Jornadas de actualización: Gestión de la calidad en los laboratorios de análisis de suelos agropecuarios. SAMLA- PROINSA.
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- María Rosa Parra Bustamante
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1 Jornadas de actualización: Gestión de la calidad en los laboratorios de análisis de suelos agropecuarios. SAMLA- PROINSA. Rosario 2011 Cuantificación de la Materia Orgánica del suelo. Método de WALKLEY & BLACK Ing Daniel Carreira. Coordinador de la Red INTA de laboratorios de Suelo, Agua y Material Vegetal RILSAV INTRODUCCIÓN En sentido amplio puede definirse a la Materia Orgánica del suelo (MO) como una larga serie de compuestos carbonados en diferentes estados de degradación y síntesis, provenientes de restos vegetales y animales y de la propia biota que en ella se desarrolla. En su concepción más restringida se asocia al término humus, donde los componentes originales ya no pueden ser identificados debido a que han sufrido una especial transformación in situ, fuertemente condicionada por la matriz del suelo. Los complejos mecanismos por los cuales la MO se relaciona con la fracción mineral del suelo siguen siendo aún hoy poco conocidos pero, sin embargo, no quedan dudas sobre el marcado efecto que ejerce sobre las propiedades físico-químicas. Es sabido que a mayor contenido de MO en el suelo mayor será su reserva de nutrientes, el intercambio catiónico, el almacenamiento de agua útil, la aireación, la capacidad de degradar contaminantes y demás características que definen su calidad y su nivel de productividad. Por otra parte la MO del suelo es un gran reservorio de C de alta residencia. Éstas son razones más que suficiente para que su evaluación siga siendo una rutina básica en los laboratorios y se continúe prestando interés sobre el desarrollo de las técnicas para su análisis. Hay al menos dos caminos posibles para evaluar el contenido de materia orgánica en un suelo. En uno se obtiene por la disminución de la masa de una muestra de suelo seco al ser calcinado, la otra vía es evaluando el contenido de C, por ser uno de los elementos mayoritarios que la conforma. Sin embargo en ambos casos, y por diversos motivos, resulta imposible arribar a un valor cierto del contenido real de la MO en el suelo Los métodos que calcinan a altas temperaturas sobreestiman su valor, dado que junto con la materia orgánica se pierden otros compuestos inorgánicos volátiles, como son los radicales oxidrilos de las arcillas, el agua estructural de los aluminosilicatos, el agua de cristalización de las sales (sulfatos, cloruros, etc) o porque se produzca la descomposición de los carbonatos si estuvieran presentes (Nelson y Sommers, 1996). Por otra parte la cantidad de carbono orgánico (CO) puede cuantificarse con bastante precisión, pero la conversión de éste a niveles de MO debe realizarse siempre a través de un coeficiente empírico que representa el contenido promedio de C en la MO. Ese coeficiente varía marcadamente de un suelo a otro y también dentro del perfil, fundamentalmente por los diferentes compuestos que conforman la MO. Los métodos más difundidos tendientes a evaluar el CO se realizan por combustión directamente en una corriente de O 2 o en fase acuosa mediante un agente oxidante. Los primeros generalmente son más costosos, ya que requieren equipos especiales y son afectados por la presencia de carbonatos en la muestra. Sin embargo son muy utilizados cuando se busca precisión y exactitud en la medida del CO. En cambio aquellos métodos que miden el CO indirectamente a través del consumo de un oxidante son más sencillos y adaptables para trabajos de rutina. La desventaja que tienen es la utilización de reactivos cáusticos y tóxicos y la falta de certeza en el valor de CO dado que requieren de un coeficiente empírico de ajuste o recuperación porque no se logra la oxidación completa de todo el CO. Desde que Ames y Gaither en 1916 demostraron que el carbono orgánico del suelo podía cuantificarse por oxidación con mezcla sulfocrómica, los métodos basados en la combustión húmeda se generalizaron rápidamente. Sobre esta base, Shollenberger (1927), desarrolla una técnica rápida en tubos de ensayos con mezcla sulfocrómica y aplicación de calefacción externa, incorporando al método la valoración del C a través de la titulación del exceso de Cr 6+ con una sal ferrosa. En 1930, Degtjareff presenta una modificación donde utiliza peróxido de hidrógeno previo al agregado de la mezcla sulfocrómica, afirmando que se produce una mejora en el nivel de oxidación del CO. Sin embargo cuatro años más tarde Allan Walkley y Amstrong Black demostrando el error de esa conclusión y
2 desestiman el procedimiento, pero rescatan el hecho de que la disolución del ácido sulfúrico en la solución de peróxido generaba suficiente calor como para lograr un nivel de oxidación aceptable del CO, sin necesidad de calefaccionar. Sobre esta observación presentan una simple pero novedosa modificación a los métodos utilizados hasta ese momento, reemplazando la calefacción externa de la mezcla sulfocrómica por el calor de disolución del ácido sulfúrico. Un año después este método recibió fuertes críticas por parte de la Internacional Society of Soil Science debido a que arrojaba resultados sensiblemente menores y variables de oxidación del carbono orgánico según el tipo de suelo, en comparación con aquellos que utilizaban calefacción externa. Sin embargo una década después, Walkley, basado en la amplia aceptación que había tenido su método, publica un análisis crítico defendiendo la estabilidad del ensayo, siempre y cuando se respetaran las condiciones del procedimiento y se aplicara el factor de recuperación para estimar el CO. Este método, adoptado masivamente por su simplicidad, ha sufrido a lo largo del tiempo innumerables modificaciones, principalmente orientadas a reducir el consumo de reactivos y a mejorar el punto final en la titulación, a las que también se sumaron las modificaciones operativas propias de cada laboratorio. Todas contribuyeron a aumentar la variabilidad observada en los resultados. Con el objetivo de abordar la normalización del método en el año 1991, a través de PROMAR-AACS, se publicaron dos variantes del método original, una respetando la escala macro y otra a nivel reducido o escala micro, las que más tarde fueron reeditadas por el SAMLA (2004). En la actualidad, se ha desestimado la escala macro por el excesivo consumo de reactivos y generación de residuos (especialmente Cr IV) adoptándose las escalas reducidas, entre la que se ya se encuentra publicada la norma IRAM-SAGPyA determinación de carbono oxidable por mezcla oxidante fuerte, a escala semi-micro, una variante del método propuesto por Grewelin y Peech en VARIABILIDAD EN LOS RESULTADOS Las mayores variaciones observadas en el porcentaje de recuperación del carbono orgánico, cuando se aplica este método, se deben a las características del suelo y a calidad de la materia orgánica analizada, sin embargo también se suman aspectos metodológicos que inciden marcadamente en la en la dispersión de los resultados analíticos. Por lo tanto si se desea obtener un valor certero del CO se debería definir un factor de recuperación específico para cada tipo de suelo y por otra parte comprender los factores críticos que están involucrados en el proceso de determinación para adoptar una técnica normalizada en todos los laboratorios. Reacciones involucradas (Estado de oxidación inicial del C) A pesar de que experimentalmente existe una relación proporcional entre la cantidad de CO 2 desprendido en la oxidación por vía húmeda y la cantidad de ácido crómico reducido, las reacciones involucradas no están bien establecidas. Normalmente la representación de la oxidación del carbono mediante una ecuación redox considera al C de la materia orgánica en un estado de oxidación inicial igual a cero. 2 Cr 2 O 7 = + 3 Cº + 16 H + 4 Cr CO H 2 O También el H constitutivo de la MO puede reaccionar aumentando el consumo de dicromato. Sin embargo este consumo disminuye notablemente en las cadenas alifáticas de alto PM y en los compuestos cícliclos. Cr 2 O 7 = + 6 Hº + 8 H + 2 Cr H 2 O Por otra parte ocurre una reacción de descomposición de los radicales oxigenados con desprendimiento de anhídrido carbónico, que se suma al generado en la oxidación del CO RCOOH RH + CO 2
3 Aldrich y col. (1945) sugirieren una compensación de los efectos del H y O orgánicos, por lo que se asume que, cada átomo de carbono es oxidado desde un estado de oxidación 0 a un nivel +4, reflejando de esta manera todo el intercambio de electrones en la reacción. Por lo tanto, y a los fines prácticos, el equivalente redox del CO puede considerase igual a 3 (Peso Atómico / 4) Potencial redox La concentración de dicromato empleada (1N) asegura una intensidad oxidativa constante, siempre y cuando la muestra no consuma más del 80% del dicromato añadido (Walkley, 1947). En cuanto al potencial redox del sistema éste se encuentra fuertemente asociado a la concentración de H 2 SO 4 y a la temperatura de reacción. El empleo de calefacción externa permite lograr valores más altos de recuperación del C, pero puede producir una descomposición térmica del dicromato catalizada por el propio Cr 3+, dando en algunos casos valores sobrestimados. La relación ácido:dicromato, indicada originalmente por Walkley y Black (1934) resulta ser la óptima para alcanzar temperaturas cercanas a los ºC sin necesidad de calefaccionar. Sin embargo el nivel de oxidación dependerá no sólo de la temperatura máxima alcanzada, sino también de la persistencia del calor generado. En la tasa de pérdida de calor juega un papel fundamental la arquitectura del recipiente de reacción, debido a la superficie expuesta para el intercambio de calor, asociada a las características del medio aislante que lo envuelve, el cual se define básicamente por su coeficiente de conductividad térmica. En su revisión crítica Walkley (1947) encuentra que para un mismo volumen de reactivos se incrementa en aproximadamente un 2% el nivel de recuperación del carbono oxidado cuando se reduce a la mitad el tamaño de los erlenmeyers (de 500 cc a 250 cc). Por otro lado también observa que la oxidación se incrementa con el aumento de temperatura ambiente en el orden del 1% por cada 5 ºC dentro del rango de 15 a 30 ºC. En el siguiente gráfico se muestra la evolución de la temperatura para diferentes recipientes de vidrio y condiciones de aislamiento térmico. Variación de la temperatura de la reacción 124 Temperatura ºC ,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Minutos TG CT TCh CT TG GP TG GT E125 BP E50 BP TCh: Tubos de ensayo chicos TG Tubos de ensayo grandes E50 : erlenmeyer de 50 ml E125: erlenmeyer de 125 ml BP : Bandeja de plástico GP Gradilla de plástico GT Gradilla de telgopor CT Caja de telgopor Por los motivos expuestos, tanto el recipiente utilizado en la reacción como el grado de aislamiento del medio son factores que necesariamente deben ser normalizados.
4 Interferencias químicas Estos tipos de métodos están sujetos a interferencias provocadas por algunos constituyentes del suelo siempre y cuando se encuentren en cantidades elevadas. La presencia significativa de iones cloruros o iones ferrosos sobreestimarían el CO mientras que los nitratos provocarían el efecto inverso dando valores bajos de CO. La interferencia del cloruro es significativa sólo en suelos salinos, dado que consume dicromato con una relación estequiométrica de 4:1 (Cl:C). Esta puede corregirse mediante un lavado del suelo previo al análisis o incorporando Ag 2 SO 4 en el ácido sulfúrico en una concentración cercana al 1% para provocar la precipitación del Cl como AgCl. Sin embargo, en el primer tratamiento se pierden algunos compuestos orgánicos solubles y en el segundo puede ocurrir la precipitación de cromato de plata o la descomposición del dicromato por efecto de la plata. En cuanto al nitrato la interferencia es significativa sólo con concentraciones que exceden el 5 % del contenido de carbono. Y con respecto al ión ferroso, éste puede eliminarse fácilmente con el secado del suelo al aire. Por otro lado la presencia de calcáreo en los suelos podría neutralizar la acidez del medio, disminuyendo su potencial redox, sin embargo Kalra y Maynard (1991) encuentran que, para algunos suelos con contenidos de carbonatos de hasta el 50% p/p, los resultados no fueron afectados notablemente. Grado de molienda del suelo. Es muy probable que el contenido de materiales finos, principalmente arcillas silicatadas, como vermiculita y montmorillonita, y materiales alofánicos afecten el nivel de oxidación del C debido a la formación de microagregados estables que protegen la MO. La mayoría de los autores recomiendan un grado de molienda del suelo tal que pase por un tamiz de 0.5 mm para asegurar una mayor recuperación del CO y evitar errores de submuestreo, por lo cual este aspecto debería estar bien definido en el protocolo del ensayo. Reactivos Sulfato amónico ferroso (sal de Mohr): dado que este compuesto reduce notablemente su potencial reductor en presencia del oxigeno atmosférico es imprescindible valorar la solución titulante inmediatamente antes de su uso. Dicromato de potasio: Se emplea como patrón primario y sus soluciones son muy estables pudiéndose conservar indefinidamente. El ensayo en blanco podría utilizarse para calcular la normalidad de la solución ferrosa siempre y cuando el volumen dispensado de dicromato durante el ensayo sea controlado adecuadamente. Ácido Sulfúrico: Su concentración no debe ser menor de 96 % p/p ya que dentro del rango del 90 al 99% existe un incremento casi lineal de recuperación del CO del 1% por cada % de incremento en la concentración del ácido (Walkley,1947). Indicadores redox: Actualmente se utilizan distintos indicadores. La disolución de difenilamina en ácido sulfúrico concentrado fue el primer indicador utilizado para las titulaciones del exceso de dicromato con una sal ferrosa. El agregado de H 3 PO 4, NaF o HF antes de la titulación mejora notablemente la definición del punto final al eliminar los iones férricos del sistema. En cuanto a la sal bárica del ácido difenilaminosulfónico, en combinación con H 3 PO 4, resultó ser más efectiva y más estable que la difenilamina. La O-fenantrolina, con un mayor potencial de oxidación que los sulfonatos de difenilamina, permite mejorar la nitidez del punto final, pudiéndose utilizar sin el agregado de H 3 PO 4, siempre y cuando se asegure una concentración de sulfúrico 12 N durante la titulación. Sin embargo, tiene el inconveniente de ser adsorbido por coloides del suelo, por lo que se recomienda agregarla justo antes de la titulación. Factor de conversión de C oxidable a C orgánico En su trabajo publicado en 1934, Walkley y Black, encuentran que, para los veinte suelos ensayados, el porcentaje de C recuperado promediaba el 77 %, proponiendo el uso de un factor de 1.3 para expresar los resultados en porcentaje de carbono orgánico. Trabajos posteriores
5 confirman en general ese valor medio, pero teniendo en cuenta que él mismo involucra una gran variabilidad en los valores individuales según los tipos de suelos (Tabla I: D. Carreira, 2005). % C (Rango analizado) % recuperación del CO Min- Prome Factor Recup Suelo Ubicación Uso-Clima Cita Bibliográfica Máx dio arenosos y arcillosos Rothamsted cultivo Bremner &Jenkinson 1960 Sd Varios nd USA Allison Molisoles Región pampeana húmeda Richter et al Calcáreos Nd Davies Entisoles (Fluvents) Bosque húmedo Bornemisza et al Inceptisoles Andosoloes 1979 Bosque tropical húmedo Ultisoles (Udults-Ustults) Sd Udoles-Ustoles entisoles S SE Bs As Miglierina et al Sd Molisoles entisoles BsA Miglierina et al Sd Varios Nd Israel Ben-Dor & Banin, 1989 Sd Molisoles (ustoles) Bs As Región semiárida Galantini et al Oxisoles Australia Wang et al Ultisoles Bosque Eucalyptus Alfisoles Nigeria Olayinka et al 1998 Sd Sd Alfisoles (udalfs) Illinois USA cultivos Hussain & Olson 2000 Sd Sd Alfisoles (Ustalf) Australia Chan et al 2000 Sd Sd Molisoles (udoles) Rusia Past. y cultivos Mikhailova et al 2003 Tabla I : Factor de recuperación de C. Comparación del resultado de C obtenido por el método Walkley y Black vs un método de referencia para determinar el C orgánico total COT Sd sin dato Nd no definido Escala de trabajo El método propuesto originalmente por Walkley y Black (1934), ha sufrido desde su origen tantas críticas como modificaciones, debido principalmente a la variabilidad obtenida en el grado de oxidación del C y al empleo de sales de cromo hexavalente. La posibilidad de reemplazarlo por otros métodos más exactos o menos riesgosos no ha tenido demasiado éxito, ya sea por el costo relativo o por la imprecisión en los resultados. Por tal motivo se han realizado modificaciones del método original para reducir la escala de trabajo con la finalidad de aumentar la capacidad de trabajo y minimizar el uso de dicromato Actualmente las dos versiones más difundidas del método original son, la escala semimicro propuesta por Grewelling y Peach (1960) y la micro desarrollada por Richter (cit en SAMLA 2004). La primera ya se encuentra publicada como norma IRAM-SAGPyA , mientras que en la segunda ciertos elementos indicados en su protocolo debieron ajustase a las pautas de normalización proponiéndose un protocolo para realizar el ensayo en tubos de 20 mm con agitación magnética (D Carreira y M Ostinelli, 2010). En tal sentido además del trabajo citado se muestra un análisis de concordancia obtenido durante la realización del 3º Ensayo de Comparación Interlaboratorio de la RILSAV, al aplicar la norma y la escala micro propuesta, actualmente en estado de esquema de norma Como puede observarse la concordancia entre ambas técnicas es elevada pero sólo se cuenta con resultados de tres laboratorios por lo que se requiere de nuevos ensayos para poder analizar los resultados de ambas técnicas de manera conjunta. Lab 1 c semi micro c micro c semi micro 1.00 sd c micro Lab 7 c semi micro c micro c semi micro 1.00 sd c micro Lab 9
6 c semi micro c micro c semi micro 1.00 sd c micro c semi micro c micro Ref erencia Lab 1 lab 7 lab 9 3º ECI RILSAV 2010: Análisis de concordancia. Escala semi-micro vs escala micro (coeficiente / probabilidades) Norma IRAM SAGPyA En el 2º Ensayo de Comparación Interlaboratorio de la RILSAV se implementó el protocolo normalizado correspondiente a la escala semi micro, sobre 4 ítems de ensayo con diferentes niveles de analito y distintas propiedades físico-químicas. Los resultados de reproducibilidad y repetibilidad pueden observarse en la tabla II Identificación de la muestra Muestras A B C D Número de laboratorios participantes Número de resultados de ensayo aceptados Contenido promedio de carbono orgánico oxidable (mg/g), base seca 14,1 24,5 9,2 9,5 Desviación estándar de la repetibilidad, S r 0,41 0,51 0,58 0,34 2 Varianza de repetibilidad, S r 0,17 0,26 0,34 0,12 Límite de repetibilidad r (2,8 x S r ) 1,15 1,42 1,63 0,97 Coeficiente de variación Desviación estándar de la reproducibilidad, S R 0,64 0,89 0,63 0,72 2 Varianza de reproducibilidad, S R 0,39 0,76 0,39 0,48 Límite de reproducibilidad, R (2,8 x S R ) 1,79 2,50 1,76 2,00 Coeficiente de variación 4,54 3,64 6,82 7,52
7 NITRÓGENO (Método KJELDAHL) INTRODUCCIÓN Para cuantificar el nitrógeno orgánico en muestras de suelo se utilizan actualmente dos métodos muy antiguos, pero que han tenido una amplia aceptación: el propuesto por Dumas en el año 1831 y el desarrollado por Kjeldahl 50 años más tarde. El primero se basa en la combustión de la muestra en una corriente de oxigeno de alta pureza con posterior cuantificación del nitrógeno que se desprende. En el método de Kjeldahl la reacción ocurre en medio ácido (sulfúrico concentrado) a temperaturas elevadas (400ªC), donde el nitrógeno orgánico es transformado a ion amonio, el cual es cuantificado a través de una destilación alcalina y su posterior titulación. En el método de Kjeldahl se cuantifican las formas orgánica y amónica, y con ciertas modificaciones se pueden incluir los nitratos. Éstos deberían incluirse cuando se los encuentra en cantidades apreciables, dado que una concentración en el suelo de 500 ppm de nitratos sólo representa un 0.01% del N total. Los principales cambios introducidos al método original, consistieron en reducir la escala del ensayo y lograr la automatización del mismo. PUNTOS CRÍTICOS DEL MÉTODO KJELDAHL Etapa I: Digestión de la muestra Característica de la muestra. No hay evidencias de un efecto significativo de la finura del material sobre el porcentaje de recuperación de N. Algunos autores recomiendan un grado de molienda acorde a la escala del método, siendo adecuado un tamaño de 0.5 para las escalas macro y semimicro, y algo menor para el nivel micro, especialmente para obtener una submuestra homogénea. La abundancia de materiales finos, principalmente arcillas, podrían retener entre sus láminas una apreciable cantidad de amonio. En estos casos la hidratación previa o el tratamiento con HF aumentarían el nivel de recuperación de N, pero sólo de manera significativa cuando la cantidad de amonio representa más del 30% del N total. Por otra parte la digestión de muestras con niveles elevados de materia orgánica u óxidos de Fe o Al consumen un mayor volumen de ácido sulfúrico. Temperatura de digestión Varios estudios demostraron que la temperatura de digestión es el factor que más incide en la determinación del N por el método Kjeldahl, dado que si ésta es demasiado baja, inferior a 360 ºC, la digestión es lenta o incompleta y si es superior a 410 ºC, pueden producirse pérdidas de amonio. El control de la temperatura se realiza con un bloque calefactor y mediante el agregado de sulfato de sodio o de potasio, que permite aumentar el punto de ebullición del sulfúrico. Generalmente se prefiere la sal de potasio a la de sodio, ya que esta última incrementa las proyecciones del digesto sobre las paredes del tubo o balón, donde la temperatura es sustancialmente más elevada. Otro aspecto importante a considerar es la concentración de estas sales en el ácido sulfúrico, ya que con niveles bajos (menores o iguales a 0.3 g/ml) se requiere de un tiempo de digestión prolongado, y, por el contrario, una alta concentración (1 g/ml o más) reduce significativamente el tiempo de digestión y podría prescindirse del uso de catalizadores (Bremner, 1960). Sin embargo la alta concentración de sulfato de sodio o de potasio (por encima de 0.8g/ml) presenta el inconveniente de la solidificación del digesto cuando éste se enfría, debiéndose destilar la muestra antes de que esto ocurra o bien calentarla previo a su destilación. También se
8 corre el riesgo de aumentar demasiado la temperatura durante la digestión, con posibles pérdidas de amonio y también de sulfúrico, lo cual consecuentemente llevaría a un nuevo aumento de la concentración salina. Catalizadores Los de mayor eficiencia son aquellos que contienen selenio o mercurio, siguiendo los compuestos de titanio y cobre, pero dado que en el mismo orden decrece su toxicidad se recomiendan estos últimos. Etapa II: Destilación En esta etapa debe prestarse atención a la correcta conexión del tubo o balón en el destilador para evitar fugas en el sistema. El amonio que se desprende al alcalinizar el medio se recoge sobre una solución de ácido bórico, cuyo volumen o concentración no es necesario conocer con exactitud, ya que el borato de amonio que se forma se vuelve a transformar en ácido en el transcurso de la valoración con solución de sulfúrico. Sin embargo, es imprescindible ajustar el ph de la solución de ácido bórico a valores de Finalmente, como en cualquier titulación, debe prestarse especial atención al título de la solución de ácido sulfúrico utilizada para valorar el amonio proveniente de la destilación. BIBLIOGRAFÍA - Aldrich D.G., Parker E.R., Chapman H.D Effects of several nitrogenous fertilizers and soil amendments on the physical and chemical properties of an irrigated soil. Soil Sci 59: Carreira D Carbono oxidable: una forma de medir la materia orgánica del suelo. Tecnologías en análisis de suelo. Cap IV (1), Ed Marbán L y Ratto S E. Asociación Argentina de la Ciencia del Suelo. ISBN Carreira D y M Ostinelli, Carbono orgánico del suelo. Evaluación de dos escalas de trabajo. XXII Congreso Argentino de la Ciencia del Suelos. Rosario, Santa Fé. - Greweling T., Peech M Chemical soil test. Cornell Univ. Agric. Exp. Stn. Bull. Nº Nelson D W, Sommers LE Total carbon, organic carbon, and organic matter. In: Methods of Soil Analysis. Sparks D L (ed.), Part 3. SSSA Book Series 5. Soil Sci Soc Am USA Ostinelli M Segundo Ensayo de Comparación Interlaboratorio para muestras de suelo. Informe de resultados, RILSAV - Ostinelli M Tercer Ensayo de Comparación Interlaboratorio para muestras de suelo. Informe de resultados, RILSAV. - SAMLA Recopilación de técnicas de laboratorio. Formato CD-ROM. ISBN Schollenberger, C.J. 1927a. A rapid approximate method for determining soil organic matter. Soil Sci. 24: Walkley, A A critical examination of a rapid method for determining organic carbon in soil- Effect of variations in digestion conditions and inorganic soil constituents. Soil Sci. 63: Walkley, A. and I.A. Black An examination of the Degtjareff method for determining soil organic matter, and proposed modification of the chromic acid titration method. Soil Sci. 37:29-38
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