La PC: Breve historia en el Ecuador. Mayra Ronquillo

Transcripción

1 La PC: Breve historia en el Ecuador Mayra Ronquillo

2 Primeros casos de PC en el Ecuador Año Ubicación Superficie afectada 1974 Santo Domingo de los Tsáchilas casos limitados 1976 Quinindé casos limitados 1979 ( ) 1979 ( ) 2000 (2010) 2002 ( ) Shushufindi >5000 Orellana >5000 Viche datos no disponibles San Lorenzo >13982 Andrade G Franqueville H Dpto. de Transferencia, ANCUPA Bernal G., Comunicación personal

3 Microorganismos asociados a la PC en el Ecuador Año Autor Localidad Patógeno asociado Harper y Gudauskas Shushufindi Fusarium spp Quillec G. Shushufindi Phytophthora, Pythium 1994 Franqueville H. Quinindé Fusarium spp Allen et al. Shushufindi y Orellana Erwinia amylovora 1998 Andrade G. y Chávez F. Sto. Dgo. de los Tsáchilas F. solani, F. roseum 2009 Ronquillo M., Bernal G. y Elliott M Ronquillo M., Estévez C. y Bernal G. San Lorenzo San Lorenzo y Viche F. solani, F. proliferatum F. oxysporum y F. solani 2013 Rivas F. y Herrera L. Esmeraldas Fusarium spp.

4 Fusarium oxysporum y Fusarium solani en el proceso de infección de la pudrición de cogollo Ronquillo Mayra, Estévez Consuelo y Bernal Gustavo Marzo, 2013 Mm

5 Objetivos 1. Realizar un muestreo en las plantaciones de palma aceitera en las Provincias de Esmeraldas. 2. Identificar con análisis morfológico y molecular, microorganismos asociados a la PC. 3. Realizar pruebas de patogenicidad de los principales microorganismos.

6 Recolección de material vegetal Tabla 1. Escala de severidad utilizada para la selección de palmas. Escala de Severidad Síntomas 1: aparentemente sana Sin síntomas visibles. 3: síntomas iniciales Amarillamiento de las hojas más jóvenes, pequeñas lesiones necróticas en la flecha. 5: Daño avanzado Amarillamiento del cogollo, pudrición de la flecha. 7: palma muerta Secamiento de las hojas, pudrición del meristemo. Estévez y Ronquillo, Palesema, Energy Palma, Kayalú, Aiquisa, Palpailón, PDA Tejido sintomático y asintomático

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8 Aislamiento e identificación de hongos hipoclorito 25%, Etanol 70% y 3 ADE. APDA Cultivos monospóricos y de punta de hifa. Ilustrated genera of imperfect fungi, Fusarium Laboratory Manual PCR: ITS1 e ITS4 Macrogen Washington. USA

9 Aislamiento e identificación de Phytophthora DAS-ELISA e InmunoStrip (Agdia, USA) Lavado 2 horas chorro continúo hipoclorito 10%, Etanol 70% y 3 ADE. Agrios, Sarria, et al., 2008 PARP (maíz-agar + pimaricina, ampicilina, rifampicina, PCNB) Singlenton et al., 1992.

10 Aislamiento e identificación de bacterias Medio de cultivo agar nutritivo. Purificación, diluciones en serie. Características culturales y bioquímicas Pruebas de serología Identificación molecular Generation Capture Column Kit, Qiagen. PCR: 1492R, 27F

11 Pruebas de patogenicidad «Preliminar» Permiso Especial 170 semillas: Departamento de Agricultura de Puerto Rico No. MV Permiso del Departamento de Agricultura de los EEUU No. P

12 Pruebas de patogenicidad CIPAL 1 ml de una suspención de: Bacterias: 24 horas de crecimiento, 1x10 5 células/ml Hongos: 1x10 7 macroconidias/ml. CIRAD 2504 Híbrido OxG (Coari x La Me)

13 Resultados Tabla 2. Frecuencia de hongos aislados desde tejido con PC en plantaciones de palma aceitera en la Provincia de Esmeraldas. Hongo No. Aislados Porcentaje % Estructura afectada Acremonium spp Flecha Alternaria spp flecha, foliolos del cogollo, raíz Cladosporium spp flecha, foliolos del cogollo Colletotrichum spp flecha, raíz Curvularia spp flecha, foliolos del cogollo, raíz Diaporte spp Flecha Fusarium spp Flecha, raíz. Nigrospora spp flecha, raíz Pestalotia spp Flecha, raíz Phoma spp foliolos del cogollo, raíz Polypore spp Flecha Trichoderma spp Raíz Micelio estéril foliolos del cogollo, raíz Total

14 Fusarium solani Micelio color blanco crema poco abundante Microconidias: 11.36±1.41 µm de largo y 4.45±0.58 µm de ancho Macroconidias: 30.81±2.95 µm de largo y 5.44±0.48 µm de ancho Macroconidia: La célula apical es obtusa y redondeada, célula basal casi cilíndrica con una muesca

15 Fusarium oxysporum Micelio aéreo y blanco, que en algunas ocasiones varió a púrpura. Microconidias: 5.53±0.68 µm de largo y 2.61±0.35 µm de ancho Macroconidias: 31.05±6.75 µm de largo y 3.17±0.72 µm de ancho Macroconidias: célula apical atenuada y célula basal formando un pie.

16 MP pb Carril 1: marcador 1 kb. Carril 2-10 aislados de Fusarium (41, 54, 50, 89, 90, 42, 12, 84 y 70). Carril 11 y 12 control negativo y positivo. 500 pb correspondiente con el peso molecular para hongos. Tabla 3. Identificación molecular de especies de Fusarium aislados desde tejido de palma aceitera con PC. Datos del aislado Identificación en GenBank Numero de acceso GenBank a Aislado Descripción Cobertura % Homología % JX Fusarium solani JX Fusarium oxysporum JX Fusarium sp JX Fusarium sp JX Fusarium solani JX Fusarium solani JX Fusarium oxysporum JX Gibberella moniliformis JX Fusarium equiseti a Código asignado en GenBank para la secuencia reportada

17 Identificación serológica de Phytophthora Tejido de raíz, InmunoStrip: de 35 muestras dos muestras positivas para Phytophthora sp. Severidad 1 y 3 No se aisló Phytophthora desde ninguna muestra de tejido. DAS-ELISA no detectó Phytophthora (tejido de hoja bandera, cogollo o base de los foliolos).

18 Identificación de bacterias Tabla 4. Frecuencia de bacterias aisladas desde tejido con síntomas de PC en la Provincia de Esmeraldas. Bacteria No. Aislados Porcentaje % Estructura Afectada Erwinia spp flecha y meristemo apical Bacillus spp flecha y meristemo apical Klebsiella spp flecha y meristemo apical Otras Gram negativas flecha y meristemo apical Otras Gram positivas flecha y meristemo apical Total

19 Tabla 6. Resultados de las pruebas de serología DAS-ELISA e Inmunoblot. Aislado DAS-ELISA Inmunoblot E. amylovora E. carotovora * C- - - C DAS-ELISA: E. amylovora C Inmunoblot: E. carotovora

20 Tabla 7. Prueba de reacción de hipersensibilidad en plantas de tabaco No. Aislado HR Serología 19 + E. amylovora 11 + E. amylovora E. carotovora E. carotovora pb Carril. Carril 1: marcador 1 kb. Carril 2-5 aislados bacterianos 10, 19, 16 y 11. Carril 6 y 7 control negativo y positivo.

21 Ensayos de patogenicidad CIPAL Inoculación de F. oxysporum CIRAD días después de la inoculación

22 Inoculación de F. oxysporum CIRAD días después de la inoculación

23 Inoculación de F. oxysporum Híbrido interespecífico OxG

24 Inoculación de F. solani CIRAD 2504

25 Testigo

26 Re-aislamiento de patógenos inoculados pb Carril 1: marcador 1kb; Carril 3: aislado 9 de F. oxysporum; Carril 5: aislado 1 de F. solani; Carril 7 y 8: Control negativo y positivo.

27 Conclusiones Fusarium oxysporum y Fusarium solani se aisló con mayor frecuencia (36.59%) desde tejido de flecha, bases peciolares y raíz con síntomas de PC. No se aisló a Phytophthora desde tejido de flecha y raíz. Las características culturales, bioquímicas y de serología, indican que los aislados bacterianos 10, 11, 16 y 19 corresponden al género Erwinia. Los aislados de F. oxysporum y F. solani causaron lesiones necróticas en la hoja más joven de palmas código 2504, sin llegar a causar la muerte de la planta.

28 Conclusiones El aislado 70 de F. oxysporum causó lesiones necróticas pequeñas en la hoja más joven del híbrido interespecífico OxG en comparación con el material CIRAD código La inoculación de Erwinia spp. en palmas de vivero no mostró síntomas de la enfermedad.

29 Gracias!