TIENE SENTIDO LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES EN LA ERA DE LA VITRIFICACIÓN?

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1 TIENE SENTIDO LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES EN LA ERA DE LA VITRIFICACIÓN? Migueles B, Hebles M, Sánchez P, Sánchez F. Laboratorio de Reproducción Asistida Clinicas Ginemed INTRODUCCION VITRIFICACIÓN: palabra que hace 10 años apenas tenía cabida en el vocabulario de todos aquellos que nos dedicábamos a la reproducción. La rapidez con la que nos hemos ido adaptando a las diferentes técnicas de reproducción ha sido paralela a la eficiencia de las mismas a la hora de aplicarlas en beneficio de nuestras pacientes. Sin embargo una de las causas del recelo inicial al uso de la vitrificación, en detrimento de la congelación, estaba justificada por la elevada concentración de crioprotectores, esto supuso el retraso en el uso de la técnica a pesar de que su desarrollo haya sido paralelo al de la congelación lenta. Definimos la vitrificación como el proceso físico de solidificación de una solución a bajas temperaturas sin la formación de cristales de hielo (1). Desde la publicación de los primeros resultados tras la criopreservación embrionaria mediante vitrificación (2), la técnica ha pasado de ser experimental a ser la técnica de elección de la mayoría de los centros de reproducción. Los excelentes resultados publicados por los diferentes grupos (3,4,5), nos animó a poner el protocolo en marcha en nuestro centro a partir enero del año 2007 obteniendo resultados similares a los publicados. Estas elevadas tasas de supervivencia, evolución posterior y embarazo, se han traducido en un aumento del rendimiento de los ciclos. DESCRIPCION DE LA TÉCNICA El proceso de vitrificación se realizó mediante el protocolo descrito en 2009 (6) mediante la técnica del cryotop, tanto para ovocitos, embriones ó blastocistos. Se realizó un equilibrado en medio ES: compuesto por DMSO (7,5%) y Etilenglicol (7,5%) en medio Ham F10 suplementado con Albúmina (SAGE) al 10, En un periodo de tiempo de 5-15 min. Transcurrido este tiempo pasaremos al medio de vitrificación VS: compuesto por DMSO (15%) y Etilenglicol (15%) en han F10 suplementado con albúmina (Sage) al 10%, en este medio el tiempo debe de ser menor a un minuto. A continuación procederemos a cargar los óvulos, embriones, ó bastos en el cryotop. Para el warming de los óvulos, embriones ó blastocistos sacamos el cryotop del nitrógeno líquido y lo introducimos inmediatamente en 1ml de medio TS a 37ºC durante menos de un minuto: 1M de sucrosa en Ham F10 suplementado con Albúmina al 10%. En este medio se alcanza la tasa de recalentamiento adecuada en torno a ºC/min. A continuación pasaremos al medio de dilución DS con una concentración de 0,5 de sucrosa por un tiempo de 3 minutos. para finalizar, pasaremos los óvulos, embriones y

2 blastocistos a la placa de cultivo. COMPARATIVA DE LA VITRIFICACION CON CONGELACIÓN LENTA: (Migueles and cols: Revista Iberoamericana de fertilidad; vol 26, nº 6, 2009) Tasas obtenidas en Clínicas Ginemed ICSI+VITRIFICACION ICSI+ VITRIFICACION SUPERVIVENCIA EVOLUCION EMBARAZO 96,2% 76,3% 46,1% TASAS CON DIFERENTES MEDIOS SUPERVIVENCIA EVOLUCION EMBARAZO ICSI+VITRIFICACION A 92,8% 76,7% 51,7% ICSI+VITRIFICACION B 96,9% 75,6% 49,2% TASA DE EMBRIONES REVITRIFICADOS (mas de una vitrificación) (Migueles y cols; Rev. Iberoamericana de fertilidad 2012) SUPERVIVENCIA EMBRIONES REVITRIFICADOS 92,6% CUANDO VITRIFICAMOS EMBRIONES?? -Embriones excedentes de un ciclo de FIV-ICSI -En caso de transferencias diferidas -Cuando tenemos riesgo de hiperestimulación -En aquellos casos en los que tenemos un respuesta muy baja y necesitamos acumular embriones (por ejemplo PGD, mala respuesta

3 -En aquellos casos en los que por cualquier motivo hay que cancelar la transferencia (motivos personales, mala calidad endometrial) -Pacientes con una baja respuesta que acumulan embriones en varios ciclos para hacer una transferencia de mas de un embrión VITRIFICACION DE ÓVULOS ( a tener en cuenta) Aunque la vitrificación a día de hoy es la técnica de elección en la mayoría de los laboratorios de reproducción, si es necesarion recalcar que es una técnica bastante delicada donde es primordial la experiencia del embriólogo que la realiza. A diferencia de los embriones que en diferentes estadíos de división no se ven afectados por la vitrificación los ovocitos són mucho mas susceptibles de daño. Este daño puede afectar al ovulo tanto a nivel de proteinas del huso (muy susceptibles a los cambios de temperatura) ya que este daño no se traduce en una alteración de la tasa de supervivencia ni en la de fecundación, pero si en la tasa de evolución embrionaria. El otro punto en el que se puede ver afectado el óvulos por la vitrificación es a nivel de la reorganización de las mitocondrias, (ya que por ejemplo una microvacuolización en el óvulo postwarming podría deberse a un exceso de sucrosa. Por último otro factor a tener en cuenta a la hora de la preservación de los óvulos es las características de la paciente que va a preservar: edad, niveles hormonales, respuesta. En la gráfica siguiente se ilustra perfectamente el número de óvulos a vitrificar en función de la edad de la paciente y el resultado obtenidos post-warming. TASAS DE SUPERVIVENCIA EN VITRIFICACIÓN DE ÓVULOS (publicadas) (Aylin Pelin Cil and cols. Fertil & Steril Agosto 2013) Las tasas registradas en este metaanálisis són diferentes, pero debemos notar que en vitrificación éstas mejoran cuanto más cercana a la actualidad es la fecha en que se realizan los estudios ya que la técnica ha ido mejorando en los últimos años. Por otro lado, también debemos tener en cuenta la calidad del material con el que estamos trabajando; en el mismo trabajo se relaciona la edad de la paciente con el número de óvulos que hay que desvitrificar para la obtención de embarazo.

4 TASAS VITRIFICACIÓN DE ÓVULOS GINEMED Ovulos donante Ovulos propios Supervivencia 92,6% 95,4% El protocolo usado en nuestro centro es el cryotop al igual que para los embriones, descrito en (6). QUE HACER? Tras comparar los resultados registrados mediante la criopreservación tanto en embriones como en óvulos sólo nos queda decidir cual es el momento mas adecuado para la aplicación de la técnica. Actualmente las indicaciones para vitrificar óvulos en los pacientes que acuden a nuestro centro de reproducción són básicamente 2: - aquellas pacientes que solicitan una preservación de fertilidad (ya sea por la situación social actual, falta de pareja, desarrollo profesional, ó por tratamiento con quimioterápicos) - aquellas pacientes que por convicciones religiosas no desean tener embriones criopreservados. - aquellas pacientes que tuvieron un hijo en un primer ciclo y que en un segundo no desean que les queden embriones criopreservados. -pacientes que el día de la punción tienen problemas con la recogida de la muestra. - Malas respondedoras que vitrifican en ciclos naturales. CUANDO VITRIFICAMOS (diferencia óvulos-embriones) Vitrificación de óvulos No tiene implicaciones morales A tener en cuenta la calidad del óvulo Mucho mas frágiles Podemos encontrarnos con resultados no esperados Se pueden acumular óvulos mediante ciclo natural para transferir Vitrificación de embriones Problemas en caso de separación de la pareja Mucho mas estables Tenemos una experiencia en como irá el ciclo Se pueden acumular mediante ciclo natural

5 CONCLUSIÓN La vitrificación es una técnica segura, eficaz y reproducible en cualquiera de los estadíos en los que se realiza. Debemos tener en cuenta entre otros parámetros, la calidad del material con el que estamos trabajando y la experiencia del laboratorio que lo realiza ya que con la misma técnica podemos obtener diferentes resultados en diferentes manos, es por ello que el entrenamiento es primordial a la hora de la realización de la técnica. Una vez que hemos visto que la vitrificación de óvulos y embriones es una técnica totalmente reproducible y eficaz desde óvulos a blastocistos, la decisión del momento en que realizarla ó como aplicarla en las pacientes debe ser el único parámetro en el cual debemos detenernos a la hora de tomar una decisión. Como en la mayoría de los tratamientos de reproducción debemos individualizar cada uno de los casos que nos llegan a la consulta, los parámetros hormonales, la previsión de respuesta de la paciente, evolución de un caso previo, evolución de los embriones. En cualquiera de estos casos y mas aún en los que los óvulos pueden ser especialmente valiosos debemos tener en cuenta el no fomentar falsas esperanzas a la paciente respecto al material que criopreserva y explicar claramente a la paciente los pocentajes de éxito que podemos esperar en función de su patología. En la actualidad, la vitrificación de embriones divididos es la técnica de elección en la mayoría de los tratamientos de reproducción ya que ofrece buenos resultados y poca variabilidad ya que sabemos de antemano como es el material que tenemos criopreservado. BIBLIOGRAFÍA:

6 1.Vatja G., Kuwayama M Improving cryopreservation systems. Therigenology, 2006; 65: Rall, WF, Fahy GM,: Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degres C by vitrification. Nature, 1985; 313: Kuwayama M,: Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes abd embryos: the cryotop method. Theriogenology, 2006; 67 (2007) Ana Cobo Ph.D, Masashige Kuwayama, Ph.D, Sonia Pérez, Ph.D, Amparo Ruiz, MD, Antonio Pellicer, MD and José Remohí, MD Comparision of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the cryotop method. 5.Lucena E, Bernal DP, Lucena C, Rojas A, Moran A, Lucena A. Sucessful ongoing pregnancies afther vitrification oocytes. Fertil Steril 2006; 85: Migueles B, Dorado M, Hebles M, González M, Duvison L, Nuñez G, Sánchez P, Sánchez F.La vitrificación; nueva era en criopreservación embrionaria. Revista Iberoamericana de Fertilidad. Vol 26 nº 6 Nov-Dic Migueles B, Hebles M, Dorado M, González M, Aguilera L, Sánchez P, Sánchez F. El número de vitrificaciones no afecta a la viabilidad del embrión: A propósito de un caso. Revista Iberoamericana de fertilidad. Vol 29 nº1 (Enero- Febrero-Marzo Aylin Pelin Cil, MD, Heejung Bang, Ph.D and Kutluk Oktay, M.D. F.A.C.O.G. Age-specific probability of live birth with oocyte cryopreservation: an individual patient data meta-analysis. Fertil & Steril vol 100, nº2 Agosto