c-kit pharmdx Código K para uso en el Dako Autostainer Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro.

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1 c-kit pharmdx Código K para uso en el Dako Autostainer Uso previsto Para uso en diagnóstico in vitro. El ensayo c-kit pharmdx es un kit inmunohistoquímico (IHQ) cualitativo usado en el Dako Autostainer que se utiliza para identificar la expresión de proteínas c-kit/cd117 (proteína c-kit) en tejidos normales y neoplásicos fijados con formol e incluidos en parafina para su evaluación histológica. Los anticuerpos policlonales de conejo c-kit pharmdx detectan específicamente la proteína c-kit en células que expresan el antígeno CD117. El c-kit pharmdx está indicado como ayuda en el diagnóstico diferencial de tumores estromales gastrointestinales (GIST). Tras el diagnóstico de GIST, los resultados de c-kit pharmdx se pueden usar como ayuda para identificar a los pacientes con criterios para recibir tratamiento con Gleevec /Glivec (mesilato de imatinib). Los resultados de tinciones de hematoxilina y eosina (H&E) y un panel de anticuerpos pueden ayudar en el diagnóstico diferencial de GIST. La interpretación debe realizarla un patólogo cualificado dentro del contexto de la historia clínica del paciente, los controles adecuados y otras pruebas diagnósticas. Nota: Esta prueba no está diseñada como base única para diagnosticar los GIST, ni para seleccionar la terapia Gleevec/Glivec. El resultado de pacientes GIST negativos de c-kit tratados con Gleevec/Glivec no ha sido establecido. Un resultado negativo no excluye necesariamente el diagnóstico de GIST, ni debe excluir el tratamiento con Gleevec/Glivec. 1,2,3 Todos los sujetos de las pruebas clínicas con Novartis Gleevec/Glivec fueron seleccionados mediante un Protocolo de Pruebas Clínicas de Novartis (NCTP). El anticuerpo primario de anticuerpos policlonal de conejo anti-c-kit usado en el NCTP fue adquirido a Dako. El reactivo primario anticuerpo policlonal de c-kit pharmdx fue sometido al mismo método de producción, purificación y control de calidad que el reactivo policlonal anti-c-kit de NCTP. Resumen y explicación Introducción El protooncogén c-kit, también conocido como antígeno CD117 o receptor de factor de células madre, es un receptor transmembrana tirosinquinasa del tipo III de 145 kd. El gen c-kit codifica un receptor transmembrana tirosinquinasa estructuralmente similar a los receptores de factor de crecimiento A y B derivados de plaquetas, así como el receptor del factor estimulante de colonias 1, y se cree que juega un papel importante en la hematopoyesis, espermatogénesis y melanogénesis. La proteína c-kit contiene dominios extracelulares con 5 bucles parecidos a la Ig, un dominio transmembrana altamente hidrofóbico y un dominio intracelular con actividad tirosinquinasa dividida por un inserto de quinasa en una región ATP ligante y en un dominio de fosfotransferasa. La activación del receptor va acompañada por dimerización del receptor, fosforilación y autofosforilación de los sustratos, internalización del receptor, activación de las proteinquinasas y fosfolipasas, y transcripción de diferentes protooncógenos. 4 La vía del receptor tirosinquinasa c-kit ha demostrado ser importante para el crecimiento y progreso de tumores en diversos cánceres. 5 Las mutaciones del gen c-kit conducen a la fosforilación independiente del ligando (activación) del c-kit tirosinquinasa, y se cree que tienen un papel patógeno central en los tumores estromales gastrointestinales, por ejemplo. 6 Los tumores mesenquimales gastrointestinales han sido siempre difíciles de diferenciar y diagnosticar. En 2001, el mesilato de imatinib (Gleevec, Novartis, Basilea, Suiza) fue aprobado por la US Food and Drug Administration para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales (GIST). La aprobación se basó en un estudio clínico en el que adultos con GIST que expresaban proteína c-kit demostrada mediante inmunohistoquímica (Protocolo de Pruebas Clínicas Novartis), fueron reclutados y tratados con mesilato de imatinib. 7 Los casos con GIST se describen en tres categorías morfológicas: célula fusiforme, epitelioide y tipos mixtos. Independientemente de la morfología, la mayoría de los GIST expresan la proteína c-kit en una proporción significativa de células tumorales Debe tenerse en cuenta que un pequeño porcentaje de GIST no expresa la proteína c-kit. El número de otros tumores que puedan positivos a la proteína c-kit es relativamente pequeño. Estos incluyen el melanoma metastásico, angiosarcoma, sarcoma de Ewing, mastocitoma, seminoma y carcinoma pulmonar de célula pequeña. Los GIST normalmente son también positivos en caldesmon de alto peso molecular, a menudo positivos en CD34 (60-80%) y generalmente negativos en desmina y proteína S Especificidad Se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo anti-c-kit mediante inyección subcutánea de un péptido de 14 aminoácidos (aa) (posiciones del término C de la proteína c-kit) unido a la tiroglobulina. El antisuero específicamente purificado mediante cromatografía de afinidad AvidGel por unión al antígeno y tiol activado. ( ) ES_001 p. 1/15

2 Un pequeño número de sarcomas de tejido blando también han resultado ser positivos en la proteína c-kit. 6 Se analizaron algunas de estas muestras (por ej., leiomiosarcoma) para hallar la expresión c-kit. El estudio incluyó una comparación entre el ensayo c-kit pharmdx y el Protocolo de Pruebas Clínicas Novartis (NCTP), tal como se utiliza para la selección de pacientes para el tratamiento con Gleevec en las pruebas clínicas realizadas por Novartis. Dos de un total de veintiocho muestras analizadas resultaron positivas a la tinción. El resultado fue coincidente para los dos protocolos. Todas las inmunotinciones positivas se suprimieron después de la absorción del anticuerpo primario con un péptido sintético (16 aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína c-kit). Por lo tanto, el anticuerpo primario utilizado en el ensayo c-kit pharmdx reaccionó específicamente con la proteína c-kit en los dos sarcomas de tejido blando que resultaron positivos a la tinción. Estudios en cada laboratorio usando c-kit pharmdx demostraron la expresión de proteína c-kit en una variedad de células normales. Estas células incluyen las células ductales y mioepiteliales de mama, procesos de células de Purkinje, células de la lámina propia del colon, epitelio tubular del riñón, melanocitos y células mioepiteliales de la piel, células intersticiales de Cajal del intestino delgado, y mastocitos. La reactividad citoplásmica en granulocitos fue causada por la actividad peroxidasa endógena y resultó visible con el reactivo de control negativo. Reactivos El nº de catálogo K1907 es para tinción automática con el Dako Autostainer. Los materiales indicados son suficientes para 35 pruebas (35 portaobjetos de pacientes y 10 portaobjetos de control incubados con anticuerpo primario anti proteína c-kit y 35 portaobjetos incubados con el reactivo de control negativo correspondiente). El número de pruebas está basado en el uso del protocolo c-kit pharmdx Autostainer con los reactivos listos para usar. El kit contiene material suficiente para un máximo de 10 ciclos de tinción individuales. Material suministrado Cantidad Descripción 1x9 ml IgG policlonal de conejo c-kit pharmdx Anti IgG humana policlonal de conejo en un tampón Tris-HCl, que contiene proteína estabilizante y 0,015 mol/l de azida de sodio. 1x9 ml Reactivo de control negativo de IgG de conejo IgG policlonal de conejo en una concentración mayor o igual a la concentración positiva de anti-c kit en un tampón Tris-HCl, que contiene proteína estabilizante y 0,015 mol/l de azida de sodio. 2x5 portaobjetos Portaobjetos de control c-kit pharmdx Cada portaobjetos contiene cortes de dos líneas celulares ratón (+) y humano (-) en forma de sedimento, fijadas en formol e incluidas en parafina, que representan un nivel moderado de expresión de la proteína c-kit y ninguna expresión de c-kit. Las intensidades de tinción IHQ de los sedimentos celulares son 2+ y 0. Principio del procedimiento El kit IHQ c-kit pharmdx contiene anticuerpos policlonales y portaobjetos de control para realizar el procedimiento de tinción IHQ en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina. Tras la incubación con los anticuerpos policlonales primarios anti proteína c-kit humana, este kit se optimiza para su uso con un reactivo de visualización listo para usar basado en la tecnología del dextrano. Este reactivo está compuesto por moléculas de anticuerpo secundario de cabra anti conejo y moléculas de peroxidasa de rábano unidas a un esqueleto del polímero de dextrano común, eliminando así la necesidad de la aplicación secuencial de anticuerpo de enlace y conjugado de peroxidasa. La conversión enzimática del cromógeno añadido posteriormente produce la formación de un producto de la reacción visible en la zona del antígeno. La muestra puede contrateñirse y cubrirse con un cubreobjetos. Los resultados se interpretan con un microscopio óptico. Se suministran portaobjetos de control que contienen dos líneas de células humanas y de ratón incluidas en parafina, fijadas en formol, con una valoración de la intensidad de tinción de 2+ y 0 respectivamente para control de calidad de la eficacia del reactivo del kit. ( ) ES_001 p. 2/15

3 Material necesario pero no suministrado El protocolo IHQ c-kit pharmdx fue validado usando los siguientes reactivos de tinción de Dako: Wash Buffer (nº de catálogo S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (nº de catálogo S2003) Target Retrieval Solution (nº de catálogo S1699 ó S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (nº de catálogo K4002 y K4003) DAB+ (nº de catálogo K3467 ó K3468) Nota: Con el fin de asegurar resultados de tinción adecuados, sólo deberán usarse estos reactivos de tinción con el c-kit pharmdx. No se han validado desviaciones de este protocolo recomendado. Otros materiales necesarios para llevar a cabo el c-kit pharmdx incluyen: Hematoxilina, alcohólica o basada en agua como Hematoxylin de Dako (nº de catálogo S3301 o S3302) Cubreobjetos Baño de agua, correctamente calibrada y capaz de mantener una temperatura de 95-99º C u olla a presión, correctamente calibrada y capaz de calentar hasta 125º C Agua destilada o desionizada (agua de grado reactivo) Horno de secado, capaz de mantener una temperatura de C Etanol, puro y al 95% Microscopio óptico (objetivo de 4x-40x aumentos) Medio de montaje, como Faramount de Dako (nº de catálogo S3025) o Glycergel de Dako (nº de catálogo C0563) o Ultramount de Dako (nº de catálogo S1964) Tejidos positivo y negativo para utilizar como controles del proceso (véase "Control de calidad ) Portaobjetos, SuperFrost Plus de Fisher, portaobjetos recubiertos de poli-l-lisina, portaobjetos cargados o Silanized Slides de Dako (nº de catálogo S3003) (véase Preparación de las muestras ) Baños o recipientes de tinción Cronómetro (capaz de medir intervalos de 2-30 minutos) Xileno, tolueno o sustitutos de xileno Pipeta de 1 ml Dako Autostainer Universal Staining System (nº de catálogo S3400) o Autostainer Plus (nº de catálogo S3800) con software Dako Autostainer versión o superior. (Consulte la Guía del usuario del Dako Autostainer para ver los componentes necesarios). Nota: Todos los reactivos incluidos o comercializados por separado, como Wash Buffer de Dako (nº de catálogo S3006), están formulados específicamente para utilizarse con esta prueba. Para realizar la prueba según lo especificado, no puede hacerse ninguna sustitución. Precauciones 1. Para usuarios profesionales. Para uso en diagnóstico in vitro. 2. Este producto contiene azida de sodio (NaN 3), un compuesto químico que es altamente tóxico en su forma pura. Aunque a las concentraciones del producto no está clasificado como peligroso, las acumulaciones de NaN 3 pueden reaccionar con cañerías de plomo y cobre formando azidas metálicas altamente explosivas. Después de desecharlo, deje correr abundante cantidad de agua para evitar acumulaciones de azida en las cañerías. 3. Al igual que con cualquier producto derivado de fuentes biológicas, deberán aplicarse procedimientos adecuados al manejar los reactivos y las muestras. 4. El uso de tiempos de incubación, temperaturas o métodos diferentes a los especificados puede producir resultados erróneos. 5. No intercambie anticuerpos primarios o reactivos de control negativo con otros de lotes de fabricación diferentes (los números de lote aparecen en las etiquetas de los viales), ni con reactivos de otros fabricantes. Esto puede producir resultados erróneos. 6. Los reactivos del kit están diluidos de forma óptima para su uso con los reactivos recomendados. No se recomienda una dilución mayor, ya que puede provocar la pérdida de tinción del antígeno. El usuario deberá verificar cualquiera de dichos cambios. 7. Utilice el equipo de protección personal adecuado para evitar el contacto con los ojos y la piel. 8. La solución que no se utilice deberá desecharse de acuerdo a las normativas locales, estatales o federales. 9. Puede solicitar la hoja de datos de seguridad que se encuentra disponible para usuarios profesionales. Declaraciones de riesgos y seguridad Cromógeno DAB* R 40 Evidencia limitada de efecto carcinógeno. R43 Puede causar sensibilización por contacto con la piel. R68 Posibles riesgos de efectos irreversibles. S35 Este material y su envase deben desecharse de forma segura. S 36/37 Llevar ropa y guantes protectores adecuados. Como regla principal, ninguna persona menor 18 años puede trabajar con este producto. Los usuarios deben ser meticulosamente instruidos en el correcto procedimiento de trabajo, las propiedades peligrosas del producto y las instrucciones de seguridad necesarias. (*Cromógeno DAB es un material necesario pero no incluido en este kit). ( ) ES_001 p. 3/15

4 Almacenamiento Almacene el kit c-kit pharmdx entre 2 y 8º C. Los portaobjetos de control también deben almacenarse entre 2 y 8º C. No utilice el kit después de la fecha de caducidad impresa en la parte externa del envase. No hay signos obvios que indiquen la inestabilidad de este producto, por lo que los controles positivo y negativo deben ejecutarse simultáneamente con las muestras de pacientes. Si los reactivos se almacenan bajo condiciones diferentes a las especificadas en el prospecto del envase, dichas condiciones deben ser validadas por el usuario. 13 Declaración de calidad Preparación de las muestras La calidad de los reactivos del kit c-kit pharmdx ha sido controlada mediante inmunohistoquímica bajo las condiciones siguientes: recuperación diana en olla a presión Pascal pressure cooker (nº S2800) programada durante 30 segundos a 125 C, enfriada a 90 C, seg uido de EnVision+ Rabbit, HRP system. Las muestras de biopsia deben manipularse de forma que se conserve el tejido para su tinción IHQ. Deben utilizarse los métodos habituales de procesamiento del tejido para todas las muestras. 14 Cortes incluidos en parafina Está indicado el uso de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina. Otros fijadores no han sido validados y pueden producir resultados erróneos. Las muestras de la biopsia deben colocarse en bloques de un espesor de 3 o 4 mm y fijarse durante el período correspondiente al fijador. A continuación, los tejidos son deshidratados y secados en una serie de alcoholes y xileno, seguido por infiltración mediante parafina fundida. La temperatura de la parafina no debe superar los 60 C. Los bloqu es de tejido incluidos y fijados adecuadamente que expresen la proteína c-kit se podrán mantener indefinidamente antes de cortarse y montarse en portaobjetos si se conservan en un lugar fresco (15 25 C). 14,15 Las muestras de tejido deben cortarse en secciones de 3 5 µm. Después de realizar el corte, los tejidos deben montarse en un SuperFrost Plus de Fisher, un Silanized de Dako (nº de catálogo S3003), portaobjetos cargados o portaobjetos recubiertos con poli-l-lisina y deben colocarse en rejillas de secado. Las rejillas de portaobjetos deben sacudirse suavemente en una toalla absorbente para eliminar el agua atrapada debajo de la parafina y el cristal, después deben secarse a temperatura ambiente durante una hora, secándolos durante una hora más en un incubador a 50 60º C. Cualquier resto de agua en los portaobjetos después de su eliminación con el incubador, debe eliminarse sacudiendo los portaobjetos en una toalla y secándolos durante una hora más en el incubador. Después de sacar los portaobjetos del incubador, deben mantenerse a temperatura ambiente hasta que se enfríen y la parafina se haya endurecido. Para conservar la antigenicidad, los cortes de tejido, montados en portaobjetos, deben teñirse dentro de un período de 2 meses tras ser cortados si se mantienen a temperatura ambiente (20 25 C). Consulte el Dako H andbook: Immunochemical Staining Methods 16 o las referencias 14 y 15 para obtener más detalles sobre la preparación de las muestras. El uso de tejidos descalcificados no ha sido validado, por lo que no puede recomendarse. Los portaobjetos necesarios para la evaluación de c-kit y verificación de presencia de tumores deben prepararse al mismo tiempo. Debe prepararse un mínimo de 5 portaobjetos: 1 para la presencia de tumores, 2 para la evaluación de la proteína c-kit y 2 de reserva. Preparación de los reactivos Los siguientes reactivos deben prepararse antes de la tinción: Target Retrieval Solution (nº de catálogo S1699) Prepare una cantidad suficiente de Target Retrieval Solution diluyendo Target Retrieval Solution 10x en una proporción 1:10 con agua destilada o desionizada (agua de grado reactivo) para los pasos de lavado. Deseche la Target Retrieval Solution después de usarla. Nota: No es necesario realizar ninguna dilución al utilizar Target Retrieval Solution (nº de catálogo S1700). Wash Buffer Solution (nº de catálogo S3006) Prepare una cantidad suficiente de tampón de lavado diluyendo Wash Buffer 10x en una proporción 1:10 con agua destilada o desionizada (agua de grado reactivo) para los pasos de lavado. Almacene la solución no utilizada entre 2 y 8 C durante no más de 7 días. Deseche el tampón si está turbio. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (nº de catálogo K3467 o K3468) Esta solución debe mezclarse bien antes de usar. Cualquier precipitado que se desarrolle en la solución no afecta a la calidad de la tinción. Para preparar DAB+ Substrate-Chromogen Solution, añada 1 gota de Liquid DAB+ Chromogen a un ml de DAB+ Substrate Buffer y mézclelo. Deseche la solución no utilizada. El DAB+ preparado permanece estable durante aproximadamente 5 días cuando se almacena entre 2 y 8 C. Nota importante: El color del Liquid DAB+ Chromogen en el frasco puede variar de transparente a color marrón-lavanda claro. Esto no afectará a la eficacia de este producto. Diluya según las indicaciones anteriores. La adición de un exceso de Liquid DAB+ Chromogen al DAB+ Substrate Buffer causará el deterioro de la señal positiva. ( ) ES_001 p. 4/15

5 Medio de montaje Es recomendable un medio de montaje permanente, no acuoso, como Dako Ultramount (nº de catálogo S1964). También pueden utilizarse medios de montaje Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nº de catálogo S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (nº de catálogo C0563) para el montaje acuoso. Licúe Glycergel calentándolo a aproximadamente 40 (±5) C antes de usar. Procedimiento de tinción en el Dako Autostainer Notas sobre el procedimiento El usuario debe leer atentamente estas instrucciones y familiarizarse con todos los componentes antes de utilizarlos (véase Precauciones ). Consulte Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide. Todos los reactivos deben equilibrarse a temperatura ambiente (20 25 C) antes de la inmunotinción. As imismo, todas las incubaciones deben realizarse a temperatura ambiente. No deje que los cortes de tejido se sequen durante el procedimiento de tinción. Los cortes de tejido secos pueden presentar un aumento de tinción inespecífica. Nota: Los reactivos y las instrucciones suministradas con este sistema se han diseñado para obtener resultados óptimos al usarse con los reactivos y materiales recomendados. Una mayor dilución de los reactivos o la modificación de los tiempos de incubación o de las temperaturas pueden producir resultados erróneos o incoherentes. Desparafinización y rehidratación Antes de la tinción, los portaobjetos de tejido deben desparafinarse para eliminar el medio de inclusión y volverse a hidratar. Trate de no dejar restos de parafina. El medio residual de inclusión producirá un aumento de la tinción inespecífica. PASO 1. Coloque los portaobjetos en un baño con xileno e incube durante 5 (±1) minutos. Cambie los baños y repita el paso una vez. PASO 2. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol puro durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez. PASO 3. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en etanol al 95% durante 3 (±1) minutos. Cambie los baños y repita una vez. PASO 4. Elimine el exceso de líquido y coloque los portaobjetos en agua de grado reactivo durante 5 (±1) minutos. Comience el procedimiento de tinción con Target Retrieval. Las soluciones de xileno y alcohol deben cambiarse después de 40 portaobjetos. En lugar de xileno, pueden utilizarse sustitutos del tolueno y del xileno, como Histoclear. Recuperación diana Procedimiento recomendado: Baño de agua PASO 1. Llene recipientes de tinción, por ejemplo, recipientes de Coplin, con la Target Retrieval Solution diluida (véase Preparación de los reactivos ). Coloque los recipientes de tinción con la Target Retrieval Solution en un baño de agua. Caliente el baño de agua y la Target Retrieval Solution hasta 95 99º C (No debe hervir). Tape los recipientes para estabilizar la temperatura y evitar la evaporación. PASO 2. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Target Retrieval Solution precalentada de los recipientes de tinción. Caliente nuevamente el baño de agua y la Target Retrieval Solution a C. Incube durante 20 (±1) minutos a C. PASO 3. Retire el recipiente completo con los portaobjetos del baño de agua. Deje enfriar los portaobjetos en la Target Retrieval Solution durante 20 (±1) minutos a temperatura ambiente. PASO 4. Trasvase la Target Retrieval Solution y enjuague los cortes en tampón de lavado (véase Preparación de los reactivos ). PASO 5. Para un rendimiento óptimo, sumerja los cortes en Wash Buffer durante 5 (±1) minutos después de la solución de recuperación diana y antes de la tinción. Recuperación diana Olla a presión (30 segundos a 125º C) Es muy importante ser coherente con el protocolo de recuperación diana para asegurar la reproducibilidad de los resultados de tinción. La olla a presión utilizada debe ser capaz de alcanzar y mantener 125 C y cada ciclo en la olla debe inclui r el mismo volumen total de líquido (Target Retrieval Solution y agua en el platillo de la olla a presión), asi como el mismo número total de portaobjetos. El protocolo óptimo es como sigue: PASO 1. Por cada ciclo, añada el mismo volumen de agua de grado reactivo al platillo de la olla a presión (500 ml o según se indique en las instrucciones del fabricante). PASO 2. Rellene los dos recipientes plásticos de tinción tolerantes al calor en los que quepa una rejilla de 24-portaobjetos con 250 ml con Target Retrieval Solution (véase "Preparación de los reactivos"). ( ) ES_001 p. 5/15

6 PASO 3. Sumerja los cortes desparafinados a temperatura ambiente en la Target Retrieval Solution de los recipientes de tinción. Nota: Para mantener la coherencia, debe colocar en la olla a presión 48 portaobjetos en cada ciclo, colocando portaobjetos vacíos para completar las rejillas de portaobjetos en caso de que haya menos de 48 muestras para procesar; si se van a procesar 24 portaobjetos o menos, puede llenar el segundo contenedor con 250 ml de agua para conservar la Target Retrieval Solution. PASO 4. Coloque los recipientes de tinción en la olla a presión y cierre herméticamente. PASO 5. Ponga la olla a presión a 125 C; incube l os portaobjetos a 125 C durante 30 segundos. Deje enfriar la olla a presión durante 30 minutos sin liberar la presión antes de abrir. PASO 6. Antes de abrir la olla a presión, asegúrese de que no tenga presión. Saque los recipientes de tinción, trasvase la Target Retrieval Solution y enjuague los cortes de Wash Buffer o del agua de grado reactivo. PASO 7. Sumerja los cortes en Wash Buffer durante 5 (±1) minutos después de la solución de recuperación diana antes de la tinción. Nota: La Target Retrieval Solution está diseñada exclusivamente para aplicación de uso único. No reutilizar. Protocolo de tinción automática Consulte Dako Autostainer, Universal Staining System, User Guide. PASO 1. Seleccione el protocolo y programe el ciclo de tinción (Figura 1). PASO 2. Utilice programas automáticos para configurar el programa e inicie el programa de c-kit pharmdx. PASO 3. Coloque el reactivo en viales en la rejilla de reactivo Dako Autostainer de acuerdo con el mapa de reactivos generado por el ordenador. PASO 4. Cargue los portaobjetos en el Dako Autostainer de acuerdo con el mapa de portaobjetos generado por el ordenador. PASO 5. Inicie el ciclo. PASO 6. Retire los portaobjetos del Dako Autostainer. Recoja los residuos de la solución de DAB+ Substrate-Chromogen Solution en un recipiente para materiales peligrosos para su correcta eliminación. Proceda con la contratinción y el montaje. Nota: Aclare los portaobjetos en agua de grado reactivo después del paso en la solución DAB+ Substrate- Chromogen. (El equipo Dako Autostainer, versiones 02 y 03, lava los portaobjetos en agua de grado reactivo después del paso con sustrato-cromógeno. La versión 01 del equipo Dako Autostainer lava los portaobjetos en tampón. Por lo tanto, los portaobjetos que se tiñen en la versión de hardware 01 de Dako Autostainer deben lavarse con agua de grado reactivo después de sacarlos del Autostainer.) Figura 1. Tabla para programación del Autostainer Representación del ciclo de programa en el Dako Autostainer. La tabla de programación (arriba) es una plantilla del protocolo maestro de pharmdx que contiene los elementos del protocolo necesarios para ejecutar el kit c-kit pharmdx. En esta tabla de ejemplo sólo se muestran los reactivos c-kit. Contratinción (instrucciones para Hematoxylin) El producto final coloreado de la reacción de tinción es insoluble en alcohol y en agua. Puede usarse hematoxilina alcohólica o de base acuosa, tal como Hematoxylin de Dako (nº de catálogo S3301, automático, o S3302, manual). No utilice contratinciones regresivas. PASO 1. Retire los portaobjetos del Dako Autostainer y realice la contratinción en hematoxilina como se describe a continuación. PASO 2. Sumerja los portaobjetos en un baño de hematoxilina. Incube durante 2 5 minutos, en función de la concentración de hematoxilina utilizada. PASO 3. Enjuague suavemente en un baño con agua de grado reactivo. Asegúrese de que se han eliminado todos los restos de hematoxilina. Opcional: Sumerja los portaobjetos 10 veces en un baño de agua amoniacal 0,037 mol/l, si bien no es necesario (véase Preparación de los reactivos ). ( ) ES_001 p. 6/15

7 Nota: Se recomienda encarecidamente el uso de Dako s Hematoxylin (nº de catálogo S3301). Después de un período de incubación de 3 minutos, esta contratinción genera un producto final azul o púrpura claro que no oscurece la inmunotinción específica. Una contratinción fuerte puede enmascarar la expresión débil de la proteína c-kit. PASO 4. Aclare suavemente en un baño con agua de grado reactivo durante 2 5 minutos. Montaje Es recomendable un medio de montaje permanente, no acuoso, como Dako Ultramount (nº de catálogo S1964). También pueden utilizarse medios de montaje Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nº de catálogo S3025) o Dako Glycergel Mounting Medium (nº de catálogo C0563) para el montaje acuoso. Licue Glycergel calentándolo a aproximadamente 40 (±5) C antes de usar. Nota: Es recomendable leer los portaobjetos en las seis semanas posteriores a la tinción. No obstante, puede producirse alguna decoloración en función de diferentes factores como, pero sin limitarse a, contratinción, materiales de montaje y métodos y condiciones de almacenamiento. Para minimizar la decoloración, almacene los portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente (20 25 C). Control de calidad Las desviaciones de los procedimientos recomendados para la fijación, inclusión y procesamiento del tejido en el laboratorio del usuario pueden producir una variabilidad importante de los resultados, necesitándose un uso regular de los controles en cada laboratorio además de los portaobjetos de control suministrados por Dako. En EE.UU., consulte las pautas de control de calidad del College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (Programa de Certificación para Inmunohistoquímica del Colegio de Patólogos Estadounidenses (CAP)). Véase también la directriz CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline 17 (Control de calidad del CLIS para las directrices aprobadas para inmunohistoquímica) y las referencias 18-21, para obtener información adicional. Portaobjetos de control c-kit pharmdx (suministrados) Cada uno de los portaobjetos de control suministrados contiene dos líneas celulares ratón (+) y humano (-) incluidas en parafina, fijadas en formol con valoraciones de intensidad de tinción de 2+ y 0. En cada procedimiento de tinción debe teñirse un portaobjetos. La evaluación de las líneas de células del portaobjetos de control suministradas por Dako indican la validez del ciclo de tinción. No deben utilizarse como ayuda para interpretar resultados de pacientes. Tejidos de control positivo Los controles deben ser muestras frescas de autopsia/biopsia/quirúrgicas fijadas, procesadas e incluidas tan pronto como sea posible de la misma manera que la muestra o las muestras del paciente. Los controles positivos de tejido indican tejidos preparados correctamente y técnicas de tinción adecuadas. Debe incluirse un control positivo de tejido por cada conjunto de condiciones de prueba en cada ciclo de tinción. Los tejidos utilizados para los controles positivos de tejido deben dar una débil tinción positiva de forma que puedan detectarse cambios sutiles en la sensibilidad del anticuerpo primario. Los portaobjetos de control suministrados con este sistema o las muestras procesadas de forma diferente de las muestras del paciente sólo validan la eficacia del reactivo y no verifican la preparación del tejido. Los controles positivos de tejido conocidos deben utilizarse sólo para monitorizar el correcto funcionamiento de los tejidos procesados y los reactivos de la prueba, NO como ayuda para formular un diagnóstico específico de las muestras del paciente. Si los controles positivos de tejido no pueden demostrar una tinción positiva apropiada, los resultados de las muestras de la prueba deben considerarse como no válidos. Los tipos de células normales que pueden usarse como control positivo débil de c-kit incluyen melanocitos epidérmicos basales y células mioepiteliales glandulares de la piel, así como células epiteliales y mioepiteliales mamarias. Se pueden usar células neuronales (células intersticiales de Cajal) y mastocitos del intestino como controles fuertes internos. Tejidos de control negativo Utilice un tejido de control negativo (que se sepa que es negativo para la proteína c-kit) fijado, procesado e incluido de manera similar a la muestra o muestras del paciente con cada proceso de tinción, para verificar la especificidad del anticuerpo primario y proporcionar un índice de la tinción específica de fondo. La variedad de los diferentes tipos de células presentes en la mayoría de los cortes de tejido presentan zonas de control negativo interno (esto debe ser verificado por el usuario). Si se produce tinción específica en el tejido de control negativo, los resultados de las muestras del paciente deben considerarse no válidos. Entre los elementos de tejido que pueden utilizarse como control negativo, se incluyen los miocitos cardiacos. Las células acinares pancreáticas son también negativas para c-kit, mientras que el epitelio pancreático de la vesícula biliar tiñe positivamente. Reactivo de control negativo no específico Use el Reactivo de control negativo suministrado en lugar del anticuerpo primario con un corte de cada muestra del paciente, para evaluar la tinción inespecífica y permitir una mejor interpretación de la tinción específica en la zona del antígeno. El período de incubación del Reactivo de control negativo debe corresponderse con el del anticuerpo primario. 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8 Si se utilizan paneles de anticuerpos en cortes de tejido en serie, las zonas de tinción negativa de un portaobjetos pueden servir como controles de fondo de unión negativo/inespecífico para otros antisueros. Verificación del ensayo Antes del uso inicial de un sistema de anticuerpos o de tinción en un procedimiento diagnóstico, el usuario debe verificar la especificidad del anticuerpo, probándolo en una serie de tejidos propios del centro con características de resultados IHQ conocidas que representen tejidos positivos y negativos conocidos. Consulte los procedimientos de control de calidad indicados anteriormente en esta sección del prospecto del producto y los requisitos de control de calidad del programa de certificación del CAP para inmunohistoquímica y/o la directriz NCCLS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline 17 (Seguro de calidad del CLIS para inmunohistoquímica, pautas aprobadas). Estos procedimientos de control de calidad deben repetirse para cada nuevo lote de anticuerpo, o toda vez que ocurra un cambio en los parámetros del ensayo. Los tumores estromales gastrointestinales (GIST) con intensidades de tinción conocidas para la proteína c-kit y los tejidos negativos son adecuados para realizar la verificación del ensayo. Tabla 1: Propósito del control de calidad diario Tejido: Fijado y procesado como la muestra del paciente Portaobjetos de control suministrado por Dako. Control positivo: Tejido o células que contienen el antígeno diana que se va a detectar (podría encontrarse en el tejido del paciente). El control ideal es un tejido con una tinción positiva débil para que sea más sensible al anticuerpo o a la degradación del antígeno. Control negativo: Tejidos o células que se espera que presenten resultados negativos (podrían encontrarse en el tejido del paciente o en el tejido de control positivo). Anticuerpo específico y sistema de detección Controla el procedimiento de tinción solamente. (La evaluación de las líneas de células del portaobjetos de control suministradas por Dako indican la validez del ciclo de tinción). Controla todos los pasos del análisis. Valida los reactivos y los procedimientos utilizados para la tinción de proteína c-kit. Detección de reactividad cruzada no deseada del anticuerpo con componentes celulares o células. Fondo: Anticuerpo no específico (Rabbit Negative Control Reagent) suministrado Detección de tinción de fondo inespecífica. Detección de tinción de fondo inespecífica. Tejido del paciente. Detección de tinción específica. Detección de tinción de fondo inespecífica. Interpretación del procedimiento de tinción La evaluación de los portaobjetos debe ser realizada por un patólogo, con un microscopio óptico. Todas las evaluaciones tienen que realizarse en la región del tumor de la muestra. Un objetivo de 10X o 20X aumentos es apropiado para evaluar e interpretar la tinción inmunohistoquímica. Utilice células intactas para interpretar los resultados de la tinción. Las células necróticas o degeneradas a menudo se tiñen de forma inespecífica. 17 En cada kit c-kit pharmdx se incluyen líneas celulares positivas y negativas de tinción para validar el rendimiento del ensayo. La tinción adecuada de los portaobjetos de control suministrados indica que el reactivo c-kit pharmdx funciona correctamente. Ninguna tinción de la línea de células de control HT-29 (0) y una tinción de color marrón moderada citoplasmática o perinuclear en la línea de células de control P815 (2+) indican que la tinción es válida. La desviación de la intensidad de la tinción óptima de la línea de células de control positivo (demasiado débil o demasiado fuerte), podría producir un resultado negativo falso o positivo falso y la prueba deberá repetirse. Debe evaluarse el tejido de control positivo. La tinción débil de las células mioepiteliales de la piel indica que los reactivos están funcionando adecuadamente. Si los controles de tejido positivo no pueden demostrar una tinción positiva, los resultados de las muestras de la prueba deben considerarse como no válidos. El control de tejido negativo debe ser examinado tras el control de tejido positivo para verificar la especificidad del marcado del antígeno por el anticuerpo primario. La ausencia de tinción específica en el control de tejido negativo confirma la falta de reactividad cruzada del anticuerpo frente a las células/componentes celulares. Si se produce tinción específica en el control de tejido negativo, los resultados de las muestras del paciente deben considerarse no válidos. Las tinciones inespecíficas, si ocurren, tienen en general un aspecto difuso. Se puede observar además tinción aislada de tejido conectivo en cortes provenientes de tejidos fijados con exceso de ( ) ES_001 p. 8/15

9 formol. Utilice células intactas para interpretar los resultados de la tinción. Las células necróticas o degeneradas a menudo se tiñen de manera inespecífica. 18 Examine en último lugar las muestras de paciente. La intensidad de tinción positiva debe ser evaluada dentro del contexto de cualquier tinción de fondo inespecífica del control de reactivo negativo. La interpretación de la expresión de la proteína c-kit debe realizarse dentro del contexto morfológico y clínico general del tumor. Existen tres categorías morfológicas del GIST: célula fusiforme (70%), epitelioide (20%), o tipos mixtos. 22 Independientemente de la morfología, la mayoría de los GIST expresan proteína c-kit en una proporción significativa de células tumorales. La inmunotinción homogénea con c-kit pharmdx se observa principalmente en el citoplasma, con o sin un patrón de Golgi/perinuclear (punteado), y en las membranas celulares, con una tinción circunferencial que puede ser completa o no. Algunos casos muestran un patrón de tinción heterogéneo (una mezcla de tinción fuerte o débil y/o membranosa). También se ha observado tinción en los espacios extracelulares. Los resultados de la prueba c-kit pharmdx deben informarse como positivos o negativos, utilizando la tinción citoplasmática y de la membrana como la estructura evaluable (Tabla 2). El resultado positivo para la expresión de proteína c-kit se define como toda tinción específica citoplasmática y/o de membrana en las células tumorales. Una positividad focal o tinción en menos del 10% de las células tumorales debería ser interpretada con precaución. 23 Como en cualquier prueba de inmunocitoquímica, un resultado negativo significa que no se detectó el antígeno, y no que éste no existiera en las células/tejidos analizados. Debe tenerse en cuenta que un pequeño porcentaje de GIST no expresa proteína c-kit. Por lo tanto, la ausencia de tinción para proteína c-kit no excluye el diagnóstico de GIST. Tabla 2: Resultados de la tinción con c-kit pharmdx Informe al médico tratante Proteína c-kit negativo Proteína c-kit positivo Definición Ausencia de tinción de las células tumorales. La tinción positiva se define como cualquier tinción IHQ del citoplasma y/o membranas de las células tumorales, por encima del nivel del fondo. Intensidad de la tinción: 1+, 2+, o 3+ Si fuera necesario, utilice un panel de anticuerpos para ayudarse en la identificación de reacciones negativas falsas. Si la tinción es focalmente positiva, debería considerarse la ejecución de otras pruebas para confirmar el diagnóstico de GIST. Las pruebas genéricas y los patrones de tinción especificados en la Tabla 3 le ayudarán a diferenciar entre GIST y otros sarcomas mesenquimales. Consulte las secciones Resumen y explicación y Limitaciones y características de resultados para obtener información específica sobre la inmunorreactividad. Tabla 3. Esquema immunohistoquímico para el diagnóstico diferencial de tumores de célula fusiforme en el tracto gastrointestinal. 5 c-kit CD34 SMA Actina de músculo S-100 Desmina liso GIST 95% 60-70% 30-40% 5% 2% Tumor de músculo liso % + Raro + Schwannoma - Habitual Fibromatosis Discutido* Raro + - Raro * La mayoría, pero no todos los autores, informan de que las fibromatosis son negativas para c-kit. Según el período de la incubación y la potencia de la hematoxilina utilizada, la contratinción puede producir una coloración de los núcleos de las células que va de azul claro a azul oscuro. Una contratinción excesiva puede comprometer la interpretación de los resultados. Limitaciones Limitaciones generales IHQ es un proceso de diagnóstico de múltiples pasos que requiere una formación especializada en la selección de los reactivos apropiados; selección, fijación y procesamiento del tejido; preparación del portaobjetos de IHQ e interpretación de los resultados de la tinción. La tinción del tejido depende de la manipulación y del procesamiento del mismo antes de la tinción. Los procedimientos incorrectos de fijación, congelación, descongelación, lavado, secado, calentamiento, corte o contaminación con otros tejidos o fluidos, pueden producir artefactos, el atrapamiento de anticuerpos o resultados negativos falsos. Los resultados incoherentes pueden deberse a variaciones en los métodos de fijación e inclusión, o a irregularidades inherentes al tejido. La interpretación clínica de cualquier tinción positiva, o la ausencia de la misma, debe ser evaluada en el contexto de la presentación clínica, la morfología y otros criterios histopatológicos. La interpretación clínica de cualquier tinción, o la ausencia de la misma, deberá ser complementada con estudios morfológicos y controles adecuados, además de otras pruebas de diagnóstico. Un patólogo cualificado y familiarizado con los anticuerpos, reactivos y métodos utilizados es quien debe interpretar la preparación teñida. La tinción debe ser ( ) ES_001 p. 9/15

10 realizada por un laboratorio autorizado certificado, bajo la supervisión de un patólogo responsable de revisar los portaobjetos teñidos y que se asegure de la idoneidad de los controles positivo y negativo. Este producto no está destinado a citometría de flujo. No se han determinado las características de resultado para citometría de flujo. Los tejidos de personas infectadas con el virus de la hepatitis B y que contienen el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), pueden mostrar tinción inespecífica con la peroxidasa de rábano. 24 Los reactivos pueden mostrar reacciones inesperadas en tejidos no analizados previamente. No puede descartarse completamente la posibilidad de reacciones inesperadas, incluso en grupos de tejidos analizados previamente, debido a la variabilidad biológica de la expresión del antígeno en neoplasmas u otros tejidos patológicos. 17 En caso de obtener resultados inesperados, póngase en contacto con el servicio de asistencia técnica de Dako. Limitaciones del producto Un pequeño porcentaje de GIST no expresa proteína c-kit. Por lo tanto, la ausencia de tinción para c-kit no excluye el diagnóstico de GIST. Pueden observarse resultados positivos falsos debido a la unión no inmunológica de proteínas o productos de reacción del sustrato. También pueden producirse por la actividad de la pseudoperoxidasa (eritrocitos) y la actividad de la peroxidasa endógena (citocromo C). 19 Para obtener resultados óptimos y reproducibles, la proteína c-kit requiere recuperación diana cuando los tejidos se fijan de manera estándar (formol tamponado neutro) y se incluyen en parafina. Dako recomienda el uso de of c-kit pharmdx en un Dako Autostainer o un Autostainer Plus. El uso de c-kit pharmdx en otras plataformas automatizadas no ha sido validado, y pueden producir resultados erróneos. Las líneas celulares de control de tinción deben usarse sólo para la validación del ciclo de tinción. No deben usarse para evaluar la reacción de tinción en cortes de tejido. Las muestras conservadas mediante el procesamiento habitual en formol tamponado neutro son adecuadas para las pruebas con c-kit pharmdx. No se han validado los tejidos fijados con fijadores alternativos. Características de resultados Especificidad Se ha evaluado la reactividad del reactivo del anticuerpo de c-kit contra líneas celulares que expresan la proteína c-kit. En transferencias de Western de un lisado de la línea celular SY de carcinoma pulmonar de célula pequeña que expresa gran cantidad de ARNm de c-kit, el anticuerpo marcó una banda de 145 kd correspondiente a la proteína c-kit. La banda marcada es bastante ancha, de 120 a 155 kd. También se marca una banda adicional de 100 kd. 25 Además, con la aplicación de un segundo anticuerpo anti c-kit, se marcó, igualmente una proteína 100 kd. Esta marca desapareció cuando el reactivo del anticuerpo fue incubado con el antígeno peptídico de c-kit sintético usado para la inmunización. 26 En estudios adicionales, se realizó una prueba en el reactivo del anticuerpo c-kit transferencias Western para la reactividad cruzada con proteínas que comparten una homología estructural, como el receptor de factor de crecimiento A y B derivados de plaquetas (PDGFRa), el receptor del factor estimulante de colonias (c-fms) y la tirosinquinasa de tipo FMS 3 (FLT-3). No se observó reactividad cruzada con estas proteínas homólogas. Además, en las transferencias de Western el reactivo del anticuerpo de Dako no reaccionó con un lisado de la línea celular HS de adenocarcinoma que no expresa la proteína c-kit. 25 Estudios de comparación Se realizó inmunotinción utilizando el ensayo c-kit pharmdx en sarcomas fijados con formol e incluidos en parafina y series de múltiples tejidos (MTA) que contenían una selección de sarcomas que incluían expresión positiva y negativa de proteína c-kit. Los tejidos se analizaron usando el ensayo c-kit pharmdx después de usar dos métodos de recuperación del epítopo inducida por calor (HIER) recomendados. Brevemente, se utilizaron como fuente de calor un baño de agua (95 99º C) durante 20 minutos y olla a presión (121º C) durante 5 minutos de calentamiento, ambos seguidos por 20 minutos de enfriamiento. Los demás pasos del procedimiento de tinción fueron idénticos. Estos ensayos fueron comparados con una simulación de ciclo simultáneo del Protocolo de Pruebas Clínicas Novartis (NCTP), que se ha usado previamente para seleccionar pacientes para el ensayo clínico que obtuvo la aprobación de la FDA para el uso de Gleevec/Glivec con los pacientes con GIST diagnosticado. El NCTP utilizó una concentración dos veces superior del anticuerpo Dako primary polyclonal para c-kit (A4502) (el mismo reactivo usado en c-kit pharmdx) y sin HIER. Los resultados obtenidos de la comparación simultánea del NCTP y del ensayo c-kit pharmdx utilizando una olla a presión como fuente de calor se detallan en la tabla 4, y se observaron resultados similares (coincidencia general =98,7%) cuando se utilizó un baño de agua como fuente de calor. El porcentaje de coincidencias positivas y negativas fue similar en ambas comparaciones. ( ) ES_001 p. 10/15

11 Tabla 4. Tabla 2x2 del protocolo c-kit pharmdx con resultados de pruebas con olla a presión comparados con el resultado de las pruebas del NCTP Resultado TR de la prueba con olla a presión para c-kit pharmdx Resultado del ensayo del NCTP simultáneo Positivo Negativo Total n (%) n (%) Positivo 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Negativo 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Total Porcentaje de coincidencia positiva = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (95% CI exacto: 97,1% - 100%) Porcentaje de coincidencia negativa = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (95% CI exacto: 92,9% - 99,5%) Coincidencia general= ( )/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (95% CI exacto: 96,7% - 99,7%) Un subgrupo de estas muestras (35 casos) correspondía a tejidos de pacientes que participaban en la prueba clínica Novartis Gleevec. De estos pacientes, 21 fueron tratados con Gleevec (58,3%). Cuando se volvieron a analizar las mismas muestras con el NCTP simulado y c-kit pharmdx, se halló que 20 resultaron positivas con los tres procedimientos, mientras que 1 muestra resultó negativa. Entre los 147 pacientes tratados con Gleevec, en la prueba clínica de Novartis Gleevec se informó que el 54% obtuvo una respuesta parcial y en el 28% la enfermedad se mantuvo estable. 7 Para un subconjunto de 259 muestras, presentadas en la Tabla 4, el resultado de la prueba c-kit fue determinado en el momento en el que las muestras se colocaron en las MTA. 35 de los casos fueron reclutados en las pruebas clínicas de Gleevec (n=35), y el resto se analizaron en los mismos laboratorios que habían participado en las pruebas de Gleevec. Los resultados de 179 muestras (el total fue inferior a 259 debido a la pérdida de muestras o a la ausencia de tumores en las MTA) se presentan en la Tabla 5, a continuación. Estas muestras demostraron una coincidencia general con la situación original de c-kit de 94,9% (95% CI exacto: 90,7% - 97,7%). Tabla 5. Tabla 2x2 de resultados de la prueba con olla a presión comparados con el resultado de la prueba original Situación original de c-kit tisular Resultado de la prueba con olla a presión Positivo n Negativo n ( ) ES_001 p. 11/15 Total n (%) Positivo (78%) Negativo (22%) Total Porcentaje de coincidencia positiva = 136 / (136+6); = 0,957 x 100 = 95,7% (95% CI exacto: 91,0% - 98,4%) Porcentaje de coincidencia negativa=34/ (34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (95% CI exacto: 78,1% - 98,3%) Coincidencia general= (136+34)/ (179); = 0,949 x 100 = 94,9% (95% CI exacto: 90,7% - 97,7%) Reproducibilidad Reproducibilidad interensayo (tinción manual) La reproducibilidad interensayo fue analizada manualmente en tres laboratorios, por dos técnicos en cada uno, durante 3 días con 5 muestras diferentes (4 positivas, 1 negativa en cada laboratorio). En los 30 tejidos analizados, la intensidad de tinción no varió más de +/- un grado de intensidad con las siguientes excepciones: En los puntos 1 y 3, un portaobjetos (cada uno) varió dos grados de intensidad. Esto era resultado de la disociación del tejido en el punto 1. Se observo una excelente reproducibilidad (100%) en los resultados positivos frente a los negativos. La reproducibilidad interlaboratorio (tinción manual y automática usando el Dako Autostainer) La tinción inmunohistoquímica de 30 muestras aleatorias y enmascaradas de varios niveles de expresión de c-kit (10 negativos y 20 positivos) se realizó en tres laboratorios separados geográficamente. Se enviaron portaobjetos con cortes a cada laboratorio para su tinción manual y automática, y su posterior evaluación por un patólogo. En dos puntos, la determinación positivo/negativo de la expresión de proteína c-kit fue perfecta (100%) dentro y entre laboratorios, tanto con los procedimientos de prueba manual como automático. En el punto 2, se encontró que los portaobjetos duplicados de dos tejidos, designados antes del estudio como negativos, eran en realidad positivos. Los análisis de seguimiento revelaron que una pequeña área (aproximadamente un 20% de las células tumorales) se tiñó positivamente. Esta sección del tumor no fue observada en las muestras analizadas en los otros laboratorios. Reproducibilidad intraensayo (tinción manual) En cada uno de los puntos del estudio, se incluyeron 5 portaobjetos de la misma muestra positiva incluida en el conjunto de 30 muestras teñidas manualmente. Se valoró la intensidad de la tinción y el porcentaje de tinción del tumor. El resultado del tejido permaneció positivo en todos los puntos del estudio, y la intensidad de la tinción permaneció dentro de una variación de grado de intensidad de +/- 1.

12 Inmunorreactividad En la tabla 6 se presenta un resumen de la inmunorreactividad del ensayo c-kit pharmdx en el panel recomendado de tejidos normales. Todos los tejidos estaban incluidos en parafina y fijados con formol. Se utilizaron las instrucciones proporcionadas y los reactivos recomendados en el prospecto de este envase para realizar 30 pruebas de tejido normal en el DAKO Autostainer Tabla 6: Evaluación de tinción de tejido normal mediante c-kit pharmdx * Tipo de tejido (Nº analizado) Patrón de tinción Suprarrenal (3) Médula ósea (3) Mama (3) Encéfalo, cerebelo (3) Encéfalo/cerebrum (3) Cuello uterino (3) Colon (3) Esófago (3) Corazón (3) Riñón (3) Hígado (3) Pulmón (3) Células mesoteliales (3) Ovario (3) Páncreas (3) Paratiroides (3) Nervio periférico (3) Pituitaria (3) Próstata (3) Glándula salival (3) Músculo esquelético (3) Piel (3) Intestino delgado (3) Bazo (3) Estómago (3) Testículo (3) Timo (3) Tiroides (3) Amígdala (3) Útero (3) Mastocitos raros (2+): citoplasma Células epiteliales (3+): membrana y citoplasma Células mioepiteliales: (1+): citoplasma Procesos de células de Purkinje (1+): citoplasma Mastocitos submucosos (2+): y lámina propia (2+) citoplasma Mastocitos submucosos (2+): citoplasma Epitelio tubular (2+): citoplasma Mastocitos y macrófagos (2+): citoplasma Células ductales epiteliales raras grandes (3+): Mastocitos (2+): citoplasma Mastocitos de tejido blando (2+): citoplasma Mastocitos (2+): citoplasma Melanocitos epidérmicos basales (1+): citoplasma Células mioepiteliales glandulares (1+): citoplasma Células neuronales (1+): citoplasma Mastocitos (2+): citoplasma Mastocitos (2+): citoplasma Mastocitos en lámina propia (2+): citoplasma *La mayoría de los tejidos analizados dieron una tinción positiva de fibroblastos en tejido del estroma (1+, fibroso) así como de mastocitos y macrófagos. Ocasionalmente, se observó la tinción de eosinófilos inducida por la peroxidasa endógena. Estudios en cada laboratorio usando c-kit pharmdx demostraron la expresión de proteína c-kit en una variedad de células normales. Estas células incluyen las células ductales y mioepiteliales de mama, procesos de células de Purkinje, células de la lámina propia del colon, epitelio tubular del riñón, melanocitos y células mioepiteliales de la piel, células intersticiales de Cajal del intestino delgado, y mastocitos. La reactividad citoplásmica en granulocitos fue causada por la actividad peroxidasa endógena, y resultó visible con el reactivo de control negativo. ( ) ES_001 p. 12/15

13 Solución de problemas Tabla 7: Solución de problemas Problema Causa probable Solución sugerida 1. Los portaobjetos no se tiñen. 2. Los portaobjetos se tiñen débilmente. 3. Tinción excesiva de fondo de los portaobjetos. 4. El tejido se desprende de los portaobjetos. 5. Tinción específica excesivamente intensa. 6. Tinción débil de la línea celular del portaobjetos de control 2+. 1a. Error de programación. Los reactivos no se han usado en el orden correcto. 1b. Los viales de reactivos no estaban cargados en las posiciones correctas en las gradillas. 1c. No hay suficiente reactivo en el vial. 1d. Hay azida de sodio en el baño de tampón de lavado. 2a. Tiempos de incubación de reactivos inadecuados. 2b. Se utilizó un método de fijación inapropiado. 2c. Recuperación diana inadecuada con Target Retrieval Solution. 3a. No se eliminó completamente la parafina. 3b. Se utilizaron aditivos con almidón para montar los cortes en los portaobjetos. 3c. No se enjuagaron bien los portaobjetos. 3d. Los cortes se secaron durante el procedimiento de tinción. 3e. Los portaobjetos se secaron durante la carga en el Autostainer. 3f. Unión inespecífica de los reactivos al corte de tejido. 4a. Se utilizaron los portaobjetos incorrectos. 5a. Se utilizó un método de fijación inapropiado. 5b. Tiempo de incubación del reactivo demasiado largo. 5c. Se utilizó un tampón de lavado inadecuado. 6a. Recuperación diana inadecuada. 6b. Tiempos de incubación de reactivos inadecuados. 1a. Revise la programación para asegurarse de que la tinción fue programada correctamente. 1b. Compruebe el mapa de reactivos para asegurarse de la ubicación correcta de los viales de reactivos. 1c. Asegúrese de que los viales tengan suficiente reactivo antes de empezar el proceso. Consulte los volúmenes necesarios en el mapa de reactivos. 1d. Utilice un tampón de lavado nuevo, libre de azida. 2a. Revise las instrucciones del procedimiento de tinción. 2b. Asegúrese de que el tejido del paciente no esté excesivamente fijado y que se está utilizando un fijador aprobado. 2c. Verifique que el baño de agua o la olla a presión funcionan adecuadamente y que el procedimiento de recuperación diana se realizó correctamente. (las temperaturas bajas y/o un tiempo inadecuado pueden provocar una tinción débil). 3a. Utilice soluciones limpiadoras nuevas y siga el procedimiento indicado en la sección Desparafinación y rehidratación. 3b. Evite utilizar aditivos para adherir los cortes a los portaobjetos de vidrio. Muchos de ellos son inmunorreactivos. 3c. Asegúrese de cebar bien el Autostainer antes del proceso. Asegúrese de que haya suficiente solución tampón para todo el proceso. Puede añadir solución de lavado adicional después del paso de visualización, si es necesario. 3d. Asegúrese de aplicar el volumen correcto de reactivo a los portaobjetos. Asegúrese de utilizar el Autostainer con la tapa cerrada, y que no esté expuesto a fuentes de calor excesivo ni a corrientes de aire. 3e. Asegúrese de que los portaobjetos permanezcan húmedos durante la carga, y antes de empezar el proceso. 3f. Compruebe que se ha fijado bien la muestra y/o la presencia de necrosis. 4a. Utilice portaobjetos cargados (SuperFrost Plus) o silanizados como Silanized Slides de Dako (nº de catálogo S3003). 5a. Asegúrese de utilizar sólo fijadores y métodos de fijación aprobados. 5b. Revise las instrucciones del procedimiento de tinción. 5c. Utilice sólo el tampón de lavado que se recomienda usar con el kit. 6a. Verifique que el procedimiento de recuperación diana se realizó correctamente. 6b. Asegúrese de programar los tiempos de incubación exactos. ( ) ES_001 p. 13/15

14 6c. Degradación del portaobjetos de control. 6c. Compruebe la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento del kit impresas en la etiqueta del envase. Nota: Consulte también la sección Solución de problemas en el manual de Dako: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition 16, the Atlas of Immunohistology 21, o Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 En caso de obtener tinciones inesperadas, póngase en contacto con el servicio de asistencia técnica de Dako. Referencias 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: , Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c-kit mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: , Medeiros, F., Codess. 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