Técnicas ópticas en biofísica

Transcripción

1 Técnicas ópticas en biofísica Nieves Andrés Departamento de Física Aplicada Grupo TOL del I3A Sólidos: Moteado en superficies (Speckle) Fotografía Flujos: Sembrado partículas Microscopía Interferometría Holografía Digital

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3 La lupa Microscopio simple es lo que se conoce como una lupa: es una simple lente biconvexa (objetivo) α = y x proximo punto próximo del ojo (250 mm a la córnea) α 250 mm OJO Objeto a una distancia f 250 mm Imagen en el infinito Comparando ángulos de observación con ojo y con lupa y tgω' M = = f = tgα y f '

4 Microscopio convencional Microscopio compuesto: - el objetivo es una lente convergente que produce una imagen real aumentada del objeto - el ocular es una lente convergente que produce una imagen virtual en el infinito (desde F e ) - la distancia entre el foco de las dos lentes es la longitud óptica del tubo, t mm (o hasta 210 mm; dato) - el aumento lateral es: M = M - el aumento axial sería M 2 ob oc ob M oc = t f 250 f M ob de 1x a 130x M oc de x1 a x20 Imposible diseñar un instrumento que produzca una imagen 3D perfecta de un objeto 3D Objetivos de microscopio diseñados para producir una buena imagen de un plano Barriendo el objeto plano a plano se genera la imagen 3D

5 Microscopio convencional Iluminación Iluminación por reflexión Iluminación por transmisión Objetos finos de 1 a 5 micras hasta 30 micras Semitransparentes Para microscopio electrónico solo nm por penetración electrones (epi-illumination): para objetos gruesos o para superficies Incidencia oblicua Apertura Numérica α ángulo de incidencia Objeto atravesado por la luz AN = n x senα Objeto iluminado con un rayo de luz con un cono luminoso Poder de resolución δ = 2 λ AN

6 Difracción Resolución El poder resolutivo está limitado por la difracción - la imagen producida de un punto es un disco de Airy (figura de difracción producida por una apertura circular) 2 J1(v) I = v 2π r nsinα v = λ 2 AN decrece r = 0.61λ 0. 61λ = nsinα NA criterio de Rayleigh - dos puntos se resuelven bien cuando el segundo cae en el primer anillo oscuro del disco de Airy del primer punto

7 Aberraciones Resolución El poder resolutivo está limitado por las aberraciones Cromáticas, relacionadas con las variaciones en los índices de refracción de las diversas frecuencias (colores) que conforman la luz blanca visible La luz blanca se descompone al atravezar la lente y las diversas longitudes de onda convergen en varios puntos focales diferentes. Esférica, relacionadas con la forma esférica de la lente Aberración esferica Las ondas que pasan por la periferia no convergen en el mismo punto que las que pasan por el centro. Tipos de objetivos Obejtivos: acromáticos (corrección cromática azul y rojo, esfericidad para el verde) semi-apocromáticos (corrección cromática azul, rojo y algo de verde, esfericidad para verde y azul Apocromáticos corrección cromática 4 colores y esfericidad par dos o tres colores)

8 Técnicas de microscopia La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: Empleo de condensadores y filtros * Microscopio de campo oscuro. * Microscopio de contraste de fase. * Microscopio de luz polarizada, Microscopio petrográfico y metalúrgico. * Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski. La modificación de la fuente emisora de luz: Cambiando la luz blanca por luz ultravioleta o rayos láser * Microscopio de luz ultravioleta. * Microscopio de fluorescencia. * Microscopio confocal. Mejora digital Micrografía en campo claro de una célula epitelial de la mucosa bucal

9 Técnicas de microscopia Microscopio de campo oscuro Cono hueco de luz Bloquear la parte central del rayo Iluminación Rheinberg Micrografías de la superficie de una hoja célula epitelial microorganismos sin colorear (índice similar), mitosis y migración celular

10 Técnicas de microscopia Microscopio de contraste de fase Permitió medir células vivas Ondas de igual fase Los componentes celulares absorben la luz de diferente manera y causan variaciones de fase Se acentúan estas diferencias para mejorar la imagen Ondas desfasadas Se producen interferencias en la luz empleada para iluminar incrementando el contraste. Neurona en campo claro Neurona con iluminación de contraste de fases oscuro. Células y tejidos vivos, procesos celulares, parásitos en fluidos, efecto de medicamentos

11 Técnicas de microscopia Microscopio de polarización Glomerulo renal con tinción de rojo Glomerulo renal con luz polarizada fibrocélulas musculares estriadas con luz polarizada Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares o extracelulares

12 Técnicas de microscopia Marcadores fluorescentes Microscopio de fluorescencia Refleja la luz azul Deja pasar la verde línea negra continua representa el espectro de excitación, la línea negra punteada muestra el espectro de emisión. DAPI (emite luz azul) para marcar cromosomas GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz verde) rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos Células en división con diferente fluorocromos con microscopio de fluorescencia Marcaje de moléculas en células para caracterización, estudios inmunológicos

13 Microscopio confocal Sistema de barrido con iluminación y detección puntuales Láseres: el punto de iluminación es casi perfecto Elimina la luz proveniente de los planos no enfocados Convencional Confocal La resolución axial es independiente de la lateral. Mejor al reducir el ruido de fondo La resolución lateral es un 40% mejor Obtención de cortes ópticos (0.5 a 1.5 mm) en muestras de grosor Las imágenes 2D obtenidas a intervalos regulares siguiendo el eje óptico son combinadas y utilizadas para recrear una estructura (3D) mediante el empleo de software especializados

14 Microscopio confocal iluminación convencional o de campo amplio Se ve luz de fuera de foco Iluminación en microscopia confocal hipotálamo de ratón músculo liso de rata grano de polen de girasol marcadas con diversos fluorocromos (dobles y triples marcajes). autofluorescente

15 Microscopio confocal Cortes ópticos y reconstrucción 3D grano de polen muestra de hígado de ratón Secciones ópticas seriadas de un grano de polen. Cada imagen fue obtenida a un intervalo de 3 micrómetros. corte grueso de corteza cerebral de rata auto fluorescencia de una porción de raíz de helecho Imagénes de secciones ópticas finas de la córnea y su estructura Estudios de ADN, ARN, procesos celulares, células vivas. Dermatologia en vivo Reconstrucciones realizadas a partir de series de cortes ópticos.

16 Microscopio de barrido Microscopio de efecto túnel Plataforma o sonda que recorre la superficie de la muestra con gran precisión Según la sonda se obtiene información de propiedades químicas, eléctricas, mecánicas o físicas de la microestructura o nanomateriales. Superficie de un cristal en el cual se aprecian los átomos de silicio, Sonda: 1nm y se desplaza por la superficie captando los electrones por efecto túnel (materiales deben ser conductores o semi-conductores) Imagen de la sonda sobre la superficie del material en estudio en un microscopio de fuerza atómica Efecto de antibióticos en glóbulos rojos

17 Microscopia holográfica Amplitud Contraste de fase Sistema de transmisión Sistema de reflexión Pseudo 3D plot Sistemas holográficos: - Fuera de eje con haces colimados - Fuera de eje con haces divergentes - Transformada de Fourier sin lente - Desplazamiento de fase - Con imagen o desenfocado Ventajas: - Registro simultáneo (instantáneo) de un objeto 3D - Enfoque numérico plano a plano (seccionamiento/ reconstrucción 3D) - Se puede aplicar numéricamente técnicas de contraste de fase mic. campo oscuro, schlieren, mic. interferencia, shearing interf. - Información sobre la distribución de fases

18 Microscopia holográfica Holograma Amplitud 100x oil, 1.3 NA Amplitud WPM UPM WPM UPM Células tumorales de un pancreas humano vivo Enfoque numérico Glóbulos rojos humanos vivos 63x, 0.75 NA Superficie nanoestructurada con oro: resolución axial = 5 nm 63x, 0.75 NA

19 Microscopia holográfica Células en un chip de intercambio de medicamento Holograma Imagen real en el plano del holograma: AMPLITUD Imagen real en el plano del holograma: FASE Imagen real en el plano del holograma, quitando el término de curvatura: FASE Imagen real en un plano a z=0,12mm del holograma : AMPLITUD Imagen real en un plano a z=0,12mm del holograma : FASE Imagen real en un plano a z=0,12mm del holograma : FASE Imagen en un plano con células seleccionadas