TOPICOS AVANZADOS EN INTERACCIONES BIOLÓGICAS Y BIOTECNOLOGÍA APLICADA EN ACUICULTURA. Profesores

Transcripción

1 TOPICOS AVANZADOS EN INTERACCIONES BIOLÓGICAS Y BIOTECNOLOGÍA APLICADA EN ACUICULTURA. Profesores Dr. José Gallardo (Coordinador) Dr. Luis Mercado, Dr. Sergio Marshall, Dr. Jorge Olivares, Dr. Roberto Bastias, Dra. Carolina Yáñez, Dr. Fernando Gómez. Doctorado en Acuicultura I Semestre 2015 UNIDADES PRIMERA UNIDAD Mejora genética de peces y resistencia genética a patógenos. Dr. José Gallardo SEGUNDA UNIDAD Patógenos de peces y su diagnóstico. Dr. Sergio Marshall y Dr. Fernando Gómez. TERCERA UNIDAD Control de patógenos. Dr. Jorge Olivares, Dr. Roberto Bastias, Dra. Carolina Yáñez CUARTA UNIDAD Respuesta inmune y marcadores inmunológicos. Dr. Luis Mercado 1

2 METODOLOGIA Y EVALUACION METODOLOGIA DE TRABAJO: Clases teóricas Tareas Seminarios EVALUACION: El curso será evaluado a través de 4 tareas/pruebas (1 x módulo x 25% c/u). 1.- Conceptos de genética. HOY TRABAJAREMOS EN 2.- Mejora genética por selección artificial: 1 Rasgo. 3.- Mejora genética por selección artificial: Múltiples rasgos rasgos. 4.- Resistencia genética a patógenos. 5.- Marcadores genéticos: QTLs, y selección genómica. 2

3 CARÁCTER BIOLOGICO CUALITATIVO Expresa una cualidad. Controlados por pocos genes. Sin influencia del ambiente sobre su expresión. Carácter biológico: Pigmentación de la piel. Fenotipo: Pigmentado v/s NO pigmentado 3

4 DOMINANCIA COMPLETA DEL GEN TYR Precursor de melanina Homocigoto dominante T T Melanina Heterocigoto T t Homocigoto recesivo t t CUÁL ES MI GENOTIPO? = TT - Tt - tt 4

5 CARÁCTER BIOLOGICO CUANTITATIVO Expresa una cantidad. Controlados por muchos genes. Gran influencia del ambiente sobre su expresión. Genotipo + Ambiente (manejo productivo) = Fenotipo QUANTITATIVE TRAIT LOCI Gen que codifica para un rasgo cuantitativo Si, m = promedio (efecto de todos los genes menos el QTL ) Luego, VALOR GENOTÍPICO (EE) m + a VALOR GENOTÍPICO (Ee) m + d VALOR GENOTÍPICO (ee) m - a 5

6 QUANTITATIVE TRAIT LOCI Gen que codifica para un rasgo cuantitativo Supuesto: Ambiente (E) = 0. P = G Genotipos EE Ee ee Valor fenotipo 14 g 12 g 6 g Efecto aditivo del gen (a) a = + 4 g ; -a = - 4 Desvío de dominancia (d) d = + 2 g QUANTITATIVE TRAIT LOCI Dominancia parcial Genotipos P G EE 14 g (10 + 4) +4 Ee 12 g (10 + 2) 2 ee 6 g (10-4) -4 Dominancia completa GEN P G Acción aditiva GEN P G Sobredominancia GEN P G EE 35 a= Ee 35 d= ee 15 -a= EE 35 a= Ee 25 d= ee 15 -a= EE 35 a= Ee 45 d= ee 15 -a= 6

7 Genotipos N animales SELECCIÓN DIRECTA DEL QTL Frecuencia (F) Valor (G) Promedio ponderado (F * G) EE 25 0, Ee 50 0, ee 25 0, Sin selección m + 1 = 11 g EE 90 Ee 9 ee 1 Con selección PARENTESCO Parentesco: Dos individuos son parientes si tienen ancestros en común o si uno es antecesor de otro. A B A B Vías de conexión X Y X Y 7

8 PARENTESCO Rxy: Proporción de genes que comparten dos individuos emparentados. Medios hermanos (hermastros) A B C Hermanos completos A B 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 X Y X Y Rxy = ( ½ ) 2 = 1/4 Rxy = ( ½ ) 2 + ( ½ ) 2 = 1/2 Rxy = Σ ( ½ ) n1 + n2 PARENTESCO Para la siguiente genealogía calcule el coeficiente de parentesco entre los individuos: A) Individuo 2 individuo 12 B) Individuo 12 individuo 14. 8

9 CONSANGUINIDAD Def.: Cruzamiento o reproducción entre individuos emparentados. A y B son homocigotos recesivos, pero solo A es consanguíneo. DEPRESION POR CONSANGUINIDAD DEF. 1. Disminución del valor fenotípico promedio (rasgo cuantitativo) en una población (Lynch y Walsh, 1998). DEF. 2. Aumento de malformaciones en los animales o aumento de enfermedades de tipo hereditarias producto de la consanguinidad (Tave, 1996). 9

10 COEFICIENTE DE CONSANGUINIDAD Abuelo Padre 1/2 1/2 a 1 a 2 1/2 1/2 Madre Nieto El coeficiente de Consanguinidad (F ) de un individuo es la probabilidad de que dos alelos presentes en él sean idénticos por descendencia. COEFICIENTE DE CONSANGUINIDAD a) Probabilidad de que el nieto tenga dos alelos A 1 : a. A través de la madre = ½ * ½ = ¼. b. A través del padre = ½ * ½ = ¼ c. Total = ¼ * ¼ = 1/16. b) Probabilidad de que el nieto tenga dos alelos A 2 : a. A través de la madre = ½ * ½ = ¼. b. A través del padre = ½ * ½ = ¼ c. Total = ¼ * ¼ = 1/16. c) Probabilidad de que dos alelos en el nieto sean idénticos por descendencia Padre Nieto Abuelo 1/2 a 1 a 2 1/2 1/2 1/2 Madre F x = 1/16 + 1/16 = 1/8 =

11 COEFICIENTE DE CONSANGUINIDAD Abuelo Padre 1/2 1/2 a 1 a 2 1/2 1/2 Madre Fx = (1 + F A ) Nieto Generalizando, el coeficiente de consanguinidad es n+ n' + 1 F x = ( 1/ 2) (1+ FA ) n = número de generaciones entre el padre y el antecesor común. n = número de generaciones entre la madre y el antecesor común. A PARTIR DE LA SIGUIENTE GENEALOGÍA DETERMINE EL NIVEL DE CONSANGUINIDAD DEL INDIVIDUO Z A B X Y Z 11

12 PROPORCION DE SEXOS Y CONSANGUINIDAD (F) Ne = 4 * Nm * Nh Nm + Nh Tasa de F = 1/(2Ne) Machos Hembras Tamaño efectivo de la población (Ne) Tasa de consanguinidad (%)

13 QUÉ ES EL MEJORAMIENTO GENETICO? Son técnicas y procedimientos de genética que permiten modificar caracteres biológicos (cualitativos o cuantitativos), de importancia económica, para mejorar la eficiencia de los sistemas productivos en la empresa. TECNICAS Y PROCEDIMIENTO DE GENETICA MEJORA GENETICA POR SELECCIÓN ARTIFICIAL 13

14 MEJORA GENETICA POR SELECCIÓN ARTIFICIAL Grupo seleccionado h 2 = heredabilidad. S = diferencial de selección. IG = Intervalo generacional. Hijos grupo seleccionado R = Respuesta a la selección en una generación R= h 2 S IG HEREDABILIDAD Es una medida de la variación genética aditiva de un rasgo cuantitativo h 2 =

15 SELECCIÓN ARTIFICIAL Y HEREDABILIDAD h 2 = 0,4 h 2 = 0,05 MEJORA GENETICA EN EL LARGO PLAZO 15

16 INTERACCION GENOTIPO - AMBIENTE QUÉ INFORMACION NECESITO PARA SELECCIONAR AL MEJOR PEZ? 16

17 DISEÑO DE APAREAMIENTO FAMILIAR Y REGISTRO DE DATOS PARA ESTIMAR PARÁMETROS GENÉTICOS. Full sib Full sib Full sib Núcleo Peces para selección Full sib Full sib Full sib Full sib Centro de prueba Peces para evaluación Full sib Full sib METODOLOGÍA DE EVALUACION GENETICA BLUP (Best Linear Unbiased prediction) Método BLUP requiere: 1.- Matriz de fenotipos (y). 2.- Matriz de parentesco (A): genealogía. 3.- Matrices de diseño (XZ): Piscicultura, Estanque, Fecha desove, etc. 4.- Parámetros genéticos y fenotípicos (λ): varianzas (h 2 ), covarianzas (rg). BV i = Predicted Breeding value 17

18 SISTEMA O ESTRUCTURA DISEMINACION PMG ESTRUCTURA PROGRAMAS DE MEJORA GENETICA EN ACUICULTURA 18

19 CLASIFICAR CARACTERES BIOLOGICOS Sexo - Peso smolt - SGR (Specific Growth Rate) - IGS - Peso WFE (Whole Fish Equivalent) Madurez - Gaping - Color filete - Rendimiento filete - Sobrevivencia Resistencia a patógenos. Cualitativo Cuantitativo ECONOMICAMENTE CUÁL VALE MAS? 19

20 Obje;vo de selección = H Combinación de caracteres biológicos que se desean mejor por la influencia que tienen en el beneficio (rentabilidad) económico de la empresa (Ponzoni, 1992). H = v 1 BV 1 + v 2 BV 2 + v 3 BV 3 + v i BV i BV i = TRUE Breeding value o valor mejorante para cada rasgo. V i = Ponderación económica. Obje;vo de selección = H H = v 1 BV 1 + v 2 BV 2 + v 3 BV 3 + v i BV i Selección de múltiples rasgos, Que debemos hacer? Paso 1. Definir i rasgos a seleccionar en los reproductores. Paso 2. Determinar ponderación económica relativa v i para los i rasgos seleccionados. 20

21 Ponderaciones económicas (v) Paso 2. Determinar ponderaciones económicas. Ponzoni (1992) define la ponderación económica de un carácter como: el cambio en el margen bruto (ingresos - costos) por cada unidad de cambio del carácter, suponiendo que los otros permanecen constantes. Criterio de selección = I Combinación de caracteres biológicos que se pueden medir de forma práctica y económica, que están correlacionadas con H y que por tanto se usan para la selección de reproductores. I = b 1 PBV 1 + b 2 PBV 2 + b 3 PBV 3 + b i PBV i BV i = Predicted Breeding value o valor mejorante para cada rasgo (BLUP). b i = Coeficiente que maximiza la respuesta económica en H. 21

22 Selección de múltiples rasgos, Cómo lo implemento? Criterio de selección = I Paso 3 Estimar parámetros genéticos de todos los rasgos incluidos en H e I. - Heredabilidad = h 2 - Correlaciones genéticas = r g Paso 4. Predecir valor genético (BLUP) y combinar en el índice. CORRELACION GENETICA ENTRE RASGOS 22

23 SELECCIONE 4 PECES POR TAMAÑO Carácter cuantitativo: Peso (gramos). Pez Fam A Fam B Fam C Fam D Promedio Fam Promedio Total 70 23

24 ESTUDIO DE CASO: PMG SALMON COHO IFOP Desarrolladores ESTRUCTURA Agua dulce Reproducción y cruzamientos Cultivo familiar de ovas Marcaje de alevines Agua de Mar Procesamiento 1.- Identificación animales 2.- Registro caracteres 3.- Selección reproductores Adaptación agua salada Crecimiento y Engorda 24

25 ESTRUCTURA AÑO 1991 AÑO 1992 AÑO 1993 AÑO 1994 AÑO 1995 AÑO 1996 AÑO 1997 AÑO 1998 AÑO 1999 AÑO 2000 AÑO 2001 E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D E F M A M J J A S O N D CLASE AÑO IMPAR B L U P B L U P B L U P B L U P B L U P BASE G1 G2 G3 G4 G5 CLASE AÑO PAR B L U P B L U P BLUP B L U P BASE G1 G2 G3 G4 Obje;vo de selección = Peso a la cosecha y desove temprano DISEÑO DE APAREAMIENTO FAMILIAR Y REGISTRO DE DATOS PARA ESTIMAR PARÁMETROS GENÉTICOS. Even popula;on Odd popula;on Year class Sires Dams Harvest weight Spawn Day Year Class Sires Dams Harvest weight Spawn day Total Total

26 RESPUESTA A LA SELECCIÓN: PESO A LA COSECHA Peso a la cosecha (g) Fenotipo (DP) Respuesta genética (DG): 302 g por generación (9 %). Generación 5000 Fenotipo (DP) Peso a la cosecga (g) Respuesta genética (DG): 383 g por generación (10%) Generaciones h 2 peso cosecha = 0,21-0,37 RESPUESTA A LA SELECCIÓN: FECHA DE DESOVE Respuesta a la selección: Desove temprano salmon Coho. DP DG Even -13 d d Odd -15 d d h 2 fecha de desove: 0,44 26

27 EVALUACION CONSANGUINIDAD POBLACIONAL Inbreeding (%) Even Odd Base G1 G2 G3 G4 Pop. Sires Dams Ne ΔF Even % Odd % EFECTOS PERJUDICIALES DE LA CONSANGUINIDAD: CRECIMIENTO 27

28 EFECTOS PERJUDICIALES DE LA CONSANGUINIDAD: SOBREVIVENCIA CONTROL DE LA CONSANGUINIDAD 28

29 EVOLUCION BIOMASA TOTAL Y CRISIS VIRUS ISA Colapso virus ISA PERDIDAS POR US$ Fuente: Sernapesca, 2103 Fuente: Sernapesca,

30 MORTALIDAD ASOCIADA A PISCIRICKETTSIA SALMONIS P. salmonis es una bacteria intracelular altamente agresiva. PERDIDAS POR MUS$ x AÑO Fuente: Sernapesca, 2103 USO DE ANTIPARASITARIOS PARA EL CONTROL DE CALIGUS Antiparasitarios (Kg) Fuente: Sernapesca, 2103 Deltametrina Benzoato de Emamectina Cipermetrina Diflubenzurón PERDIDAS POR MUS$ x AÑO 30

31 ESTUDIO DE CASO: CONSORCIO DE PATOGENOS EN SALMONICULTURA CONSORCIO DE PATOGENOS = COINFECCION Piojos de mar con MICROSPORIDIO Loma salmonae AMEBA Neoparamoeba perurans VIRUS ISA Mustafa et al Nowak et al Bustos et al Valdes-Donoso et al. (2013) 31

32 CONCEPTOS: TOLERANCIA Y RESISTENCIA A PATOGENOS Tolerancia Es la habilidad del animal para soportar los efectos perjudiciales asociados a la infección (enfermedad). Mejorar la tolerancia reduce el impacto de la infección en el individuo, pero Iene poco efecto en la transmisión de la infección a nivel poblacional. Resistencia Es la capacidad de los animales para moderar el ciclo de vida de un patógeno. Mejorar la resistencia reduce la transmisión de la infección y por lo tanto la severidad de la enfermedad a nivel poblacional. MECANISMOS DE RESISTENCIA A PATOGENOS El animal puede tener atributos morfológicos que hacen que dificultan la infección del patógeno. El animal puede tener atributos de comportamiento que le permite evitar la infección. El animal puede tener genes de respuesta no inmunes que impiden la infección o la limitan en los órganos diana. El animal puede tener una respuesta inmune adecuada dirigida contra el patógeno. Esto puede permitir que el animal combata con éxito la infección o evite los efectos patogénicos de la enfermedad. 32

33 PROBLEMA 1: CÓMO MIDO EL RASGO RESISTENCIA A PATOGENOS? MORTALIDAD COMO RASGO BINARIO? 100% 80% Mortalidad 60% 40% 20% 0% Familias Mortalidad individual = Vivo (0) Muerto (1). 33

34 MORTALIDAD COMO TIEMPO EN MORIR? 100% Mortalidad acumulada 75% 50% 25% 0% Dias post inoculación Mortalidad individual = Días en morir. CARGA DE PATOGENOS? 160 Infestación (N parásitos) Peces Infestación individual: Nº parásitos por pez 34

35 PROBLEMA 2: DÓNDE EVALUO LA RESISTENCIA? LABORATORIO CENTRO DE CULTIVO PROBLEMA 1: DÓNDE EVALUO LA RESISTENCIA? Item h 2 Laboratorio h 2 Campo Exposición a la infección Completa Parcial Diagnóstico Completo Sub-obtimo incomplete exposure to infection, or suboptimal Control de diagnoses Completo Limitada variables ambientales Fuente: Bishop SC, Woolliams JA (2010) 35

36 Patógeno h 2 Laboratorio h 2 Terreno L. salmonis 0,26 0,06 IPN virus 0,28 0,15 Furunculosis 0,34 0,23 Patógeno rg Fuente L. salmonis 0,88 ± 0,17 Kolstad Furunculosis 0,95 Gjoen et al., 1997 IPN 0,78-0,83 Storset et al.,

37 DESAFIO CONTRA CALIGUS Rasgo N MEAN Parásitos sésiles Peso cuerpo ,7 ± 41,0 Parásitos aletas Es;mado parásitos cuerpo ,6 ± 14, ,7 ± 16,3 Parásitos móviles Peso cuerpo ,2 ± 59,0 Parásitos cuerpo MEDICION FENOTIPO DE RESISTENCIA ,2 ± 6,0 37

38 ESTIMACION PARAMETROS GENETICOS DE RESISTENCIA: NUMERO DE PARASITOS POR PEZ Días post infestación Heredabilidad (h 2 + EE) Peso cuerpo como covariable Sin Peso como covariable 4 días 0,340 ± 0,07 ** 0,417 ± 0,08 ** 14 días 0,056 ± 0,06 ns 0,175 ± 0,08 ns 38

39 HIPOTESIS 1 / METODOS C. rogercresseyi reduce la resistencia a P. salmonis? Simple infección P. salmonis Coinfección P. Salmonis + 30 Caligus x pez Coinfección P. Salmonis + 60 Caligus x pez HIPOTESIS 2 / METODOS La resistencia a la coinfección es un rasgo heredable? Modelo umbral (binario) Modelo lineal (continuo) R = 0 S = 1 S R 15 full-sib = peces genealogizados 39

40 HIPOTESIS 3 / METODOS Peces resistentes a P. Salmonis son resistentes a la coinfección? Full sib Full sib Full sib P. salmonis P. Salmonis + 30 caligus P. Salmonis + 60 caligus RESULTADOS EFECTO DE CALIGUS SOBRE RESISTENCIA A P. SALMONIS EFECTO CALIGUS P. salmonis 40

41 RESULTADOS / DISCUSION RESISTENCIA A LA COINFECCION ES HEREDABLE Trat. Nº CALIGUS Heredabilidad Resistencia (umbral) Heredabilidad Resistencia (con;nuo) T1 0 0,23 ± 0,07 0,32 ± 0,12 T2 30 0,24 ± 0,07 0,37 ± 0,14 T3 60 0,17 ± 0,08 0,37 ± 0,14 + RESULTADOS / DISCUSION AUSENCIA DE CORRELACION RESISTENCIA SIMPLE - COINFECCION Tratamiento T1 (0 Sea lice) T2 (30 sea lice) T1 (0 sea lice) - - T2 (30 sea lice) - 0,14 ± 0,33 ns - T3 (60 sea lice) 0,32 ± 0,34 ns 0,99 ± 0,01** 41

42 RESULTADOS / DISCUSION CALIGUS CAMBIA EL RANKING DE SELECCION A P. SALMONIS RANKING RESISTENCIA P. SALMONIS SIN CALIGUS CON CALIGUS 42

43 MARCADORES GENETICOS Debe ser polimórfico. No necesariamente con función biológica. Sirven como marcadores de un lugar en el genoma. ALELO 1 ALELO 2 SNP : SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM Alelo 1 AATCATGTGTGGCTACTTATGGTCAT Alelo 2 AATCATGTGTAGCTACTTATGGTCAT G/G G/A A/A HOMOCIGOTO HETEROCIGOTO HOMOCIGOTO 43

44 SSR : SINGLE SEQUENCE REPEATS COMPARACION MARCADORES GENETICOS Microsatélites: identificados en genoma de salmones. - Localizados fuera de los genes. SNP - Chip Affimetrix con SNPs en genoma de salmones. - Localizados cerca de los genes o dentro de ellos. Referencia: Damani and Topol Genome Medicine :54 44

45 Marcador BUSQUEDA genético: Single DE Nucleotide MARCADORES Polimorfism GENETICOS POR SECUENCIACION DESDE MARCADOR GENETICO A QTL 45

46 ASOCIACION ENTRE MARCADOR (C) Y QTL(E) SIN ASOCIACION = EQUILIBRIO DE LIGAMIENTO EQUILIBRIO DE LIGAMIENTO r MAX = 1/2 GAMETOS FREC. F X 100 CE ½ (1-r) 25 ce ½ (1-r) 25 ce ½ r 25 Ce ½ r 25 46

47 CON ASOCIACION = DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO Ej. r = 0,1 GAMETOS FREC. F X 100 CE ½ (1-r) 45 ce ½ (1-r) 45 ce ½ r 5 Ce ½ r 5 QTL MARCADOR VALOR GENETICO Y VALOR GENETICO GAMETOS FREC VALOR G FREC x G CE 45 ½ +a 45 ½ a ce 45 ½ -a - 45 ½ a ce 5 ½ +a 5 ½ a Ce 5 ½ -a - 5 ½ a C hijos 40 ½ a 50 c hijos - 40 ½ a 50 Diferencia: C hijos c hijos = a * 4/5 = a*(1-2r) La diferencia depende de: - El efecto del QTL = a - La tasa de recombinación entre el marcador y el QTL = r. - Si r = ½, el marcador no esta ligado al QTL y por lo tanto no hay diferencia entre C y c Referencia: Theo Meuwissen (2010) 47

48 SELECCIÓN ASISTIDA POR MARCADORES (MAS) Información de genealogía Información del marcador Alelo C Alelo c Modelo de regresión lineal y = µ+ b*x + e y=registros; µ= promedio b= coeficiente de regresión x= genotipo del SNP (0,1,2) QTL IPN QTL - IPN 120 SOBREVIVENCIA RR RS SS Genotipo FENOTIPO VALOR GENOTIPO RR 99 15,8 RS 83,2 0 SS 67,4-15,8 48

49 Padre Madre Animal SELECCIÓN GENOMICA SNP 1 SNP 2 SNP 3 SNP 4 SNP 5 SNP n Fenotipo ? ? Modelo de regresión lineal y = µ+ b*x + poligénico + e 49

50 PLATAFORMAS PARA GENOTIPEO MASIVO (CHIP) PLATAFORMAS PARA GENOTIPEO MASIVO (CHIP) Nº SNPs Nº muestras