracilo (U) en lugar de timina (T), la complementariedad será: G C y A = U (ver unidad 12). Traducción del mensaje contenido en la secuencia de bases del ARNm correspondiente a un gen. Al igual que una banda magnética o un código de barras, el mensaje es captado por una especie de cabezal de lectura, llamado ribosoma, y convertido en la secuencia de aminoácidos de una proteína. En este proceso se utiliza un diccionario universal, conocido como código genético, que asigna a cada grupo de tres bases del ARNm (denominado triplete o codón) uno de los veinte aminoácidos de las proteínas. 2 ADN Ribonucleótidos REPLICACIÓN 1 Proteína ARNm Codón TRANSCRIPCIÓN Ribosoma ARNr 3 Envoltura nuclear Anticodón Ribosoma ARNt Aminoácidos ARNt TRADUCCIÓN El ribosoma recorre la molécula de ARNm, un codón tras otro, y va incorporando los aminoácidos, que llegan al ribosoma transportados por moléculas de ARN de transferencia (ARNt). De esta forma, los aminoácidos se incorporan de uno en uno a la proteína que se está formando y en el orden que indica la secuencia de bases del ARNm, es decir, la sucesión de codones del ARNm (ver unidad 13). Los procesos de replicación, transcripción y traducción, se resumen en lo que se ha dado en llamar el «dogma central de la biología molecular»: la secuencia de bases de un segmento de ADN (un gen) se replica (1) y también se transcribe en la secuencia de bases de una molécula de ARNm (2) que, a su vez, se traduce en la secuencia de aminoácidos de una proteína (3). SÍNTESIS: Diferencias entre ADN y ARN Tipo de pentosa Bases nitrogenadas Estructura Niveles de complejidad estructural Función Desoxirribosa A, C, G, T ADN Bicatenario (lineal o circular), excepto en ciertos virus que es monocatenario (lineal o circular). ADN procariota: estructura primaria y secundaria (enrollamiento en superhélice). ADN eucariota: estructura primaria, secundaria y otros niveles de complejidad: nucleosoma, «collar de perlas», fibra cromatínica o de 30 nanómetros, dominios estructurales en forma de bucles radiales, rosetón de bucles radiales, espiral de rosetones y, por último, cromosoma. Replicación: la información genética se transmite de generación en generación. Almacenamiento de la información genética. Transcripción (síntesis de ARN). Ribosa A, C, G, U ARN Monocatenario, excepto en ciertos virus que es bicatenario. ARNm: estructura primaria. ARNn, ARNr y ARNt: estructura primaria, secundaria y terciaria (en algunas regiones de la molécula que presentan secuencias de bases complementarias). ARNm: se traduce y da lugar a la secuencia de aminoácidos de una proteína. ARNn: precursor de los ARNr. ARNr: forma parte de las subunidades ribosómicas. ARNt: transporta aminoácidos hasta los ribosomas en la síntesis de las proteínas. ARNi: controla la expresión de los genes. 5. Ácidos nucleicos 117

16 Laboratorio y procedimientos Aislamiento de ADN de cebolla Objetivos Romper o lisar con detergentes la pared celular, la membrana plasmática y la membrana nuclear para dejar libre el ADN y hacer que precipite en alcohol. Materiales Una cebolla, cuchillo, batidora eléctrica con el vaso, vasos de precipitado de 250 y de 500 ml, tubos de ensayo, detergente lavavajillas, baño de agua a ºC, termómetro, embudo, papel de filtro, nevera y hielo triturado, agua destilada, sal común, bicarbonato sódico, enzimas proteasas, alcohol etílico muy frío, palillos largos de madera. Procedimiento 1. Prepara la solución de lisis con los siguientes ingredientes y viértela en el vaso de la batidora:» 100 ml de agua, si es posible destilada y, si no, mineral. No usar agua del grifo.» 3 g de NaCl o de sal de mesa.» 5 g de bicarbonato sódico.» 10 ml de detergente líquido de lavavajillas. 2. Corta una cebolla de tamaño medio en trozos grandes y colócalos en el vaso de la batidora que contiene la solución de lisis. Emplea la batidora para triturar la cebolla, pero no la mantengas en marcha durante más de 10 segundos seguidos para evitar el calentamiento (a). 3. Transfiere el contenido triturado del vaso de la batidora a un vaso de precipitado de 500 ml e introdúcelo en un baño de agua caliente, entre 60 y 65 ºC, durante 15 minutos (b). 4. Saca el vaso del baño de agua y filtra su contenido. Para ello, coloca un filtro cónico en otro vaso de precipitado de 250 ml (o emplea un embudo y una servilleta de papel); a continuación, vierte la cebolla triturada y lisada en el filtro. Deja gotear durante un rato y si es necesario exprime el filtro, pero no dejes que caigan sólidos al vaso de 250 ml (c). 5. Introduce el vaso de 250 ml con el filtrado en un recipiente con hielo picado durante unos minutos para que se enfríe, y añade al filtrado un comprimido de desproteinización, de los utilizados para limpiar las lentillas, o bien, añade 3 cucharaditas de café de zumo de piña o papaya y mézclalo bien (contienen enzimas proteasas que rompen las proteínas de la disolución y se eliminan las enzimas que rompen las cadenas de ADN) (d). 6. Vierte 20 ml del extracto de cebolla lisado y desproteinizado en un tubo de ensayo. Sujeta el tubo formando un ángulo de 45º y con mucha lentitud añade un volumen equivalente de alcohol etílico muy frío (recién sacado de la nevera o del hielo) resbalando por la cara interna del tubo y evitando que se mezclen los dos líquidos (e). 7. Observa el ADN como una nube de hilillos finos y viscosos en la interfase, la zona donde los dos líquidos están en contacto. 8. Introduce una varilla delgada de vidrio o un palillo largo de madera en el tubo de ensayo hasta que su extremo esté justo debajo de la interfase. Da vueltas al palillo subiendo y bajando por las dos fases. El ADN se enrollará al palillo (f). 9. Lleva el palillo con el ADN enrollado a otro tubo que contenga alcohol. Gira el palillo para que se libere el ADN en el alcohol. Repite la operación para trasladar más cantidad de ADN. Observa el color y la forma de las fibras. a b c C 500 ml Proteasa e Etanol muy frío f d Hielo 250 ml 20 ml de extracto ADN 118 I. La base molecular de la vida

17 Actividades finales 1. Indica si las siguientes proposiciones son verdaderas o falsas: a) A / T = 1. b) G / T = 1. c) A + G / T + C = 1. d) A + T G + C. e) A + T / G + C = Qué diferencia hay entre nucleósido y nucleótido? 3. En qué se basa el modelo de Watson y Crick de la doble hélice del ADN y cuáles son sus características? 4. A qué tipo de ácido nucleico corresponde la siguiente estructura? 10. Indica las diferencias entre el ADN y el ARN: a) De composición. b) Estructurales. c) Funcionales. 11. Observa el esquema adjunto y responde a las siguientes cuestiones: Adenina Citosina Guanina 5. Con respecto a la fórmula adjunta, contesta a las preguntas siguientes: a) A qué clase de molécula corresponde? b) Qué tipos de conformación espacial adquiere? c) Qué elementos estructurales se destacan en estas conformaciones? d) Qué función desempeña esta molécula? 12. Describe las formas en las que se empaqueta el ADN en las células eucariotas. Cómo se encuentra el ADN durante la división celular? Y durante la intefase celular? 13. Observa la siguiente tabla, que muestra las proporciones de las bases nitrogenadas del ADN o ARN en algunos organismos, y contesta a las siguientes cuestiones: a) De qué tipo de molécula se trata? b) Cuáles son sus unidades estructurales? c) De qué macromolécula forma parte? d) Qué funciones desempeña esta macromolécula? 6. Cómo resuelven las células procariotas el problema del empaquetamiento del ADN en su interior? 7. Qué es el ARN nucleolar? Dónde se sintetiza y qué función desempeña? 8. Qué se entiende por «dogma central de la biología molecular»? 9. Explica los distintos niveles de complejidad o tipos de conformación que adoptan las moléculas de los diferentes ARN. ADN A G C T Timo de bovino 28,2 21,5 21,2 27,8 Esperma de bovino 28,7 22,2 20,7 27,3 Germen de trigo 27,3 22,7 16,8 27,1 Saccharomyces 31,3 18,7 17,1 32,9 Escherichia coli 26,0 24,9 25,2 23,9 ØX174 24,3 24,5 18,2 32,3 ARN A G C U Reovirus 28,0 22,3 22,0 27,9 a) Se cumplen en todos los casos las reglas de Chargaff? Si no es así, a qué crees que se debe? b) Cuál de estos ADN crees que tendrá mayor temperatura o punto de fusión? Cuál es la causa? 5. Ácidos nucleicos 119

18 Debate y opina «Los investigadores de todas las disciplinas tienen el lema publica o muere. Tan pronto como Watson y Crick terminaron su modelo del ADN, de inmediato publicaron un ensayo de una página que conmovió al mundo. Recibieron poca atención todos los demás que de una u otra manera habían contribuido. Una de esas personas fue Rosalind Franklin a quien recientemente empieza a reconocérsele su aportación. Rosalind Franklin llegó al King s Laboratory en Londres con credenciales impresionantes. Había inventado un método perfeccionado de difracción de rayos X mientras estudiaba en París la estructura del carbón. Adoptó un nuevo enfoque matemático para interpretar las imágenes de la difracción y, como Pauling, había diseñado modelos moleculares tridimensionales. Ahora le habían encargado crear y dirigir un moderno laboratorio de cristalografía con rayos X. Su labor consistía en investigar la estructura del ADN.... Nadie se molestó en decirle a Wilkins lo que haría esta mujer; supuso que era una técnica contratada para que hiciera el trabajo de cristalografía con rayos X, pues él no sabía hacerlo. Y así se desató una encarnizada lucha. Wilkins le parecía demasiado quisquilloso a Franklin. A él le molestaba la falta de deferencia por parte de Franklin... Cinco meses más tarde Franklin dio una conferencia sobre lo que había descubierto hasta ese momento. El ADN, aseguró, tal vez tiene dos, tres o cuatro cadenas paralelas enrolladas en una espiral, con grupos de fosfato proyectándose hacia afuera. Gracias a sus conocimientos de cristalografía Crick habría reconocido la importancia de su informe, en caso de haber estado allí (un par de cadenas orientadas en sentidos opuestos sería lo mismo aun con una inclinación de 180 grados). Dos pares de cadenas? No. Lo excluía la densidad del ADN. Pero, un par de cadenas? Sí!, Watson estaba entre la audiencia pero sin saber a qué se refería Franklin. Tiempo después Franklin produjo su excelente imagen de las fibras húmedas de ADN mediante la difracción de rayos X. La imagen casi gritaba ESPIRAL! También calculó la longitud y el diámetro del ADN. Pero como llevaba mucho tiempo trabajando con fibras secas, decidió no investigar el significado de los nuevos datos. Wilkins lo hizo. En 1953, sin que lo supiera Franklin, permitió a Watson ver la imagen y recordó lo que Franklin había expuesto más de un año antes. Cuando Watson y Crick se concentraron en esos datos, obtuvieron el último trozo de información que necesitaban para construir un modelo aceptable del ADN: un modelo con dos cadenas enrolladas en forma de espiral que se dirigían a sentidos opuestos.» C. STARR Y R. TAGGART. Biología. Ed. Thomson.» Crees que Rosalind Franklin hubiera merecido compartir el premio Nobel, junto con Watson y Crick? Webquest Tarea Elabora un trabajo sobre los aspectos que consideres más destacables de los ácidos nucleicos en formato Word o en PowerPoint. Incluye en él fotografías, gráficos, animaciones o secuencias de vídeo. Proceso Reúne información sobre los siguientes temas:» Nucleótidos nucleicos y no nucleicos.» Estructura primaria y secundaria del ADN.» Desnaturalización del ADN y punto de fusión.» Descubrimiento de la doble hélice del ADN.» Empaquetamiento del ADN en procariotas y eucariotas.» Estructura del ARN y tipos de ARN.» Funciones que desempeñan los ácidos nucleicos. Recursos Consulta libros de la biblioteca, prensa y revistas, y visita las siguientes páginas web: Biología 2.º de Bachillerato 2BCH/INDICES/apuntes_pdf.htm Estructura de los ácidos nucleicos /grupod/estruadn/estruadn.htm El cromosoma eucariótico /grupod/cromoeuc/cromoeuc.htm Biomodel Ácidos nucleicos I. La base molecular de la vida

19 UNA MIRADA HACIA ATRÁS En el bloque I has aprendido que estructuras, propiedades y funciones son tres términos estrechamente relacionados. Desde la idoneidad del carbono hasta la doble hélice del ADN, se repite la misma idea: la conformación espacial o geométrica que adopta una molécula es responsable, en buena parte, de las propiedades fisicoquímicas que manifiesta que, a su vez, explican su actividad biológica. Por el hecho de que el átomo de carbono presenta una particular configuración electrónica, es capaz de formar enlaces covalentes consigo mismo o con otros elementos y originar así una enorme variedad de moléculas orgánicas. Y la peculiar disposición tetraédrica de los orbitales sp 3 del átomo de oxígeno junto con su carácter electronegativo son la causa de que la molécula de agua adopte determinada conformación espacial, adquiera polaridad y presente una estructura reticular que justifica sus propiedades fisicoquímicas peculiares que, a su vez, determinan las funciones biológicas que desempeñan. Debido a que los monosacáridos presentan átomos de carbono asimétricos, algunos azúcares como la glucosa pueden adoptar configuración o, lo que decide que unos polisacáridos sean fácilmente hidrolizables, como el almidón, y otros sean muy resistentes a la hidrólisis, como la celulosa. Y el que los aminoácidos se unan en secuencias específicas determina la disposición particular de las hélices, de las láminas y de las estructuras terciarias y cuaternarias de las proteínas, que son responsables de su funcionalidad biológica y de su capacidad para unirse específicamente consigo mismas o con otras moléculas: la enzima con su sustrato, el anticuerpo con su antígeno... Por último, la conformación espacial que adopta el ADN en forma de doble hélice y el apareamiento específico y la complementariedad entre sus bases, convierten a estas moléculas y también a los ARN en los soportes idóneos para el almacenamiento y la expresión de la información genética que se transmite fielmente de generación en generación. UNA MIRADA HACIA DELANTE El estudio sistemático y descriptivo de los componentes moleculares de la célula que acabas de realizar tal vez genere una imagen estática de la materia viva. Sin embargo, la célula viva está constituida por materia en continuo dinamismo, cuyos componentes forman un sistema que, gracias al aporte continuo de energía y materias primas, mantiene y aumenta su complejo grado de organización. En el bloque II estudiarás los aspectos dinámicos de la materia viva, es decir, los diferentes modelos de organización celular, mostrando, de nuevo, la íntima relación entre estructura y función, pues las distintas estructuras celulares son las que posibilitan que la energía y las materias primas sean captadas, transportadas, almacenadas y utilizadas mediante una serie de cambios químicos complejos que constituyen el metabolismo celular, fuente de la vida. 121