Certificación de Viveros de Palma Aceitera

Transcripción

1 Certificación de Viveros de Palma Aceitera Consuelo Estévez de Jensen, Ph.D. Departamento de Cultivos y Ciencias Agroambientales Universidad de Puerto Rico, Recinto Mayagüez Junio 20, 2013

2 Antecedentes Primer reporte de la pudrición del cogollo causada por Phytophthora palmivora en Colombia. Gómez et al, En el 2011 en plantaciones de palma aceitera en las Provincias de San Lorenzo y Sto. Domingo de los Tscháchilas no se logró aislar en medio selectivo ni detectar por medio de serología a Phytophthora spp. desde tejido afectado. Se detectó a Phytophthora spp en raíces utilizando tiras inmunológicas.

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4 Triángulo de la enfermedad Hospedero Susceptible El Medioambiente Patógeno (s)

5 Porqué un Programa de Certificación?

6 Objectivos de un Programa de Certificación Garantizar plantas sanas y de alto potencial genético. Asegurar plantas libres de patógenos transmitidos por material vegetativo Desarrollar protocolos para un programa de saneamiento de viveros.

7 Componentes de un Programa de Certificación Programa de Cuarentena asegura la introducción segura de germoplasma. Programa de Saneamiento pruebas que detectan la presencia de patógenos y tratamientos que conducen a la producción de germoplasma libre de patógenos. Programa de Certificación garantiza que las fuentes de germoplasma esten libres de patógenos.

8 Enfermedades de importancia Patógenos transmisibles por material vegetativo que comprenden virus, viroides, procarióticos sistémicos, fitoplasmas y espiroplasmas. Las plantas en un vivero deben estar libres de plagas y enfermedades. El substrato debe ser libre de patógenos de suelo.

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10 Viveros en áreas de cuarentena Inspección anual de viveros por síntomas de Phytophthora spp. Un mínimo de 40 plantas por vivero. Todas las plantas sintomáticas deben ser analizadas para Phytophthora spp. en un laboratorio aprobado. Los métodos de detección pueden ser por serología (DAS- ELISA) Double antibody sandwich-enzyme linked inmunosorbant assay DAS-ELISA. En caso de resultados positivos realizar aislados en medio selectivo e identificación por morfología. Análisis molecular con PCR para la identificación de la especie.

11 Análisis de Nuevas Introducciones de Palma Aceitera Patógeno Método Tejido Phytophthora DAS ELISA PCR Cogollo y raíces Erwinia spp. DAS-ELISA Cogollo Fitoplasmas PCR Tallo Virus RT-PCR y PCR Foliar Fusarium solani Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis Aislados y pruebas de patogenicidad cogollo y raíces Ganoderma spp. PCR Tallo, raíces

12 Phytophthora spp. Patógeno destructivo en plantas herbáceas y leñosas. Causa muerte repentina, pudrición de raíces y tallo. El inóculo de Phytophthora puede ser transportado en el aire, en el agua o en el follaje susceptible. Diseminación por agua y suelo contaminado Deficiente aereación del suelo Suelos saturados (>70%) Temperaturas 59 a 74 F. Sobrevive en el suelo, agua y en plantas susceptibles

13 Síntomas de Phytophthora palmivora Decoloración de la hoja más joven. Lesiones humedas en el follaje. Amarillamiento y necrosis de la hoja bandera. Lesiones alargadas en el interior de la hoja bandera de color miel a café. Pudrición de la base de la hoja. Caída de las hojas Pudrición en la base del tallo y del cogollo. Marchitez y falta de crecimiento

14 Detección de P. palmivora del agua Aislado desde el agua Medio selectivo PARPH y PARP, mas benomyl (10 ppm) para suprimir crecimiento de Zygomicetes. Medio V8 clarificado para produccion de sporangias. Cultivos incubados en temperatura ambiente y luz continua ( 40 watts) por 4-5 dias. Cultivos en la obscuridad para observar estructuras sexuales (homotalicas). Observacion de esporangia.

15 Métodos de Identificación DAS-ELISA Los anticuerpos monoclonales están adheridos a la microplaca. Colocar las muestras maceradas con un amortiguador. Durante el período de incubación si Phytophthora esta presente es capturado por el anticuerpo y capturado en el microplato. Luego de un enjuague se unen y los anticuerpos detectado con un substrato por un cambio de color en presencia del conjugado enzimático Tira inmunológica Macerar el tejido con un amortiguador Insertar la tira inmunológica Dejar por 3 minutos y observar la presencia de una doble banda (+). Aislamiento Aislado en medio específico (PARPH). Identificación de características culturales y morfológicas.

16 DAS-ELISA Phytophthora spp.

17 Reacción en Cadena de la Polimerasa Extracción del ADN Kit de Qiagen Reacción en cadena de la Polimerasa. Cebadores universales ITS 1 y ITS4 Secuenciación Cebadores especificos A2 y I2 (Drenth et al, 2006). (PCR) Stock inicial Stock final Volumen 1Rx Buffer 1x 2.50 (10x) MgCl mm 0.75 DNTPs ( mm 2.00 mm) Primer A µm (50u/µL) Primer I µm (50u/µL) Mango Taq 0.50 u (5u/µL) ADN 50 ng 1 Agua Total - 25

18 Métodos de Identificación desde raíces y suelo Para la detección preliminar en las raíces utilizar tiras inmunológicas o la técnica de Double antibody sandwich-enzyme linked inmunosorbant assay DAS-ELISA. Para confirmación aislar en medio selectivo. Para suelo o substrato realizar diluciones de suelo y utilizar medio especifico (PARPH).

19 Analisis de patógenos en plantas de vivero de Palma Africana Patógeno Método Prueba Re-Indexación Phytophthora DAS ELISA Tira Inmunológica Polymerase Chain Reaction (PCR) palma sintomática Raíces Substrato Anual Fusarium solani Fusarium oxysporum Aislado Planta sintomática Substrato y raíces Anual

20 Fusarium Fusarium oxysporum f. sp. elaeidis Patógeno habitante del suelo Sobrevive en forma de clamidósporas en el suelo y en los residuos. Bloqueo de las vasos del xylema y producción de tilosas y goma. Reducción del crecimiento Marchitez y muerte de la palma Fusarium solani Patógeno habitante del suelo Sobrevive en forma de clamidósporas en el suelo y en los residuos. Causa la pudrición de las raices.

21 Fusarium solani Fusarium solani (Mart.) Sacc. (teleomorph = Nectria haematococca (Berk. & Br.). Para aislar el patogeno del suelo, mezclar la muestra del suelo con agua destilada y mezclar vigorosamente. Realizar diluciones seriadas y colocar 1 alicuota de cada dilucion en el medio de cultivo Nash & Snyder s modificad (Cho, J.H., et al, 2001). Incubar los platos a temperatura ambiente y luz y luego de 7 dias trasnferir las colonias a papa-dextrosa-agar.

22 Fusarium solani En papa dextrosa agar F. solani produce micelio de color blanco a crema, escaso y tambien abundante Las macroconidias tienen 3-4 septas y son ligeramente curvadas, tienen una pared gruesa y su parte apical es atachada. La microconidias son abundante, oval a arinonada y se forman en falsas cabezas en monofialidos largos Produce abundantes clamidósporas.

23 Pudrición Basal del Tronco Ganoderma sp. Material de propagación contaminado. Ganoderma boninense, G. zonatum y G. miniatocinctum reportadas en Malasia como patogénicas en Palma Africana. Pudrición interna de la palma y el crecimiento externo del hongo en el tronco. Marchitez de las hojas inferiores o de toda la palma Immunoassay Protein-based ELISA (anticuerpos policlonales).

24 Detección de Ganoderma spp. Multiplex PCR-DNA para la detección e identificación de las diferentes especies de Ganoderma boninense, G. zonatum y G. miniatocintum. Primers de la region ITS del ADN ribosomal. 5 -TTG ACT GGG TTG TAG CTG-3 (Forward primer) 5 -GCG TTA CAT CGC AAT ACA-3 (Reverse primer). ADN de Ganoderma boninense amplificara un fragmento de 167 bp.

25 Parasitos obligados Amarillamiento letal del cocotero 'Ca. Phytoplasma palmae' Extracción de ADN DNeasy Plant Mini Kit Qiagen modificado PCR con cebadores universales para phytoplasmas. Phytoplasmas

26 Phytoplasmas Master Mix para la amplificacion PCR para una reaccion de 50μl Componentes AccuPrime HF 1 La Taq 2 Agua Molecular 41.75μl 37.5μl 10X AccuPrime Buffer II (blue cap)/10x Buffer 5μl 5μl dntp μl Primer 1 (20pmol/μl) 1μl 1μl Primer 2 (20pmol/μl) 1μl 1μl Enzyme 0.25μl 0.50μl Template DNA (10-50nm/ul) 1-3μl 1-3μl

27 Programa para PCR y Nested PCR LA-Taq DNA Polymerase P (AccuPrime-HF) 94 o C 1 min. 94 o C 2 min. 94 o C 30 seg, 94 o C 1 min. 50 o C 1 min. 55 o C 2 min. 68 o C 5 min. 72 o C 3 min. 35 ciclos (paso 2-4) 38 ciclos (pasos 2-4) 72 o C 10 min. 72 o C 7 min. 4 o C infinito 4 o C Infinito

28 Virus en palma africana African oil palm Ringspot Virus (Foevovirus) Chlorotic mottle RT-PCR Cebadores specificos AOPRV (Morales et al, 2009). Forw CCTTTGACTCTAGCCAAGA-3 Rev936 5 GCAAATGAAACTCTTCCC-3

29 Erwinia spp. Erwinia carotovora Erwinia amylovora

30 Prioridades Prioridad 1 Prioridades de Investigación Resumen 1. Determinar la presencia de Phytophthora en las zonas productoras de Palma en Ecuador. 2. Utilizar métodos moleculares para la detección de Phytophthora palmivora desde tejido sintomático. 3. Investigar las alternativas exitosas disponibles en otros países (fertilización, prácticas culturales, fungicidas, etc.) para el manejo de la enfermedad que se puedan validar y diseminar en Ecuador. 4. Implementar un plan de investigación a mediano plazo para la detección de otras enfermedades transmitidas por material vegetativo en Palma Africana.

31 Determinar la presencia de Phytophthora en palma africana en Ecuador Muestreo en San Lorenzo. Utilizar varios metodos de aislamiento de P. palmivora utilizando trampas. Muestreo de otros hospederos de P. palmivora. Estudiar posibles reservorios de P. palmivora. Determinar la sucesion de los patógenos asociados a la pudrición del cogollo. Estudiar la importancia de Erwinia en la pudrición del cogollo.

32 Utilizar métodos moleculares para la detección de Phytophthora palmivora desde tejido sintomático Determinar la presencia de P. palmivora desde el tejido afectado utilizando PCR Utilizar qpcr (PCR en tiempo real). Utilizar controles (+) de P. palmivora para las pruebas moleculares. Mejoramiento del vigor del sistema radicular. Estudiar el efecto de las prácticas de manejo de la palma y su influencia en la enfermedad.

33 Prioridades Prioridad Prioridades Regulatorias 2 Resumen 1. Establecer un sistema de producción de material de propagación certificado de palma africana. 2. Implementar regulaciones obligatorias para la producción de material de propagación de palma africana. 3. Establecimiento de un control fitosanitario para producción de palma africana. 4. Iniciar un programa colaborativo de cuarentena y certificación con responsabilidades compartidas entre las diferentes entidades y organizaciones públicas y privadas y los Productores de Palma. 5. Integrar las iniciativas y programas existentes o futuros para apoyar el cumplimiento de sus metas.

34 Referencias Broschat, T., Elliot M SP 360 Disorders and Diseases of Ornamental Palms. University of Florida. Drenth A., Wagels G., Smith B., Sendall B., Dwyer C., Irving G., Irwin J Development of a DNA-based method for detection and identification of Phytophthora species. Australasian Plant Pathology Society. Cho, J. H., Rupe, J. C., Cummings, M. S., and Gbur, E. E., Jr Isolation and identification of Fusarium solani f. sp. glycines from soil on modified Nash and Snyder s medium. Plant Dis. 85: