EFECTO DE LA VITRIFICACIÓN SOBRE LA VIABILIDAD DE OVOCITOS BOVINOS MADURADOS IN VITRO

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1 BOLETÍN DEL CENTRO DE INVESTIGACIONES BIOLÓGICAS VOLUMEN 43, NO. 2, 2009, PP UNIVERSIDAD DEL ZULIA, MARACAIBO, VENEZUELA EFECTO DE LA VITRIFICACIÓN SOBRE LA VIABILIDAD DE OVOCITOS BOVINOS MADURADOS IN VITRO FRANCISCO J. BÁEZ-CONTRERAS, AMARÚ PIRELA-PIRELA, JULIO A. LANDINEZ Y PATRICIA VILLAMEDIANA-MONREAL* Laboratorio de Citogenética, UNIBIO, Departamento de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del Zulia, Apartado 526, Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela *patriciavillamediana@cantv.net Resumen. El objetivo de este estudio fue comprobar el efecto de la vitrificación ovocitaria empleando la técnica de pajuela estirada abierta (OPS) y microgota (MG) sobre la progresión meiótica y supervivencia morfológica, utilizando para esto último dos métodos de valoración, la evaluación morfológica bajo microscopio estereoscópico y la tinción vital con ioduro de propidio. Para ello se llevó a cabo la maduración in vitro durante 24 h de cultivo de ovocitos obtenidos mediante la técnica de slicing a partir de ovarios colectados en matadero. Los ovocitos madurados fueron vitrificados. Se valoró la progresión meiótica y la supervivencia tras el choque térmico. Fueron estudiados 341 ovocitos madurados in vitro, de los cuales 246 ovocitos fueron vitrificados. La tasa de maduración fue de un 61,46%, siendo similar en los tres grupos experimentales. El porcentaje de ovocitos óptimos para continuar el desarrollo tras la vitrificación en microgotas fue menor al observado en ovocitos sin vitrificar (P < 0,05). La valoración de la supervivencia de ovocitos sin vitrificar y de ovocitos vitrificados en microgota difirió dependiendo de la técnica utilizada. Los resultados aquí presentados indican que la valoración de la supervivencia tras el choque térmico bajo microscopio estereoscópico no sustituye a la valoración objetiva que pueda realizarse mediante una tinción vital. A pesar de que los ovocitos madurados in vitro sobrellevan mejor la vitrificación en pajuelas estiradas abiertas cuando se valora la supervivencia bajo microscopio estereoscópico, el recomendar una u otra técnica de vitrificación seria precipitado. Recibido: 29 septiembre 2008, aceptado: 11 mayo Palabras clave. OPS, microgota, vitrificación, supervivencia, ovocitos, bovinos. 197

2 198 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. EFFECT OF VITRIFICATION ON VIABILITY OF IN VITRO MATURED BOVINE OOCYTES Abstract. We evaluated the effect of oocyte vitrification by using the open-pulled straw (OPS) and microdrop (MG) methods on meiotic progression and oocyte survival. Meiotic progression and oocyte survival were determined under stereoscopic microscopy and by vital staining with propidium iodide. In vitro maturation was accomplished during 24 culture hours, using oocytes obtained by the slicing technique, from ovaries collected in a slaughterhouse. Matured oocytes were vitrified, and meiotic progression and oocyte survival were evaluated after thermic shock. Of 341 in vitro matured oocytes evaluated, 246 were vitrified. Mean maturation rate was 61.46%, and similar among the three experimental groups. Percentage of optimum oocytes, that continued to develop after vitrification in microdrops, was less than that observed in unvitrified oocytes (P < 0.05). Survival of unvitrified oocytes and oocytes vitrified in microdrops differed, depending on the technique used. Evaluation of oocyte survival after thermic shock, under stereoscopic microscopy, does not serve as a substitute for an objective evaluation made by using a vital stain. Although in vitro matured oocytes did better under vitrification in open-pulled straws, when measuring oocyte survival under stereoscopic microscopy, it is still too soon to recommend one or the other vitrification technique. Received: 29 September 2008, accepted: 11 May Key words. OPS, microdrop, vitrification, survival, oocytes, bovine. INTRODUCCIÓN En las últimas décadas, la criopreservación de embriones y ovocitos ha sido una herramienta útil para interrumpir y controlar el ciclo reproductivo de especies de interés zootécnico, sometiéndolos a temperaturas bajas para interrumpir su ciclo celular, manteniendo su viabilidad y funcionalidad (Fuku et al. 1995). El mantenimiento de bancos de ovocitos permitiría acelerar el mejoramiento genético e incrementar la disponibilidad de material para investigación básica y aplicada a la biotecnología. Una característica dominante de la criopreservación de ovocitos mamíferos mediante los protocolos establecidos es la pérdida de competencia para el desarrollo. La criopreservación causa un incremento significativo en la tasa de degeneración durante el cultivo posterior (Lim et al. 1992). Se hacen esfuerzos en el mejoramiento de la criopreservación de ovocitos concentrados en incrementar la tasa de congelación para minimizar los daños causados por las bajas temperaturas (Martino et al. 1996).

3 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 199 Durante la criopreservación, los ovocitos experimentan condiciones fisiológicas adversas. Estas condiciones severas provocan en los ovocitos varias alteraciones citológicas, como ruptura de membranas, pérdida o ganancia de cromosomas, falla en la extrusión del corpúsculo polar, fragmentación del DNA, endurecimiento y fractura de la zona pelúcida. Además de las anomalías citológicas la criopreservación puede ocasionar también anomalías bioquímicas al ovocito como la deshidratación y pérdida de función de proteínas (Men et al. 2003). Los métodos de criopreservación se pueden clasificar según el tiempo de congelación y descongelación, en criopreservación lenta, rápida o ultrarrápida y vitrificación (Shaw et al. 2000), siendo la vitrificación la técnica más práctica para la criopreservación de ovocitos bovinos (Kim et al. 2007). Se ha tratado de mejorar la tasa de congelación durante la vitrificación ovocitaria utilizando métodos que permitan el uso de mínimos volúmenes de soluciones crioprotectoras lo que permite pasar rápidamente la zona crítica de temperatura (+15 ºC a -15 ºC), considerada la zona de letalidad (Isachenko et al. 1998). Entre tales métodos se encuentran el uso de gradillas de microscopia electrónica (Martino et al. 1996), cryoloops (Mavrides y Morroll 2002, Mavrides y Morroll 2005), mallas de nylon (Matsumoto et al. 2001) y pajuelas abiertas estiradas ( open pulled straws, OPS; Otoi et al. 1995, Hurtt et al. 2000, Men et al. 2003, Diez et al. 2005, Albarracín et al. 2005, Mucci et al. 2006). La inclusión directa de los ovocitos al nitrógeno líquido (método de la microgota; MG) es la forma más simple de mejorar la tasa de congelación (Kim et al. 2007). La viabilidad de los ovocitos puede ser determinada basándose en un examen visual de la integridad de las membranas ovocitarias, zona pelúcida y normalidad del citoplasma inmediatamente después de ser descongelados. La validez de la clasificación morfológica debe ser confirmada con tinciones vitales como el ioduro de propidio. El objetivo del presente trabajo es determinar el efecto que causa la vitrificación de ovocitos madurado in vitro y el tipo de técnica utilizada para tal fin sobre la viabilidad ovocitaria. OBTENCIÓN Y SELECCIÓN DE OVOCITOS MATERIALES Y MÉTODOS Se utilizaron ovarios de vacas mestizas, sacrificadas en mataderos comerciales, que fueron transportados al laboratorio en solución buffer fosfato salino (PBS) a una temperatura de ºC en un recipiente isotérmico. Posteriormente, fueron lavados en PBS + 50 mg/l de gentamicina a ºC.

4 200 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. Los complejos cumulus-ovocito (COC s) fueron recuperados mediante la técnica de slicing (Suss y Madison 1983), que consiste en realizar cortes sucesivos en la superficie del ovario, liberándose los COC s de los folículos de distintos tamaños. Fueron seleccionados bajo un microscopio estereoscópico (Olympus SZX12, EUA) los COC s que presentaron un mayor tamaño, un citoplasma homogéneo y al menos una capa completa de células del cúmulus compacta. MADURACIÓN Y FECUNDACIÓN IN VITRO DE OVOCITOS Una vez seleccionados los COC s se cultivaron en grupos de 12, en microgotas de 50 µl cubiertas con aceite mineral (69794, Fluka) durante 24 h a 38,5 ºC, en una atmósfera con 5% CO 2 en aire saturado de humedad, utilizando el medio de maduración TCM 199 (M7528, Sigma) suplementado con 275 mg/l de piruvato sódico (815990, Fluka), 50 mg/l de gentamicina, 146 mg/l de L-glutamina (G-15120, Sigma), 10 µg/ml de Folltropin-V (Vetrepharm, Canadá Inc), 1 µg/ml de 17β-estradiol (E G, Sigma) y 10% suero fetal bovino (SFB, F-2442, Sigma) (Marquant et al. 1989). Los ovocitos fueron fecundados en grupos de 16 en gotas de 100 µl de FIV-Talp suplementado con 6 mg/ml de BSA, Sigma A6003). Para la selección de los espermatozoides se utilizó semen congelado de toros de probada fertilidad. Una vez descongeladas las pajuelas a 37 C por 30 segundos, se centrifugó a 800 g durante 15 min en un gradiente discontinuo de Percoll (P4937, sigma, 45%/90%) se descartó el sobrenadante y el pellet de espermatozoides fue lavado con 3 ml de mdm suplementado con 6 mg/ml de BSA, fracción V (Sigma A3059) y centrifugado a 300 g por 10 minutos. La concentración espermática se valoró en una cámara de Newbauer para alcanzar una concentración de 4 x 10 6 spz/ml en 100 µl de medio de fecundación Fert-Talp junto con grupos de 30 COC s por 24 h, en una atmósfera con 5% de CO 2 y aire saturado de humedad. VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS MADUROS Los COC s con al menos una capa completa de células del cumulus y citoplasma homogéneo fueron vitrificados siguiendo el protocolo propuesto por Asada et al. (2002) con ciertas modificaciones. Los COC s fueron transferidos a una solución vitrificadora 1 (SV1), la cual consistió en 10% de etilenglicol, 0,2 M de sacarosa, 10% de FBS en PBS, por 5 minutos. Posteriormente fueron expuestos a la solución vitrificadora 2 (SV2): 40% de etilenglicol, 0,6 M de sacarosa, 10% de FBS en PBS, por 1 min. para luego ser cargados en OPS o sumergiéndolos directamente en nitrógeno líquido (N 2 L)

5 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 201 aplicando la técnica de MG. Después de un periodo de al menos siete días en N 2 L la descongelación se realizó sumergiendo la punta de la pajuela de OPS y la MG directamente en solución desvitrificadora (SDV 1: 0,5 M de sacarosa en PBS y 20% de FBS) exponiendo los ovocitos por 5 min. a 39 ºC. y a la solución desvitrificadora 2 (SDV2: 0,25 M de sacarosa en PBS y 20% de FBS). Finalmente los ovocitos fueron lavados dos veces en medio TCM % de FBS antes de ser transferidos al medio de maduración, momento en el cual se valoró la supervivencia morfológica. Técnica de Vitrificación en Pajuela Estirada Abierta (OPS): Se utilizaron pajuelas de 0,25 ml. Estas se colocaron en una plancha de calentamiento a 90 ºC, durante 30 segundos, para ablandar el plástico permitiendo estirar la pajuela por ambos extremos de manera horizontal, logrando disminuir su diámetro interno a la mitad del inicial. Posteriormente se cortaron en los extremos más delgados y se esterilizaron con etanol al 70% y luz ultravioleta. Se cargaron a la pajuela por capilaridad, 10 COC`s contenidos en 20 µl de solución crioprotectora (Hurtt et al. 2000). Técnica de Vitrificación en Microgota (MG): Se utilizó la técnica descrita por Kim et al. (2007), con algunas modificaciones, se dejó caer en N 2 L 20 µl de solución vitrificadora, la cual contenía 10 COC s madurados in vitro. Este volumen al congelarse forma un esfera que inmediatamente se colocó en un tubo criogénico de 20 µl y se almacenó sumergido en N 2 L. EVALUACIÓN DE LA PROGRESIÓN MEIÓTICA Los ovocitos fueron despojados de las células del cúmulus mediante agitación mecánica y fijados en una mezcla de metanol-ácido acético en proporción 3:1 durante al menos 24 h a 4 ºC y se tiñeron con aceto-orceína al 1,1%. Luego se evaluó la maduración nuclear en un microscopio de contraste de fases (Olympus CX31, EUA; 400X), clasificándolos según el estadio meiótico alcanzado en: maduros (MII o Telo I) o inmaduros (anafase I, metafase I, condensación cromosómica y VG). Aquellos ovocitos que no pudieron ser incluidos en ninguno de los grupos anteriormente nombrados fueron clasificados como degenerados. EVALUACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA OVOCITARIA La supervivencia ovocitaria, se determinó sobre la integridad de la membrana, zona pelúcida y citoplasma después de la desvitrificación. Esta clasificación morfológica se validó a través del microscopio estereoscópico, y

6 202 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. se confirmó a través de una tinción vital con ioduro de propidio a una concentración de 0,2 mg/ml en PBS (Men et al. 2003). Los ovocitos fueron examinados en microscopio de fluorescencia con un filtro de 610 nm para captar la emisión del ioduro de propidio, considerándose como viables los que no pudieron ser penetrados por el ioduro de propidio. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Las diferencias en las de tasa de progresión meiótica y supervivencia de los ovocitos bovinos entre los diferentes grupos experimentales fueron analizadas por medio de las pruebas de χ 2 bajo la aplicación del paquete estadístico SAS (2001), y se consideraron diferencias significativas aquellas P < 0,05. RESULTADOS Se valoró un total de 341 ovocitos, 246 de los cuales fueron vitrificados luego de ser madurados in vitro. En la Tabla 1 se presentan los datos referentes a la progresión meiótica. El porcentaje de ovocitos inmaduros no difirió entre los tres grupos experimentales (Cx: 15,46%; OPS: 21,62%; MG: 23,8%), como tampoco resultaron diferentes los porcentajes de ovocitos degenerados (Cx: 10,3%; OPS: 22,97%; MG: 7,69%), resultando por tanto tasas de maduración similares: Cx 74,22%, OPS 54,76%, MG 55,4%. Tabla 1. Progresión meiótica de ovocitos bovinos vitrificados. Variable Tratamiento C x MG OPS Número Total de Ovocitos Número de Ovocitos Madurados MII + CP Telo I Total Ovocitos Madurados (%) 72(74,22) 46(54,76) 41(55,40) Número de Ovocitos Inmaduros Ana I MI CCII VG Total Ovocitos Inmaduros (%) 15(15,46) 20(23,80) 16(21,62) Número Ovocitos Degenerados 10(10,30) 18(21,42) 17(22,97) MG = microgota, OPS = open pulled straw, MII + CP = Metafase II + Corpúsculo, TeloI = Telofase I, AnaI = Anafase I, MI = Metafase I, CCII = Condensación cromosómica II y VG = Vesícula Germinal.

7 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 203 En la Tabla 2 se presentan las tasas de supervivencia luego de la vitrificación ovocitaria, analizadas bajo microscopio estereoscópico y su corroboración mediante la tinción con ioduro de propidio. Al realizar la valoración morfológica rutinaria bajo microscopio estereoscópico, la tasa de ovocitos degenerados en el grupo control no resultó ser estadísticamente diferente de la observada en el grupo de ovocitos vitrificados mediante la técnica de OPS (3,15 vs. 7,14%, respectivamente). Sí se observó una diferencia estadísticamente significativa en relación al porcentaje de ovocitos degenerados evaluados con la técnica de MG (3,15 vs. 20,75%). Entre los grupos de ovocitos vitrificados la tasa de degeneración fue estadísticamente diferente (OPS: 7,14 vs. MG: 20,75%). Tabla 2. Supervivencia morfológica de ovocitos bovinos vitrificados. Total de Ovocitos Valoración Cx 95 Vitrificados (OPS) Vitrificados (MG) Ovocitos óptimos (%) Ovocitos degenerados (%) Óptica 92 (96,84) 3 (3,15) a I.P 88 (92,63) 7 (7,36) A Óptica 130 (92,85) 10 (7,14) a I.P 111 (79,28) 29 (20,71) B Óptica 84 (79,24) 22 (20,75) b I.P 87 (82,07) 19 (17,92) B (%) a, b, A, B : Valores en la misma columna con diferentes superíndices difieren significativamente (P < 0,05); IP = Ioduro de propidio. En relación a la tasa de supervivencia ovocitaria valorada utilizando la tinción con ioduro de propidio, si se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los ovocitos vitrificados y los ovocitos control. El porcentaje de ovocitos degenerados valorados mediante esta tinción resultó ser similar entre los grupos de ovocitos vitrificados (Cx 7,36%; OPS 20,71%; MG 17,92%). El porcentaje de ovocitos óptimos para continuar el desarrollo luego de la vitrificación valorados mediante microscopía estereoscópica y de fluorescencia no difiere en el grupo de ovocitos vitrificados mediante la técnica OPS (92,85 vs. 79,24%), pero si se observaron diferencias estadísticamente significativas entre dichos valores para el grupo control y el grupo de ovocitos vitrificados mediante la técnica de MG (Cx: 96,84 vs. 95,85%; MG: 79,24 vs. 82,07%).

8 204 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. DISCUSION Con el propósito de superar los efectos de los diversos pasos involucrados en los protocolos de congelación-descongelación sobre la estructura del ovocito (Rodríguez et al. 2004), se ha planteado la vitrificación como uno de los métodos más prometedores para solucionar los problemas que conlleva el criopreservar este tipo de célula (Massip 2003). La vitrificación ha permitido aumentar la velocidad de los cambios de temperatura, lo que ofrece ciertas ventajas para la congelación, como lo son la disminución de la concentración de los crioprotectores y además el paso más rápido por la zona de temperatura crítica, lo que produce menos daños por enfriamiento (Silva y Berland 2004). Sin embargo, los ovocitos mamíferos siguen siendo una de las células más difíciles de criopreservar (Diez et al. 2005). Aun así, en la actualidad, se han vitrificado ovocitos de varias especies animales: rata (Chen et al. 2004), cerda (Men et al. 2005), búfala (Wani et al. 2004), yegua (Maclellan et al. 2002), cabra (Beging et al. 2003), oveja (Al-Aghbari y Menino 2002, Dattena et al. 2004), vaca (Rodríguez 2004, Diez et al. 2005, Albarracín et al. 2005) y humano (Boiso y Martí 1997, Chen et al. 2004). Se sabe que el estadio de metafase II (MII) es el óptimo al evaluar el proceso de maduración ovocitaria in vitro. Este se da por completado cuando se observa el mayor porcentaje de ovocitos en MII. En el presente trabajo, la maduración del ovocito se evaluó a través de la tinción in toto evaluando los ovocitos en estadio de Telofase I y la presencia del corpúsculo polar correspondiente a ovocitos en MII. El grupo control (ovocitos frescos), presentó una tasa de maduración de 74,22%, similar a la alcanzada por los ovocitos vitrificados OPS y MG. En 2005, Park et al., obtuvieron un 52,75% de aquellos ovocitos que lograron alcanzar el estadío de MII después de rasuración in vitro (MIV); Warzych et al. (2007), obtuvieron un porcentaje de 68,7%. Kim et al. (2007) encontraron un porcentaje de 71,2% y Báez et al. (2008) obtuvieron una tasa de 61,36%, pudiéndose observar que estos valores son similares a los obtenidos en el presente estudio. Coincidiendo con los resultados de este estudio, Rodríguez et al. (2004), estudiando la influencia del estadio de maduración de ovocitos bovinos durante el proceso de congelación, obtuvieron tasas de maduración en el grupo control y el de vitrificados luego de ser madurados in vitro similares (52,75% y 39,61%, respectivamente; P < 0,01). Al igual que los resultados obtenidos por Báez et al. (2008), mostrando un 61,36% y 52,85%, para el grupo control y vitrificados MIV, respectivamente.

9 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 205 A pesar de los numerosos reportes y de resultados exitosos (Hochi et al. 1998), la efectividad de los métodos de vitrificación entre los que se incluyen el uso de pajuelas, no ha llegado a alcanzar un nivel satisfactorio (Ambrosini et al. 2006). Los ovocitos sufren daños morfológicos y funcionales durante la vitrificación. El grado de daño depende de factores en los que se incluyen el tamaño, forma y contenido lipídico de la célula, la permeabilidad de la membrana y la calidad y sensibilidad del ovocito. De todos estos, quizás el de mayor impacto es la especie donadora, estadio de desarrollo y origen (Vajta y Kuwayama 2006). Si bien el objetivo de la vitrificación es minimizar el daño que ocasiona el proceso de criopreservación y permitir a la célula a continuar con su potencial de desarrollo, es conveniente revisar las técnicas de evaluación de supervivencia, en especial la de ovocitos. Se sabe que la supervivencia del ovocito bovino difiere de acuerdo a la duración de exposición del ovocito al crioprotector, la concentración y la forma de remover el mismo (Fabbri et al. 2000). Normalmente una vez que los ovocitos son desvitrificados y equilibrados, son evaluados bajo microscopio estereoscópico considerándose que han sobrevivido al proceso de vitrificación aquellos que no presentan lisis celular, con una membrana celular intacta y citoplasma homogéneo. Los ovocitos que no son incluidos en la descripción anterior son clasificados como degenerados (Otoi et al. 1995). Men et al. (2003) y Bogliolo et al. (2007) sugieren que una forma más objetiva de evaluar la viabilidad ovocitaria después de la vitrificación, debe ser determinada sobre la integridad de la membrana, zona pelúcida y citoplasma, a través de una tinción vital con ioduro de propidio. Al realizar la evaluación de la supervivencia morfológica bajo microscopio estereoscópico, el método de vitrificación OPS no causó una degeneración mayor a la observada tras la maduración in vitro. No así el método de la microgota que mostró una tasa mayor de degeneración que la del grupo control, pero similar a la observada en los ovocitos vitrificados en pajuelas estiradas abiertas. Al corroborar la valoración de la supervivencia ovocitaria mediante la tinción vital con ioduro de propidio, se observa claramente que el choque térmico la afecta negativamente, indistintamente del método de vitrificación empleado. En el presente estudio, la tasa de supervivencia de los ovocitos vitrificados en OPS, independientemente del método utilizado para su valoración, fue similar a la obtenida por Men et al. (2003) en la que emplea la

10 206 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. misma técnica, contrario a las tasas obtenidas en la técnica de MG. Al comparar la tasa de supervivencia ovocitaria luego de la maduración in vitro no se observan diferencias en virtud de la técnica utilizada para su valoración. Tampoco se observan diferencias en el porcentaje de ovocitos óptimos luego de la vitrificación en microgotas. Cuando los ovocitos fueron vitrificados en pajuelas estiradas abiertas, la tasa de supervivencia luego del choque térmico difirió dependiendo de la técnica de valoración utilizada, siendo mayor la proporción de ovocitos clasificados como degenerados bajo microscopio estereoscópico que cuando se utilizó la tinción vital con ioduro de propidio. En cualquier discusión acerca de la evaluación de la supervivencia del ovocito, se debe enfatizar que la normalidad no puede ser confirmada por medio de una evaluación morfológica. Son varios los autores que emplean la tinción con ioduro de propidio para valorar los efectos de la vitrificación en embriones bovinos (Mucci et al. 2006, Cesari et al. 2006, Lim et al. 2007), siendo pocas veces implementada en ovocitos. La valoración de la supervivencia ovocitaria bajo microscopio estereoscópico resulta ser una metodología bastante sencilla y muy fácil de incluir en la rutina del laboratorio. La tinción vital con ioduro de propidio ofrece una evaluación de la supervivencia más objetiva, pero se requiere tener a disposición la microscopia de fluorescencia, aparte de que involucra la pérdida de una muestra de ovocitos. Basados en la valoración morfológica de la supervivencia, los ovocitos madurados in vitro sobrellevan mejor la vitrificación en pajuelas estiradas abiertas que en microgotas. Luego de la tinción vital estas diferencias desaparecen, por lo que recomendar una u otra técnica resultaría precipitado. Men et al. (2002), vitrificaron ovocitos bovinos madurados in vitro usando OPS, obteniendo una tasa de supervivencia de 88,41%. En el estudio realizado por Luna et al. (2001), también obtuvieron tasas de supervivencia morfológica similares en ovocitos bovinos vitrificados por OPS a las 0 y 22 h de MIV (71,8 72,6%, respectivamente). Entre un 70 97,5% fueron las tasas encontradas por Hou et al. (2005), en las que vitrificaron ovocitos bovinos MIV con OPS. Por otro lado, Mavrides y Morroll (2002) vitrificaron ovocitos de la misma especie empleando cryoloop, encontrando una tasa de supervivencia de 90,5%. Recientemente, Kim et al. (2007) evaluaron el efecto de la vitrificación con el método de MG sobre el potencial de maduración de ovocitos bovinos encontrando tasas de supervivencia entre 60,9 84,0%.

11 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 207 El desarrollo de nuevas estrategias para reducir de diversas maneras el stress asociado con la criopreservación es fundamental para lograr una mejor comprensión de los principales cambios responsables de las bajas tasas de supervivencia tras la descongelación. Con estos conocimientos, se espera que el crioalmacenamiento de ovocitos llegue a ser una técnica reproductiva totalmente confiable en el futuro cercano. Es claro que no hay una necesidad urgente de implementar la congelación de ovocitos entre las tecnologías de reproducción asistida que se utilizan en la actualidad. Siempre está la poderosa metodología de la congelación de embriones como alternativa confiable. No se trata de transformar la congelación ovocitaria en un sustituto de la congelación de embriones, pero si de darle su destino propio. Hay áreas específicas en las que la congelación ovocitaria puede ser válida. En producción animal clásica, los productores pudieran preservar líneas femeninas de alto valor genético, comercializar ovocitos más que embriones en los que el padre ya ha sido escogido. En especies en peligro de extinción se podría conservar el material genético femenino de esos animales vulnerables. En la producción y mantenimiento de líneas de animales transgénicos, cuyas capacidades reproductivas son pobres y más aun tomando en cuenta que la producción de estas líneas es un proceso lento y costoso. Cuando esté completamente optimizada, la criopreservación ovocitaria tendrá múltiples aplicaciones. AGRADECIMIENTOS Los autores expresan su agradecimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (CONDES) de la Universidad del Zulia por el financiamiento otorgado para la realización de este trabajo (CC ). LITERATURA CITADA AL-AGHBARI, A. Y A. MENINO Survival of oocytes recovered from vitrified sheep ovarian tissues. Animal Reproduction Science 71: ALBARRACÍN, J., R. MORATÓ, C. ROJAS Y T. MOGAS Effects of vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertad and adult bovine oocytes. Theriogenology 63: AMBROSINI, G., A. ANDRISANI, E. PORCU, E. REBELLATO, A. REVELLI, D. CASERTA, E. COSMI, R. MARCI Y M. MOSCARINI Oocytes cryopreservation: State of art. Reproductive Toxicology 22: ASADA, M., S. ISHIBASHI, S. IKUMI Y Y. FUKUI Effect of polyvinyl alcohol (PVA) concentration during vitrification of in vitro matured bovine oocytes. Theriogenology 58: BÁEZ, F., L. HERNÁNDEZ Y P. VILLAMEDIANA Estudio estructural del huso meiótico de ovocitos bovinos vitrificados. Revista Científica 3:

12 208 Báez-Contreras et al. [Bol. Centro Invest. Biol. BEGING, I., B. BHATIA, H. BALDASSARRE, A. DINNYES Y C. KEEFER Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2- to 4-cell embryos using the cryoloop (CLV) and solid-surface vitrification (SSV) methods. Theriogenology 59(8): BOGLIOLO, L., F. ARIU, S. FOISA, I. ROSATI, M. ZEDDA, G. LEONI, S. SUCCU, S. PAU Y S. LEDDA Morphological and biochemical analysis of immature ovine oocytes vitrified with or without cumulus cells. Theriogenology 68: BOISO, I. Y M. MARTÍ ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO DE OVOCITOS madurados in vitro. ASEBIR 2: CESARI, A., G. KAISER, N. MUCCI, A. MUTTO, A. VINCENTI, M. FORNES Y R. ALBERIO Integrated morphophysiological assessment of two methods for sperm selection in bovine embryo production in vitro. Theriogenology 66: CHEN, C., C. WANG, W. TSAI, L. HSIEH, H. WANG Y Y. SOONG Evaluation of meiotic spindles in thawed oocytes after vitrification using polarized night micoscpy. Fertility and Sterility 82(3): DATTENA, M., C. ACCARDO, S. PILICHI, V. ISACHENKO, L. MARA, B. CHESSA Y P. CAPPAI Comparison of different vitrification protocols on viability after stransfer of ovine blastocysts in vitro produced and in vivo derived. Theriogenology 62: 481. DÍEZ, C., P. DUQUE, E. GÓMEZ, C. HIDALGO, C. TAMARGO, A. RODRÍGUEZ, L. FERNÁNDEZ, S. DE LA VEGA, A. FERNÁNDEZ, N. FACAL Y M. CARBAJO Bovine oocyte vitrification before or after meiotic arrest: effects on ultrastructure and developmental ability. Theriogenology 64: FABBRI, R., E. PORCU, T. MARSELLA, M. PRIMAVERA, G. ROCCHETTA, P. CIOTTI, O. MAGRINI, N. SARACCHIOLI, S. VENTUROLI Y C. FLAMIGNI Thechnical aspects of oocyte cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology 169: FUKU, E., L. XIA Y B. DOWNEY Ultraestructural changes in bovine oocytes cryopreserved by vitrification. Cryobiology 32: HOCHI, S., K. ITO, M. HIRABAYASHI, M. UEDA, K. KIMURA Y A. HANADA Effect of nuclear stages during in vitro maturation on the survival of vitrified-warmed bovine oocytes. Theriogenology 49: HOU, Y., Y. DAI, S. E. ZHU, Z. HUA-BIN, T. Y. WU, G. C. GONG, H. WANG, L. WANG, Y. LIU, R. LI, R. WAN Y N. LI Bovine oocytes vitrified by the open pulled straw method and used for somatic cell cloning supported development to term. Theriogenology 64: HURTT, A., F. LANDIM-ALVARENGA, G. SIEDEL Y E. SQUIRES Vitrification of immature and mature equine and bovine oocytes in an ethylene glycol, ficoll and sucrose solution using open-pulled straws. Theriogenology 54: ISACHENKO, V., C. SOLER, E. ISACHENKO, F. SÁNCHEZ Y V. GRISHCHENKO vitrification of inmture porcine oocytes: Effects of lipid droplets, temperature, cytoskeleton, and addition and removal of cryoprotectant. Cryobiology 36:

13 Vol. 43, 2009] Viabilidad de Ovocitos Bovinos 209 KIM, D. H., S. W. PARK, S. W. KIM, I. S. HWANG, B. C. YANG, G. S. IM., H. J. CHUNG, H. W. SEONG, S. J. MOON Y B. S. YANG Vitrification of inmature oocytes by microdrop method. J. Reproduction and Development 53: LIM, J. M., Y. FUKUI Y H. ONO Developmental competence of bovine oocytes frozen at various maturation stages followed by in vitro maturation and fertilization. Theriogenology 37: LIM, K., G. JANG, K. KO, W. LEE, H. PARK, J. KIM, S. LEE, W. HWANG, B. LEE Y S. KANG Improved in vitro bovine embryo development and increased efficiency in producing viable calves using defined media. Theriogenology 67: LUNA, H. S., I. FERRARI Y R. RUMPF Influence of stage of maturation of bovine oocytes at time of vitrification on the incidence of diploid metaphase II at completion of maturation. Animal Reproduction Science 68: MACLELLAN, L., E. CARNEVALE, M. COUTINHO DA SILVA, C. SCOGGIN, J. BRUEMMER Y E. SQUIRES Pregnancies from vitrified equine oocytes collected from supper-stimulated and non-stimulated mares. Theriogenology 58: MARQUANT, B., M. GERARD, A. SOLARI Y C. THIBAULT In vitro culture of bovine egg fertlized either in vitro or in vivo. Reprod. Fert. Develop. 29: MARTINO, A., N. SONGSASEN Y S. LEIBO Development into blastocysts of bovine oocytes cryopreserved by ultra-rapid cooling. Biology of Reproduction 54: MASSIP, A Cryopreservation of bovine oocytes: Current status and recent developments. Reprod. Nutr. Dev. 43: MATSUMOTO, H., J. JIANG, T. TANAKA, H. SASADA Y E. SATO Vitrification of large quantities of immature bovine oocytes using nylon mesh. Cryobiology 42: MAVRIDES, A. Y D. MORROLL Cryopreservation of bovine oocytes: is cryoloop vitrification the future to preserving the female gamete?. Reprod. Nutr. Dev. 42: MAVRIDES, A. Y D. MORROLL Bypassing the effect of zona pellucida changes on embryo formation following cryopreservation of bovine oocytes. European J. Obstetrics & Gynecology and Reproduction Biology 118: MEN, H., R. MONSON, J. PARRISH Y J. RUTLEDGE Degeneration of cryopreserved bovine oocyte vía apoptosis during subsequent culture. Cryobiology 47: MEN, H., R. MONSON Y J. RUTLEDGE Effect of meiotic stages and maturation protocols on bovine oocyte s resistance. Theriogenology 57: MEN, H., Y. AGCA, E. CRITSER Y J. CRITSER Beneficial effects of serum suplementation during in vitro production of porcine embryos on their ability to survive cryopreservation by open puled straws vitrification. Theriogenology 64: MUCCI, N., J. ALLER, G. KAISER, F. HOZBOR, J. CABODEVILA Y R. ALBERIO Effect of estrous cow serum during bovine embryos culture on blastocyst

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