RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS
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- Natividad Figueroa Valdéz
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1 NMX-F ALIMENTOS PARA HUMANOS. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS A PARTIR DE C 6 POR CROMATOGRAFÍA DE GASES EN ACEITES Y GRASAS. FOODS FOR HUMANS. OILS AND FATS. DETERMINATION OF FAT ACIDS COMPOSITION FROM C 6 BY GASES CHROMATOGRAPY. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS. PREFACIO En la elaboración de la presente Norma, participaron las siguientes Empresas e Instituciones: Cámara de Productos Alimenticios Elaborados con Leche. Cámara de la Industria de Aceites y Mantecas Comestibles. Asociación Nacional de Industriales de Aceites y Mantecas Comestibles, A.C. Instituto Mexicano de Aceites, Grasas y Proteínas, A.C. Fabrica de Jabón La Corona, S.A. de C.V. Leche Industrializada CONASUPO, S.A. de C.V. Compañía Nestle, S.A. de C.V. 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIÓN Esta Norma establece el método de prueba para determinar la composición de ácidos grasos en grasas y aceites animales y vegetales. 2. FUNDAMENTO Este método se basa en los principios de la cromatografía de gases, y consiste en la inyección de los ésteres metílicos de los ácidos grasos de grasas y aceites, en el inyector de un cromatógrafo de gases, en el que son vaporizadas y transportadas por un gas inerte a través de una columna empacada o capilar, con un líquido de partición que presenta solubilidad selectiva con los componentes de la muestra ocasionando su separación. Los componentes que fluyen de la columna pasan uno a uno por el detector, el cual genera una señal eléctrica proporcional a su concentración, la que es transformada por el registrador (o integrador) en una gráfica de concentración contra tiempo llamada cromatograma. 3. REACTIVOS Y MATERIALES 3.1 Reactivos RECOPILADO POR: EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico, a menos que se indique otra cosa. Cuando se hable de agua, se debe entender agua destilada.
2 Solución metanólica de trifluoruro de boro, con una concentración de 10 a 14% (véase A.1). Solución metanólica de hidróxido de sodio 0.5 N. Heptano, pureza adecuada para cromatografía de gases. Sulfato de sodio anhídro, granular. Solución saturada de cloruro de sodio. Nitrógeno u otro gas inerte. Patrones de referencia de ésteres metílicos de ácidos grasos, (véase Catálogo de Applied Science, Supelco, Analab, Polyscience). 3.2 Materiales Matraces de reacción de fondo plano de 50 a 125 cm 3 de cuello esmerilado con diámetro interno de 19/38 ó 24/40 o equivalente. Refrigerante de agua tipo Liebig o West con chaqueta de 20 a 30 cm y diámetro en la unión de 19/38 ó 24/40 ó equivalente. Jeringas para inyección de muestra de 5 a 10 µl, para cromatografía de gases. Material común de laboratorio. 4. APARATOS Y EQUIPO 4.1 Cromatógrafo de gases. Cualquier aparato que utilice columna empacada y detector de ionización de flama (véase A.2) y que dé la eficiencia y resolución descrita en Sistema de inyección. Debe tener el menor espacio muerto posible y debe poder ser calentado a una temperatura de 293 a 323 K (20 a 50 C) más alta que la columna Horno. El horno debe ser capaz de calentar la columna al menos a 220 C y de mantener la temperatura constante con una variación máxima de ± 1 C. Si se emplea programa de temperatura, deberán utilizarse columnas gemelas o aparatos con compensación electrónica de línea base. 4.2 Columna empacada Columna. La columna debe ser construida de vidrio o acero inoxidable (véase A.3). Longitud: 1 a 3 m Diámetro interno: 2 a 4 mm Empaque Soporte. Tierra diatomácea, lavada con ácido y silanizada, con el tamaño de malla siguiente:
3 Para tubo de 2 mm diámetro interno 80/100 ó 100/120 mallas. Para tubo de 4 mm diámetro interno 60/80 ó 80/100 mallas. Fase estacionaria. Succinato de dietilenglicol (DEGS). La fase estacionaria debe constituir del 5 al 20 % del empaque Preparación de la columna Reactivos Acetona Succinato de dietilenglicol (DEGS) Material y equipo Lana de vidrio silanizada Bomba de vacío Baño de hielo Baño María Evaporador rotatorio. Balanza analítica con precisión de g Impregnado del soporte con la fase estacionaria. Determinar una masa de 4 g de DEGS en un matraz de fondo redondo de 500 cm 3 añadir aproximadamente 200 cm 3 de acetona; disolver. Agregar 16 g de soporte (verificando que sea del tamaño de malla correspondiente); agitar por rotación y eliminar las burbujas haciendo vacío durante 5 min. Conectar el matraz a un evaporador rotatorio y hacerlo girar varios minutos antes de calentarlo en un baño María a 40 C y de aplicar un ligero vacío. Eliminar el disolvente lentamente evitando la formación de espuma. Cuando el polvo empiece a secarse, aumentar el vacío. Eliminar los últimos residuos de disolvente secando al aire en una cápsula de porcelana o de vidrio. Utilizar únicamente polvo fluido para preparar la columna, verificando nuevamente el tamaño de malla Llenado de la columna. Tapar la salida de la columna con lana de vidrio silanizada y conectar este lado al vacío. Llenar la columna con el polvo preparado, mediante vibraciones y vacío, para obtener una fase estacionaria compacta. Tápese la entrada de la columna con lana de vidrio silanizada apretada, para mantener el polvo en su sitio Acondicionamiento de una columna que se utiliza por primera vez. Conectar la columna al inyector; pasar una corriente de gas inerte a través de ella a un flujo de 20 a 60 cm 3 /min; calentar el horno gradualmente de temperatura ambiente a 210 C aumentando a razón de 1 C/min y mantener a esa temperatura por lo menos 16 h.
4 4.3 Detector Enfriar a temperatura ambiente, conectar al detector y verificar que se tenga una línea base estable en las condiciones de operación. El detector debe ser capaz de ser calentado a una temperatura de 20 a 60 C más alta que la columna. 4.4 Registrador o integrador 4.5 Balanza analítica con precisión de g 4.6 Baño de vapor o parrilla eléctrica con termostato 4.7 Baño de hielo 5. PREPARACIÓN 5.1 Cantidad de muestra. No se requiere de una masa exacta. El tamaño de la muestra es necesario conocerlo sólo para determinar el tamaño del matraz y la cantidad de reactivos que deben usarse, de acuerdo con la siguiente tabulación: Muestra mg Matraz cm 3 NaOH 0.5 N cm 3 BF 3 -HeOH cm Preparación de ésteres metílicos Grasas y aceites Colocar la muestra en un matraz; agregar la solución metanó1ica de NaOH (3.1) y algunas perlas de ebullición. Adaptar el refrigerante y calentar bajo reflujo hasta que los glóbulos de grasa desaparezcan (de 5 a 10 min) Añadir la solución metanó1ica de trifluoruro de boro BF 3 por el extremo superior del refrigerante. Continuar calentando a reflujo hasta la aparición de glóbulos de ésteres, aproximadamente 5 min sin exceder de 10 min para evitar reacciones secundarias. Agregar de 2 a 5 cm 3 de n-heptano por el extremo superior del refrigerante y continuar calentando a reflujo un minuto más Enfriar y añadir por el extremo superior del refrigerante aproximadamente 10 cm 3 de solución saturada de cloruro de sodio NaC1 (3.1); retirar el refrigerante; agitar suavemente y agregar más solución para llevar la fase orgánica al cuello del matraz.
5 Mediante una pipeta recoger de 1 a 1.5 cm 3 de fase heptánica en un tubo que contenga 0.5 g de sulfato de sodio anhídro; se agita y la solución está lista para la inyección. Si es necesario, la solución heptánica se puede guardar varios días bajo una atmósfera de nitrógeno N 2, en el refrigerador Ácidos grasos Colocar la muestra de ácidos grasos en el matraz; agregar la solución de trifluoruro de boro en metanol de acuerdo con la tabla señalada en 5.1 (3.1) y continuar como en CONDICIONES DE OPERACIÓN 6.1 De acuerdo a la longitud y diámetro de la columna y a la cantidad de fase estacionaria, deberán fijarse las siguientes variables, de tal forma que se obtenga una resolución y una eficiencia adecuada. Flujo de aire Flujo de hidrógeno Flujo de gas acarreador Temperatura de la columna Temperatura del detector Temperatura del inyector Tamaño de la muestra de la solución de ésteres metílicos 6.2 Determinación de la eficiencia y resolución Se efectúa el análisis de una mezcla de estearato de metilo y oleato de metilo en proporciones aproximadamente equivalentes, de tal forma que el pico del estearato de metilo sea registrado dentro de los primeros quince minutos después de la inyección, y su altura sea tres cuartas partes de la escala. Calcular el número de platos teóricos n (eficiencia) en relación estearato de metilo, de acuerdo a la siguiente fórmula: n = 16 dr 1 2 a 1 y la resolución R entre estearato y oleato de metilo, por la fórmula: R = 2 a 1 + a 2
6 dr = Es la distancia de retención, medida en mm, a partir de la inyección hasta el máximo del pico del estearato de metilo. a 1 * = Amplitud de la base del estearato, en mm. a 2 * = Amplitud de la base del oleato, en mm. = Es la distancia, en mm entre los máximos de los picos para el estearato de metilo y oleato de metilo. *Nota: La amplitud de la base corresponde a la distancia entre los puntos de intersección de la tangente en los puntos de inflexión de las curvas con la línea base. Las condiciones de operación adecuadas son aquéllas que dan al menos 2000 platos teóricos y una resolución mínima de DETERMINACIÓN 7.1 La muestra para analizar deberá ser de 0.1 a 2 microlitros de la solución de heptano de ésteres metílicos, obtenida de acuerdo a 5.2, que corresponde a una solución aproximadamente al 10%. Si se desea determinar compuestos que se encuentran en cantidades pequeñas y que no se aprecian a la máxima sensibilidad práctica del instrumento se puede concentrar la solución o inyectar mayor cantidad de ella, sin afectar la resolución. 7.2 Inyectar al cromatógrafo una cantidad de muestra de tal forma que el pico mayor no sea atenuado más de 8000 veces (para equipos convencionales). Cuando se use registrador hacer los cambios de atenuación necesarios para mantener los picos dentro de la carta. Anotar cada cambio de atenuación en la misma, para su cuantificación posterior. En caso de cambiar la velocidad de la carta para obtener amplitudes de picos apropiados para su medición, también señalarlo. 7.3 Para la cuantificación es posible emplear programación de temperatura, así como también combinar los dos procedimientos (isotérmico y programación de temperatura) siempre y cuando se emplee un detector de ionización de flama. 8. EXPRESIÓN DE RESULTADOS 8.1 Análisis cualitativo Analizar la mezcla de patrones de referencia de ésteres metílicos de ácidos grasos en las mismas condiciones de operación que las utilizadas para la muestra, y medir las distancias de retención (o tiempos de retención) para los ésteres grasos constituyen y comparar ambos cromatogramas.
7 8.1.2 Otra forma de identificar ésteres metílicos de ácidos grasos, es empleando papel semilogarítmico, construir la gráfica mostrando el logaritmo de la distancia de retención (o tiempo de retención) como una función del número de átomos de carbono de los ácidos; en condiciones isotérmicas, la gráfica para los ésteres de cadena lineal del mismo grado de insaturación debe ser una línea recta. Las gráficas de ésteres metílicos de ácidos grasos de diferente grado de insaturación, aparecen como líneas rectas aproximadamente paralelas. Identificar los picos para la muestra de estas gráficas; si es necesario, por interpolación. 8.2 Análisis cuantitativo Emplear el método de normalización (por ciento relativo de cada componente); de esta manera; asumir que el total de los ésteres metílicos de la muestra está representado en el cromatograma, de tal forma que el total de áreas bajo los picos (sin considerar el pico del solvente), represente el 100 por ciento de los constituyentes (elución total) E1 caso general. En caso de no existir cantidades importantes de componentes menores a C 12, calcular el contenido de un componente dado de la siguiente forma: i % = A i x 100 A i i % = Porcentaje relativo (m/m) del componente i expresado como éster metílico. Ai = Área del pico correspondiente al componente i. A i = Suma de las áreas bajo todos los picos En caso de que existan compuestos menores a C 12, ácidos con grupos secundarios, o cuando se emplee detector de conductividad térmica, se deben emplear factores de corrección para convertir los porcentajes de área de pico en porcentajes de masa. Determinar los factores de corrección, con la ayuda de un cromatograma, derivado del análisis de una mezcla de patrones de referencia de ésteres metílicos de composición conocida, bajo condiciones de operación idénticas a aquellas usadas para la muestra. Para esta mezcla de patrones de referencia: i % = mi x 100 mi
8 i % = Porcentaje relativo (m/m) del componente i. m i = Masa en mg, del componente i. m i = Total de las masas en mg, de todos los componentes. i % = B i x 100 B i i % = Porcentaje relativo (área/área) del componente i. B i = Área del pico correspondiente al componente i. B i = Suma de las áreas de todos los picos. Por lo tanto: Factor de corrección K i = m i x B i B i x m i Determinar los factores de corrección relativos al ácido palmítico K 16 = 1. K i = K i K 16 E1 contenido de cada componente está dado por: % éster = K i x A i x 100 (K i x A i ) % éster = Porcentaje relativo (m/m) del componente i, expresado como éster metílico. APÉNDICE A A.1 Trifluoruro de boro en metanol. Determinar la masa de un matraz de 2 L que contenga 1 L de metanol. Enfriar en un baño de hielo, y con el matraz dentro del baño, burbujear trifluoruro de boro de un cilindro, por medio de un tubo sumergido dentro del metanol hasta que se absorban aproximadamente 125 g. Recomendaciones:
9 a) Trabajar en una campana. b) El trifluoruro de boro debe estar fluyendo antes de ser sumergido en el metanol, para evitar que el metanol se pase al sistema de válvulas del cilindro. c) El reactivo es estable por 2 años. d) Evitar contacto con la piel, ojos y sistema respiratorio. A.2 Se puede utilizar un cromatógrafo de gases con detector de conductividad térmica. En este caso se deben usar los factores de corrección descritos en A.3 Si componentes poliinsaturados con más de tres dobles enlaces estén presentes, éstos pueden descomponerse en una columna de acero inoxidable. 9. REPETIBILIDAD La diferencia entre dos determinaciones realizadas el mismo día, por el mismo analista, con el mismo equipo, en las mismas condiciones sobre la misma muestra, para componentes de concentraciones mayores del 5%, no debe ser mayor de 3% del valor promedio. 10. REPRODUCIBILIDAD La diferencia entre dos determinaciones realizadas en diferentes laboratorios, sobre la misma muestra, en las mismas condiciones, para componentes de concentración mayores del 5%, no debe ser mayor de 10% del valor promedio. 11. BIBLIOGRAFÍA IUPAC, Standard Methods for the Analysis of Oils, fats and Derivatives, sixth Edition, Pergamon Press Preparation of the Fatty Acids Methyl Esters Gas-Liquid Chromatography of Fatty Acids Methyl Esters Horwite W. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists Fourteenth Edition, 1984, Method to Editor Washington, D.C. NMK-K Método de prueba para determinar la composición de ácidos grasos por cromatografía gaseosa. 12. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES Esta Norma concuerda en su totalidad con las Normas de IUPAC y AOAC.
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