BACTERIAS ANTAGONISTAS DE HONGOS FITOPATÓGENOS ASOCIADAS A LA RAÍZ DE Vanilla planifolia Andrews

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1 BACTERIAS ANTAGONISTAS DE HONGOS FITOPATÓGENOS ASOCIADAS A LA RAÍZ DE Vanilla planifolia Andrews Jacel Adame García 1 Mauricio Luna Rodríguez 2 Ángel Rafael Trigos Landa 2 RESUMEN La vainilla es una orquídea tropical que se establece mediante segmentos de tallo que no presentan variación genética. Por ello, se ve amenazada por plagas y enfermedades, en particular por la pudrición de raíz y tallo causada por Fusarium. El hongo crece rápidamente en el tejido y en pocos días puede destruir completamente la raíz. El uso excesivo de fungicidas en los cultivos de vainilla contra estos patógenos ha perturbado el ciclo de interacción entre hongos micorrizógenos nativos que integran la rizósfera, disminuyendo la capacidad de absorción de nutrientes por las raíces adventicias. Por lo que sería muy útil encontrar soluciones alternativas que disminuyan el uso de productos químicos, como las basadas en las interacciones microbianas benéficas con las raíces de las plantas, para reducir la incidencia de enfermedades. Razón por la que se propuso en el presente trabajo obtener a partir de medios enriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla, con capacidad para el control de especies fúngicas patógenas. A partir de tallos y hojas de vainilla con daños por pudriciones, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme con patogenicidad en hojas de vainilla variable. Paralelamente, se seleccionaron 19 cepas bacterianas de rizósfera de vainilla desarrolladas en medio de cultivo agar-cáscara de jaiba. Se evaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas mediante la inoculación simultánea del hongo y la bacteria. Seis cepas bacterianas fueron capaces de inhibir in vitro en más del 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani. Las pruebas in vivo mostraron que las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solani solo en tallo y que F. oxysporum presentó mayor resistencia que F. solani, al antagonismo microbiano. PALABRAS CLAVE: Vainilla, rizósfera, competencia, biocontrol, Fusarium. INTRODUCCIÓN La vainilla es una fuente natural de saborizantes y aromatizantes, la cual es una orquídea tropical con orígenes en México y Centroamérica (Funk y Brodelius, 1990). Vanilla planifolia Andrews es originaria de la parte norte de la zona costera del estado de Veracruz y norte de Puebla, específicamente de la zona conocida como el Totonacapan, donde se presentan las características de clima y suelo necesarias para la explotación. Debido a que este cultivo se establece mediante segmentos de tallo (clones) que no presentan variación genética (Lee-Espinoza et. al., 2008), es una especie susceptible a un gran número de enfermedades fúngicas, entre ellas aquellas causadas por los géneros Calospora vanillae (antracnosis), Fusarium sp. (pudrición de raíz y fruto), Phytophthora sp. (pudrición de fruto), 1 Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Universidad Veracruzana: jadameg@gmail.com 2 Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, S.C., Universidad Veracruzana

2 Colletotrichum sp. y Gloeralla vanilliae (pudrición de raíz). Particularmente, Vanillae planifolia es muy susceptible al ataque de F. oxysporum (Nielsen y Siegismund, 1999). Para prevenir las enfermedades en este cultivo se recomiendan métodos basados en productos químicos (Anilkumar, 2004). Sin embargo, no existe alguno específico para el control de la pudrición ocasionada por Fusarium y los empleados, son inefectivos (Xia-Hong, 2007). Por otro lado, en la agricultura actual el uso indiscriminado de productos químicos, además de ocasionar contaminación del ambiente, ocasiona problemas tales como resistencia de las plagas y enfermedades a dichos productos, aparición de organismos oportunistas perjudiciales para las plantas, daños a los animales y sobre todo, riesgos para la salud humana (Daoubi et al., 2005; Liu et al., 2000). De allí que, se plantea que es necesaria la búsqueda de alternativas no tóxicas para combatir las enfermedades, por lo que se han empleado a los biopesticidas, organismos y/o bioproductos obtenidos de microorganismos competidores naturales, debido a que estos generalmente no provocan contaminación al ambiente y son de baja toxicidad para el ser humano (Liu et al., 2000). Por otra parte, se ha demostrado que las enfermedades de las plantas se suprimen de manera natural debido a la interacción de la microflora nativa con el vegetal, protegiéndola del ataque de los patógenos (Alabouvette et al., 1993). Algunas cepas bacterianas asociadas a raíces, denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR) (Kloepper y Schroth, 1978), pueden ser empleadas como control biológico de enfermedades causadas por hongos, donde además de disminuir el ataque de estos patógenos (Barea et al., 2005), pueden estimular el crecimiento aumentando la producción (Jiménez et al., 2001). El uso de PGPR está ganando importancia debido a los beneficios que han aportado a la agricultura, sin embargo en lo que respecta al cultivo de vainilla no se ha encontrado información al respecto, por lo que se considera que no se han realizado. Por todo lo anterior, bajo la hipótesis de que bacterias nativas asociadas a la rizosfera y rizoplano de la vainilla, poseen propiedades controladoras de especies fúngicas patógenas de este cultivo, se propuso llevar a cabo este trabajo con el objetivo de obtener a partir de medios enriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla en el estado de Veracruz, con capacidad para el control de especies fúngicas patógenas aisladas de problemas fitosanitarios locales. MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento de hongos fitopatógenos Se aislaron hongos patógenos de tallos y hojas de vainilla con daños por pudriciones. Los tejidos infectados se lavaron con agua corriente y la superficie se desinfectó por inmersión en solución de hipoclorito de sodio comercial al 2 % durante 1 min, y enjuagues posteriores con agua destilada estéril, y secado con papel absorbente. Se cortaron fragmentos de tejido (~2 x 2 x 2 mm) no deteriorado, a partir del límite de la lesión. 2 fragmentos de tejido se colocaron en cajas Petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA) y medio Czapek Dox. Las cajas fueron incubadas a 26 C ± 1 durante 5 días en incubadora microbiológica (BG ). Parte de los micelios desarrollados se transfirió a medio PDA mediante inoculación con aguja de disección. Cada cepa desarrollada se resembró hasta asegurar su purificación. Las cepas aisladas fueron caracterizadas por morfología y se identificaron empleando los criterios de Romero (1988). Se comprobó la patogenicidad de las cepas mediante la inoculación en hojas de vainilla incubados en cámara humeda a 22º C y 100 % de humedad relativa. Un disco de agar (5 mm de diámetro) con micelio de 7 días de incubación se colocó en la superficie de las hojas, y fueron incubados durante 20 días bajo 12 h de oscuridad y 12 h de luz. Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainilla

3 Durante el mes de marzo de 2009 se llevó a cabo la recolección de rizósfera de vainilla en cultivos establecidos en la localidad de Francisco Sarabia, municipio de Papantla, Veracruz. Las muestras se colocaron en bolsas de plástico y se transportaron al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, S. C. (Universidad Veracruzana). En el laboratorio, las raíces se cortaron en fragmentos de 5 mm y se colocaron 10 g en 90 de solución estéril de fosfatos 0.25 M (NOM- 110-SSA1-1994). La solución fue agitada a 120 rpm durante 10 min en un agitador orbital (Lab Line ). A partir de dicha solución se hicieron cinco diluciones adicionales (1:9); se dispersaron 100 µl de las diluciones 10-5 y 10-6 en medio de cultivo cáscara de jaiba (3, 6 y 9%), y se incubaron a 26º C ± 1 durante 72 h. Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre las especies fitopatógenas Se evaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las colonias bacterianas que presentaron mejor desarrollo en medio de cáscara de jaiba, sobre las especies fitopatógenas aisladas de tallos y hojas de vainilla. La capacidad antifúngica in vitro se probó en medio agar nutritivo y PDA mediante el método de caja vaciada, que consistió en inocular 100 µl de solución bacteriana (1x10 8 UFC) y adicionar 20 ml de medio, girando hacia la derecha e izquierda para distribuir el inóculo. Se dejó solidificar el medio y se colocó una muestra de micelio con aguja de disección, guardando la relación de dos cajas por cepa fúngica a evaluar. Para las pruebas in vivo, se consideraron solo 2 cepas fúngicas que mostraron mayor agresividad (H2 y H9) y 6 aislados bacterianos que presentaron capacidad antifúngica en la prueba in vitro, probados en conjunto (6 aislados) y uno (B15), de manera independiente, considerado por mostrar la mejor respuesta inhibitoria in vitro. Se emplearon fragmentos de tallo (esquejes) de 15 cm de longitud de Vanillae planifolia Andrews, colectados en la localidad de Francisco Sarabia, Veracruz. Se evaluaron 8 tratamientos y se consideraron 7 controles (Cuadro 1). Cuadro 1. Tratamientos para probar la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas seleccionadas contra los hongos fitopatógenos en plantas de vainilla. No. Abreviatura Descripción 1 Bp+H2*+R Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en la raíz 2 Bp+H2+T Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en el tallo 3 Bp+H9*+R Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en la raíz 4 Bp+H9+T Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en el tallo 5 B15+H2+R Bacteria 15 + Hongo 2 en la raíz 6 B15+H2+T Bacteria 15 + Hongo 2 en el tallo 7 B15+H9+R Bacteria 15 + Hongo 9 en la raíz 8 B15+H9+T Bacteria 15 + Hongo 9 en el tallo 9 C1-1 Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 34, 61) 10 C1-2 Bacteria C2-1 Hongo 2 raíz 12 C2-2 Hongo 2 tallo 13 C2-3 Hongo 9 raíz 14 C2-4 Hongo 9 tallo 15 C3-1 Planta raíz *H2=Fusarium oxysporum, H9=Fusarium solani Se indujo a la producción de raíces de los esquejes mediante su inmersión en agua corriente durante un mes. Para la prueba en tallo, se inoculó el tallo de 12 esquejes con dispersión superficial de 1 ml de una solución acuosa de esporas fúngicas de esporas/ml; y para la

4 prueba en raíz, se inocularon 10 ml de la solución de esporas indicada en suelo esterilizado (15 psi/120 C/30 min) contenido en recipientes de plástico de 2 L. Posteriormente, para la prueba en tallo, se asperjó a cada esqueje, 1 ml de una solución acuosa bacteriana de 1x10 8 UFC/ml, mismos que fueron sembrados en recipientes plásticos de 2 L sin inóculo (fúngico y bacteriano). En tanto que para la prueba en raíz, se aplicaron 10 ml de la solución bacteriana indicada, por cada recipiente con suelo inoculado con esporas fúngicas, y se sembraron en él, esquejes sin inóculo (fúngico y bacteriano), en relación de un esqueje por recipiente. Los recipientes fueron colocados en vivero a temperatura ambiente (± 30 C). Cada recipiente se colocó separadamente para evitar la interferencia entre ellos, y cada tratamiento se repitió dos veces. Se evaluó la respuesta de la vainilla (pudrición), siguiendo el desarrollo de la enfermedad cada 5 días durante 1 mes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de hongos fitopatógenos Se aislaron 37 cepas de hongos a partir de micelios desarrollados a los tres días después de la siembra de los tejidos enfermos en cajas con medio PDA y Czapek Dox. Estas, fueron agrupadas para su identificación en 9 hongos diferentes, de acuerdo a las características morfológicas macroscópicas del micelio (color, forma, consistencia). La evaluación microscópica reportó que 7 de los hongos correspondían al género Fusarium spp y 2, al género Colletotrichum spp. Los aislamientos de Fusarium sp., mostraron diferencias en las características macro y microscópicas, a partir de lo cual, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme. La patogenicidad de estos aislamientos en hojas de vainilla fue variable, donde el aislamiento de F. oxysporum mostró mayor capacidad patogénica al provocar pudrición del tejido en un radio de 7 mm alrededor del inóculo a los 5 días después de la siembra. En tanto que, a los 10 días después de la inoculación, F. solani produjo un daño de similar intensidad al provocado por F. oxysporum a los 5 días, sin embargo, el desarrollo del daño fue más acelerado, logrando abarcar la totalidad de la superficie foliar a los 12 días, a diferencia de los 15 días necesarios para F. oxysporum. El aislamiento de F. moniliforme no ocasionó daño durante los 20 días del experimento. De acuerdo con Nielsen y Siegismund (1999), Vanillae planifolia es muy susceptible al ataque de F. oxysporum, donde el hongo crece rápido y en pocos días puede destruir completamente el tejido colonizado. Xia-Hong (2007) aisló a partir de tejidos de vainilla infectados y suelo, tanto a F. oxysporum como a F. solani, indicando que F. oxysporum es primaria y frecuentemente colonizador de tejidos de vainilla, en tanto que F. solani tiene menor frecuencia. Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainilla Se seleccionaron 19 cepas bacterianas, a partir de 61 colonias morfológicamente distintas, desarrolladas en las tres concentraciones de cáscara de jaiba empleadas en la preparación del medio. El desarrollo de colonias bacterianas se observó a partir de los 4 días después de la siembra del inóculo. Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre las especies fitopatógenas A los 5 días de incubación, 6 de las 19 cepas bacterianas probadas, mostraron capacidad de inhibición in vitro del desarrollo micelial. Las cepas 1, 12, 29 y 22 inhibieron en un 90% el cuerpo micelial de los aislamiento de F. oxysporum y F. solani, en tanto que la cepa 61 inhibió

5 en un 95 % el crecimiento de ambos hongos. Fue sobresaliente, el hecho de que la cepa bacteriana 15 mostró mayor poder de inhibición, 96 % para F. oxysporum y 98 % para F. solani. La evaluación in vivo de la capacidad antifúngica reportó que a los 30 días de duración del ensayo, los tratamientos 1, 2, y 5, así como los controles 11, 12, 13 y 14, el daño a las plantas de vainilla fue del 100%. En tanto que, para los tratamientos 3, 4, 6, 7 y 8, y los controles 9 y 10, los esquejes de vainilla no presentaron daño. Al respecto, se resalta el hecho de que F. solani fue inhibido eficazmente en tallo tanto por el conjunto de bacterias como por el aislamiento B15, sin embargo para la prueba en raíz, solo se evidenció respuesta satisfactoria empleando el conjunto de bacterias, considerando resultados similares tenidos para la prueba con F. oxysporum en raíz. Lo anterior puede tener como explicación que la acción de la cepa B15 fue afectada por las características del suelo (agua, temperatura y microflora) (Davies y Whitbread, 1998) o bien que, la combinación de los microorganismos eleva el nivel y consistencia de la supresión de hongos fitopatógenos de acuerdo a Raupach y Kloepper (1998), Whipps (2001) y Lutz et al. (2004). Al respecto, Pierson et al. (1998), Lutz et al. (2004) y Maurhofer et al. (2004), mencionan que la producción de antibióticos por bacterias antagonistas del suelo se puede incrementar cuando éstas son confrontadas con otros microorganismos. La prueba in vivo de la actividad bacteriana inhibitoria sobre F. oxysporum mostró que únicamente el tratamiento en tallo con la cepa B15 tuvo resultados satisfactorios, lo que demuestra que este patógeno presenta mayor resistencia que F. solani al antagonismo microbiano. En concordancia con lo señalado por Duffy et al. (2003), al indicar que, así como los antagonistas microbianos utilizan un arsenal diverso de mecanismos para dominar las interacciones con los patógenos, los patógenos tienen sorpresivamente diversas respuestas para contrarrestar el antagonismo. Lo antes expuesto, conlleva a establecer nuevas estrategias de ensayo, entre estas, asegurar previamente una interacción directa entre las bacterias y el tejido vegetal antes del enfrentamiento con el fitopatógeno, así como, el uso de combinaciones de bacterias aparentemente no antagonistas desarrolladas a partir de la rizosfera, o bien, tratamientos del tejido vegetal con productos de la fermentación bacteriana. CONCLUSIONES Se identificaron tres especies de Fusarium: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme, a partir de pudriciones de hojas y raíz de Vanilla planiflolia Andrews. F. oxysporum mostró, in vivo, mayor capacidad patogénica. El uso de medios de cultivo adicionados con quitina a partir de cáscara de jaiba, permiten el aislamiento de bacterias con capacidad antagonista ante hongos fitopatógenos. Se aislaron de la rizosfera de vainilla, seis cepas bacterianas capaces de inhibir in vitro en más del 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani. Las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solani en tallo. F. oxysporum mostró mayor resistencia que F. solani, al antagonismo microbiano. LITERATURA CITADA Alabouvette, C., P. Lemanceau and C. Steinberg Recent advances in the biological control of Fusarium wilts. Pesticide Science 37:

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